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FUNDAMENTOS DE LA INMUNOHISTOQUIMICA

ALUMNA: CANDY RONCALLA CABANA

En las ltimas dcadas la utilizacin de la Inmunohistoqumica ha sido progresivamente creciente y se ha consolidado como tecnologa esencial en el diagnstico patolgico de rutina. En general y muy especialmente en patologa oncolgica, son cada vez ms las patologas cuyo diagnstico y clasificacin requiere la Inmunohistoqumica. La incorporacin de nuevos protocolos de recuperacin antignica y la afluencia constante de nuevos anticuerpos estn ampliando notablemente el mbito de aplicacin con nuevas utilidades en diagnstico y pronstico.

IMPORTANCIA DE LA INMUNOHISTOQUMICA
Como tcnica de laboratorio la Inmunohistoqumica es de vital importancia para el marcaje selectivo de protenas y otros elementos que pueden estar presentes, tanto en las membranas celulares, citoplasma, y dems compartimientos citoplsmicos, as como tambin en la matriz extracelular. Es de gran utilidad en la identificacin de las estirpes celulares de los tejidos bsicos, de receptores de membranas, protenas citoslicas, y de cualquier otra estructura para la cual se halla desarrollado un anticuerpo especfico. Su aplicacin es de indiscutible valor en anatoma patolgica en el diagnstico de lesiones tumorales y su pronstico y en la investigavin en general, sobre todo en la definicin del inmunofenotipo de las clulas de los tejidos.

FUNDAMENTO:
La tcnica de Inmunohistoqumica se fundamenta en la reaccin Antgeno - Anticuerpo. La tcnica se basa en aplicar al tejido o muestra en estudio, el antcuerpo contra el antgeno que se desea detectar, Posteriormente este anticuerpo especifico es a su vez usado como antgeno y marcado con un segundo anticuerpo inespecfico, que se halla unido a un sistema molecular que puede ser detectado mediante una tcnica de coloracin, En este momento, el examen microscpico del corte histolgico o del extendido citolgico nos permite determinar la presencia o ausencia del antgeno que buscbamos, y en caso positivo podemos ver en qu lugar exacto del tejido o de las clulas se encuentra alojado.

REPRESENTACIN GRFICA SENCILLA DE UNA MOLCULA DE ANTICUERPO

ANTICUERPOS MONOCLONALES Y ANTICUERPOS POLICLONALES Los anticuerpos monoclonales son producidos por un clon indiccidual de plasmocitos, mientras que los anticuerpos policlonales son producidos por diferentes plasmocitos y en consecuencia pueden reaccionar con varios fragmentos del antgeno para el que fueron creados. El animal ms utilizado para la produccin de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la cabra, oveja, caballo, entre otros. Para los anticuerpos monoclonales, el animal de eleccin es el ratn, tal vez por motivos econmicos.

DIFERENCIAS ENTRE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES. EN LA FIGURA A SE REPRESENTA ESQUEMTICAMENTE LOS DIFERENTES SITIOS DE UNIN DE LOS ANTICUERPOS POLICLONALES. EN EL PANEL B SE ESQUEMATIZA LA ESPECIFICIDAD DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES.

MTODOS:
MTODO DIRECTO: un marcador visual, ya sea fluorescente o enzimtico, se adhiere qumicamente al anticuerpo primario. El anticuerpo primario es el anticuerpo dirigido contra el antigenoque se quiere demostrar. MTODO INDIRECTO: el marcador visual est unido al anticuerpo secundario. El tejido es expuesto previamente al anticuerpo primario que no es marcado y luego al anticuerpo secundario, el cual es dirigido contra el anticuerpo primario y se unir con l

MTODO DE LA PEROXIDASAANTIPEROXIDASA
Este mtodo usa un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario y un anticuerpo producido en contra, conjugado con la enzima peroxidasa (complejo PAP). El anticuerpo secundario es producido en una especie animal diferente del anticuerpo primario y del complejo peroxidasaantiperoxidasa y el anticuerpo primario y el complejo peroxidasa-antiperoxidasa provienen de la misma especie animal. Consecuentemente, el anticuerpo secundario actua como puente o anticuerpo eslabon.

MTODO EL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA


Esta tcnica usa tres reactivos; un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario que esta qumicamente ligado a la vitamina biotina, y un complejo de la glicoprotena avidina que esta ligado a la biotina y peroxidasa. La avidina tiene la habilidad de ligarse con cutro molculas de biotina, en forma no inmunolgica. Esta fuerte afinidad le da al mtodo exelente sensibilidad.

LA FLUORESCENCIA
Es una forma de luminiscencia entendindose sta ltima como la emisin de la luz que se produce a partir de una fuente de energa no trmica y bajo el efecto de una excitacin. La fluorescencia primaria o autofluorescencia es aquella que presenta determinadas sustancias de forma espontnea sin necesidad de ser modificadas; por ejemplo la lmina elstica de las arterias muestra autofluorescencia en determinadas condiciones). En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la fluorescencia, llamndola fluorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tincin histoqumica con sustancias fluorescentes llamadas fluorocromos o uniendo fluorocromos a antgenos dirigidos a anticuerpos tisulares.

FLUOROCROMOS.
Son sustancias qumicas que tienen la propiedad de absorber fotones de alta energa procedente de la radiacin ultravioleta o del espectro visible. Ello provoca una redistribucin de los electrones de las molculas fluorescentes, puesta de manifiesto por la emisin de una radiacin luminosa de longitud de onda distinta aunque dentro del espectro visible.

Los fluorocromos ms utilizados en las tcnicas de inmunofluorescencia son: Fluorescena: absorbe luz azul y emite fluorescencia verde manzana. Rodamina: absorbe luz verde y emite fluorescencia roja anaranjada.

Los fluorocromos pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar la capacidad de estos ltimos para unirse a sus correspondientes antgenos, por ello las fluorocromos ligados a anticuerpos especficos constituyen un medio til de visualizar los lugares donde reproduce la reaccin Antgeno Anticuerpo.

ANTICUERPOS ESPECFICOS PARA LA DETERMINACIN DE LAS DIFERENTES PATOLOGAS, DE DIVERSAS REAS


1. LINFOMAS Diagnstico de tipo de linfoma, linaje B o T, factores pronsticos, determinacin de CD20 para terapias TARGET. CD3 CYCLIN D1 CD5 BCL2 CD8 BCL6 CD10 KI67 CD15 CD56 CD20 TdT CD22 CD30 CD23 DBA44 CD43

2. TUMORES DE ORIGEN DESCONOCIDO

Diagnstico certero o aproximado de origen de metstasis de tumor oculto, en hgado, pulmn, piel, hueso, ganglio, etc. CK7 S100 CK20 WT1 CD45 PSA VIM AE1/AE3 CEA BERP4 TTF1 EMA CA19.9 GFAP GCDFP15 CEA CK 34BE12 NSE CHR A TIROGLOBULINA MELAN A CALRETININA SYN

3. CANCER DE MAMA

Es muy importante la determinacin del estatus hormonal del tumor para su tratamiento con identificacin de receptores de Estrgeno, Progesterona. As tambin el HER2 como factor pronstico y tratamiento que actan especialmente sobre las clulas positivas con este marcador. El Ki67 es determinado recientemente para estratificar los tumores de acuerdo al factor de proliferacin. ER PR HER2 KI 67 P53

4. NEOPLASIAS MALIGNAS INDIFERENCIADAS

Diagnstico de origen linfoide, sarcomatoso, melanoctico o epitelial. CD45 CK34BE12 MELAN A VIM

5. MESOTELIOMA
Permite diferenciar origen mesotelial de adenocarcinoma metasttico en mesotelio, pleura, pericardio, peritoneo. CALRETININA CK7 WT1 BEREP4 CEA

6. TIPIFICACIN DE TUMORES GERMINALES

Diagnstico de distintas lneas de diferenciacin en tumores germinales de ovario y testculo PLAP AFP HCG CD30 VIM

7. SARCOMAS (TUMORES DE PARTES BLANDAS)

Permite diagnstico de origen, Ej. msculo liso, estriado, neural, GIST, vasculares, etc. VIM ASMA MYOD1 S100 CD117 CD34 CD31 CD68 DESMINA

8. DIFERENCIACION NEUROENDCRINA

Diagnstico de tumores neuroendcrinos y su estratificacin de acuerdo a su malignidad NSE CROMOGRANINA A SYNAPTOFISINA

9. MEDULA SEA

Diagnstico de infiltraciones por linfomas, metstasis, leucemias CD138 AE1/AE3 MIELOPEROXIDASA CD34

10. CLULAS PLASMTICA

Determinacin de Mielomas/Plasmocitomas. Monoclonalidad CD138 KAPPA LAMBDA

11. CLULAS REDONDAS Y AZULES EN NIOS

Son tumores que morfolgicamente pueden ser idnticos pero que perteneces a distintas lneas celulares de origen, por lo que el tratamiento es muy distinto entre ellos, por lo que la IHQ permite su diagnstico. CD45 NSE S100 CK AE1/AE3 CD99 WT1 MYOD1

12. TUMORES DE PIEL

Permite subclasificar especialmente los tumores de clulas fusadas drmicas, como el Dermatofibroma Protuberans clsicamente positivo para CD34, o diferenciar un melanoma fusocelular de otro tumor fusado MELAN A CD34 S100 ASMA CD68 CK7 CK34BE12 BERP4

13. CLASIFICACIN DE TUMORES RENALES

Existen tumores renales con caractersticas oncocticas de diferentes pronsticos segn su tipo histolgico en los cuales la IHQ resulta de mucha utilidad. As como tumores con diferenciacin sarcomatoide, de distinto origen tubular, urotelial, etc. VIM AE1/AE3 CD10 CK7 CK34BE12

GRACIAS.