ASOCIACIN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

CURSO DE BIOQUMICA Y NUTRICION

GUIA DE PRACTICAS

Dr. Carlos Ramrez Velasco Dr. Jos Chuquipiondo Ludea Dr. Jess Daz Franco Dr. Flix Tipacti Alvarado
LIMA PERU 2005

NORMAS DE SEGURIDAD Y BIOSEGURIDAD

Todo el personal que trabaje en un laboratorio de Bioqumica, Fisiolgico, Microbiolgico, Biolgico en general, o ingresa a l, debe seguir reglas de seguridad y bioseguridad. Las normas de seguridad son obligatorias y son esenciales no solamente para la para la acreditacin acadmica, sino porque consisten en practicas que otorgan seguridad y proteccin al personal, alumnos e investigadores que trabajan en los laboratorios bioqumicos, fisiolgicos, bacteriolgicos, biolgicos, qumicos, etc. Muy especialmente en el campo mdico donde trabajamos con muestras material biolgico que es considerado potencialmente infeccioso o infeccioso. La mxima seguridad y proteccin es necesaria en estos casos. PRACTICAS GENERALES Se prohbe fumar, comer y aplicarse cosmticos, para evitar la diseminacin de agentes infecciosos o productos qumicos txicos de las manos hacia la boca. Con el fin de evitar el contacto con agentes infecciosos o diseminarlos, debe utilizarse alguna prenda protectora sobre la ropa, como el guardapolvo, mandil, la bata de laboratorio. Estas prendas de proteccin externa no deben usarse fuera del laboratorio. Los zapatos han de ser de punta y taln cerrado. No es conveniente que las personas que trabajan en el laboratorio usen lentes de contacto debido al desprendimiento de vapores y a las salpicaduras que pueden producirse. Los lentes de contacto inhiben el lagrimeo y permiten que las sustancias permanezcan ms tiempo en la crnea. Se recomienda el uso de lentes de proteccin o protectores para la cara a las personas que usan lentes de contacto, en particular si hay alto riesgo de vapores, aerosoles o salpicaduras. La joyera de tipo colgante, el cabello largo y barba son riesgosos, ya que es posible que entren en contacto con muestras u otras superficies, o se enreden o queden atrapados en instrumentos con movimiento, como mquinas rotatorias o centrfugas . Se prohbe estrictamente pipetear con la boca todo tipo de muestra, reactivo, agua o cualquier otra sustancia biolgica. LAVADO DE MANOS El lavado de manos es una de las principales maneras de evitar la diseminacin de agentes infecciosos. Aunque se utilicen guantes, el lavado de manos es necesario. porque es posible que stos tengan huecos microscpicos. Al tratar con pacientes, es necesario lavarse las manos tras atender a cada uno de ellos aunque se utilicen guantes.

LIMPIEZA No debe permitirse que la basura, los desperdicios biolgicos, infecciosos, y el material de

vidrio sucio se acumulen en grandes cantidades en el laboratorio. Los recipientes con muestras de desecho y agentes etiolgicos deben taparse cuando no se estn empleando. Es necesario limpiar con frecuencia las superficies de trabajo con algn desinfectante al comenzar y terminar cada turno. El personal de laboratorio fisiolgico es responsable de mantener el rea de trabajo limpia y sanitaria, aunque haya servicio de limpieza adicional por parte de la institucin. ETIQUETAS Y SEALES Todos los recipientes que contienen productos qumicos deben etiquetarse con claridad, indicando el nombre del producto y cualquier precaucin para su manejo. Las reas en que se almacenan productos inflamables, peligrosos o txicos y carcingenos, o en las cuales se utilizan, deben estar marcadas claramente. Las reas en que se almacenan o analizan sangre o lquidos corporales deben estar marcadas claramente con el signo de riesgo biolgico. DESECHO DE DESPERDICIOS Existen normas de la OSHA con respecto al desecho de productos biolgicos. El desecho de materiales biolgicos, como desperdicios infecciosos, se examina y regula en la actualidad por leyes especficas del Ministerio de Salud Pblica. AGUJAS Y OBJETOS PUNTIAGUDOS Las agujas y otros objetos puntiagudos constituyen un riesgo fsico y de infeccin potencial para el personal de laboratorio fisiolgico.. Todas las agujas desechables y dems objetos punzantes deben colocarse en un recipiente resistente a la perforacin y a prueba de fugas, marcado con el smbolo de riesgo biolgico. Estos recipientes se descartan, siguiendo las polticas de la institucin, cuando estn llenos hasta la mitad o las tres cuartas partes. La mayora de las instituciones incineran los recipientes que contienen objetos punzantes.Inmediatamente despus de usada una aguja deber incinerarse y para ello existen en la actualidad equipos especiales incineradores de agujas llamados destructores de agujas. Nunca deber volverse a colocar la tapa de las agujas a menos que se utilice algn dispositivo como pinzas, diseadas para este fin, para evitar la puncin cutnea accidental. Las agujas nunca deben cortarse, ya que esto puede provocar salpicaduras de sangre o de otros lquidos al medio.

SEGURIDAD CONTRA INCENDIOS TIPOS DE INCENDIOS En el laboratorio Bioqumico Fisiolgico u otros laboratorios biolgicos se requieren lquidos inflamables y combustibles para ciertos procedimientos y en ellos tambin existe el riesgo potencial de incendios elctricos y de basura. El cientfico del laboratorio debe comprender estos peligros y la manera de afrontarlos en caso de urgencia. Los incendios se

clasifican de la clase A hasta la D. Los incendios de clase A ocurren con combustibles ordinarios, como madera o papel; los de la clase B ocurren con lquidos inflamables; en los de la clase C participan circuitos elctricos energetizados, sin importar el combustible, y los de la clase D, son producidos por metales combustibles como el sodio. Para cada tipo de incendio se requiere un extinguidor diferente y adecuado, con el fin de controlar de manera eficiente el fuego y evitar que se ste se extienda. EXTINGUIDORES Los EXTINGUIDORES contra incendios contienen diferentes sustancias y estn marcados segn el tipo de incendio para el que deben emplearse. Los extinguidores clase A estn llenos de agua y nunca deben utilizarse para incendios de tipo elctrico, ya que el agua puede conducir la electricidad de regreso a la persona que tiene el extintor en las manos. Los extinguidores clase B contienen productos qumicos secos, espuma acuosa que forma una capa (AFFF) o dixido de carbono. Los extinguidores clase C estn llenos de dixido de carbono o Halon; los de la clase D de un polvo seco especial que contiene un enlazante termoplstico que permite que el agente forme una corteza slida al calentarse. Hay extinguidotes que pueden emplearse para incendios de clases A a C. Contienen un polvo seco y pueden utilizarse con eficacia y seguridad para las tres clases de incendios. Generalmente este tipo de extinguidores es el que se compra para uso en el hogar o en las oficinas. Sin embargo, si se emplea para incendios de equipo elctrico en el laboratorio, es probable que sea difcil o imposible eliminar posteriormente dicho polvo de los instrumentos. Por tanto, se recomiendan los extinguidores de dixido de carbono o Halon para incendios de equipo elctrico. CAUSAS Y PREVENCION Las causas fundamentales de incendios en el laboratorio son descuido, falta de conocimiento acerca de los productos qumicos que se utilizan, permitir que se efecten procedimientos sin la vigilancia adecuada, sobrecarga de circuitos y llamas de gas abiertas. Es necesario impartir peridicamente conferencias para instruccin sobre seguridad en el trabajo, con el fin de recordar a los empleados la manera segura de proceder para evitar incendios y otros tipos de accidentes as como refrescarles buen el uso del extinguidor. En caso de que se produzca un incendio es necesario ponerse en contacto con el departamento de bomberos o solicitar ayuda antes de intentar extinguirlo, Se pierde tiempo vaso cuando se trata de apagar el incendio primero, se ve e es imposible y despus se solicita ayuda. Los pasos que deben seguirse en caso de incendio son: 1. Rescatar a cualquier persona que se encuentre en peligro. 2. Aislar el incendio cerrando alguna puerta. 3. Solicitar ayuda. 4. Intentar extinguido. 5. Evacuar las instalaciones en caso de que no se pueda apagar el fuego. Por supuesto, cuando hay varias personas presentes, estos pasos pueden llevarse a cabo de

manera simultnea en un esfuerzo conjunto. Es necesario adiestrar al personal de laboratorio en el uso de los extintores centra incendios. En general, el departamento de incendios de la localidad o el comit de seguridad de la institucin proporciona este entrenamiento.Revisar con frecuencia la fecha de expiracin de los extinguidotes y renovarlos. SEGURIDAD QUIMICA HOJA DE DATOS SOBRE SEGURIDAD DE MATERIALES En agosto de 1987 la OSHA enmend la norma Federal Hazard Communication Standard -29CFR 1919.1200 (Right to Know/HCS Standard), hacindola extensiva a todas las industrias, incluyendo las instalaciones para el cuidado de la salud. Esta norma establece que los responsables de cada rea determinen si se utilizan productos qumicos peligrosos en el trabajo y proporcionen a los empleados hojas con datos de seguridad en el uso del material riresgoso y marquen adecuadamente los recipientes que contienen el producto, indicando el riesgo, y se mantendr una lista de productos qumicos peligrosos , es decir, un inventario de productos qumicos, y proporcionen al empleado informacin y entrenamiento, y desarrollen un programa de comunicacin de riesgos por escrito. . Informacin que contiene la hoja de datos de seguridad para cada material grupo de sustancias relacionadas ,de uso en Laboratorio fisiolgico y otros Laboratorios biolgicos: 1. Identificacin del producto qumico ( nombre qumico,y sinnimo y/o nombre vulgar.) 2. Ingredientes peligrosos 3. Datos fsicos 4. Datos de incendios y explosiones 5. Informacin de riesgos para la salud 6. Datos de reactividad 7. Procedimientos para derrames, fugas y desecho 8. Informacin de proteccin personal 9. Precauciones especiales y comentario SEGURIDAD BIOLOGICA PROTECCION PERSONAL La dispersin epidmica del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha revivido la preocupacin acerca de las enfermedades que se transmiten por la sangre entre las personas que trabajan en el laboratorio. Se sabe que las personas que laboran en los laboratorios mdicos en general, fisiolgicos, biolgicos y otros relacionados con la salud en general, conforman un grupo de alto riesgo para infecciones por virus de hepatitis B (RBV) relacionadas con el trabajo y virus de inmunodeficiencia humana (HIV). En 1987 los Centros para el Control de las Enfermedades Trasmisibles (CDC) de USA., publicaron recomendaciones para proteger a las personas que trabajan al cuidado de la salud y a otras de adquirir la infeccin por HIV y se actualizaron nuevamente en 1988. Entre las

recomendaciones se aconseja que "se tomen precauciones congruentes al manejar sangre y lquidos corporales de todos los pacientes y las muestras que se obtengan". Esto se conoce como precauciones universales. Las recomendaciones incluyen el uso de equipo para proteccin personal, como guardapolvos, mandiles, batas, guantes descartables y protectores para los ojos al manipular sangre y lquidos corporales en el laboratorio. La revisin de los CDC en 1988 recomend usar equipo de proteccin personal para manejar todas las sustancias biolgicas y animales. Deben tratarse todas las secreciones y excreciones corporales como potencialmente infecciosas, ya que hay otras enfermedades adems de HBV y HIV que se transmiten a travs de diversas sustancias del organismo y de los animales.. En 1991 la OSHA ( Occupational Safety and and Health Administration, de USA.) public una Norma final en relacin a la exposicin ocupacional a patgenos que se transmiten por la sangre (Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens). Esta regla indica que el patrn debe proporcionar equipo de proteccin personal que no permita que los materiales potencialmente infecciosos entren en contacto con la ropa, la piel, los ojos y la boca del trabajador en condiciones normales de uso. La regla tambin indica la manera correcta de disponer de objetos punzantes y otros desperdicios con riesgo biolgico y seala la necesidad de administrar la vacuna de HBV y el tratamiento tras alguna exposicin a todos los empleados que corran este riesgo. Adems de describir equipo de proteccin personal, dicha norma incluye instrucciones para el lavado de manos, transporte de muestras, uso de pipetas, forma de recoger derrames, desecho de desperdicios y descontaminacin del equipo. DERRAMES Es muy importante desarrollar y tener polticas escritas y procedimientos para instruir a los alumnos y a los empleados acerca de la manera de manejar derrames qumicos y biolgicos. Existen en el comercio estuches con insumos para ambos tipos de derrames.. Si no existen tales normas en la institucin, el laboratorio debe desarrollarlas con el fin de asegurar el ambiente de trabajo. Es necesario que las personas que limpian algn derrame biolgico utilicen guantes descartables y bata de laboratorio. Se colocan toallas desechables sobre el derrame y se echa desinfectante ( puede ser leja diluida al 10% sol de fenol al 3% sobre ellas. Tras dejarlo reposar 30 minutos, se recoge la sustancia y el desinfectante con material absorbente (los cojinetes absorbentes son tiles para derrames grandes). A continuacin se coloca el material contaminado en un recipiente para desechos biolgicos : bolsas de plstico resistente de color rojo .Despus de absorber la mayor parte de material, el rea se limpia con un desinfectante de fuerza intermedia o alta, por ejemplo, dilucin de Leja 1:10. La solucin desinfectante se absorbe con material desechable. El rea se enjuaga con agua y se seca para evitar que quede resbalosa. Es conveniente preparar un conjunto de utensilios para limpiar derrames con riesgo biolgico que contenga todos los materiales necesarios para efectuar la limpieza de este tipo y tenerlo a la mano en el laboratorio en que se manejan dichas muestras.

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO DURANTE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO

1. 2. 3. 4. 5.

6.

Realizar las prcticas de laboratorio con el debido inters y responsabilidad. Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y distintivo de la Universidad. Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros y cuadernos. Est terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio. Leer cuidadosamente la gua de prctica y tener en cuenta las indicaciones de los profesores de prctica sobre el uso del material y equipos de laboratorio, as como el orden, limpieza y seguridad que debe mantenerse. Por cada prctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentar un nico informe, el cual consta de las siguientes partes: - Cartula. - Objetivos. - Marco Terico. - Desarrollo Experimental. - Discusin de los resultados. - Conclusiones. - Cuestionario. - Bibliografa Dicho informe se presentar en la siguiente prctica en el horario y respectivo. El inicio de la prctica es en la hora exacta programada. Se tendr una tolerancia de 10 minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podr ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerar como una inasistencia y no tendr derecho a nota de informe de prcticas. Las inasistencias en las prcticas no son recuperables en ninguno de los grupos, calificndose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que acumule 30% de inasistencias no tiene derecho a nota prctica. Cada alumno ser integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecer a lo largo del semestre acadmico. Por cada mesa de trabajo, ser nombrado un responsable que se har cargo del material y equipos recibidos as como de la presentacin de los informes. En caso de dao, deterioro o prdida del material y/o equipos, el responsable de mesa informar del hecho al profesor de prcticas, TODO El GRUPO ES RESPONSABLE DEL DAO CAUSADO, y deber repararlo a la brevedad posible, no ms de una (01) semana despus del incidente. Al final de la prctica, se proceder a limpiar el material usado, con el fin de entregarlo en las mismas condiciones en las que fueron recibidos, caso contrario se le descontar un punto en la nota de informe a todo el grupo. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolver a la persona encargada del laboratorio. El laboratorio deber quedar completamente limpio, las mesas secas y limpias, debiendo arrojar todos los desechos al tacho de basura.

grupo 7.

8. 9. 10. 11.

12.

13. 14.

Practica No. 2 ESPECTROFOTOMETRIA

GENERALIDADES:

Se denomina Anlisis Espectrofotomtrico al conjunto de mtodos de anlisis cuantitativos que se fundamentan en la medicin de la intensidad de la luz transmitida a travs de una solucin coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se han hecho de tal calidad mediante reacciones qumicas adecuadas. Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solucin, una parte de la radiacin queda absorbida por las molculas del soluto coloreado, sufriendo una reduccin de su intensidad (Luz transmitida, It), proporcional a la capacidad de absorcin de dichas molculas. Io Luz incidente It Luz transmitida

Casi todas las sustancias en solucin tienen la capacidad de absorber en forma selectiva determinadas radiaciones luminosas unas mas que otras dejndolas pasar. La longitud de onda en la que las molculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina longitud de mxima absorcin o lambda mximo. Si consideramos que cada molcula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luz transmitida por una solucin disminuir en relacin con el aumento del nmero de molculas que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este nmero vara de acuerdo con la concentracin del soluto y el espesor del recipiente que contiene la solucin, estos factores estn considerados en la Ley de Lambert y Beer, que rige los principios de la colorimetra y cuyas formas de expresin son: Log (Io/It) = E I c = A = D.O. Donde: Io = Intensidad de la luz incidente. It = Intensidad de la luz transmitida. E = Coeficiente de extincin molar, valor constante dependiendo de la naturaleza de la sustancia y de la longitud de onda. I = Espesor del recipiente en cm. C = Concentracin de la solucin. A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la relacin entre ambas es logartmica.

CALCULO DE LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCION PROBLEMA: Para calcular la concentracin de una solucin problema con el empleo de un fotocolormetro, existen dos formas: - Mtodo de la curva standard o curva de calibracin. - Factor de calibracin. a) CURVA STANDARD.- Este mtodo consiste en utilizar varios standares de concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un grfico en un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abcisas (Eje X). En la recta obtenida (Funcin lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad ptica de la muestra problema, hallando la concentracin de la misma en el eje de las abcisas. FACTOR DE CALIBRACIN.- (Fc), El factor de calbracin es un trmino que se relaciona con la concentracin de una sustancia con su absorbancia, es decir la intensidad que absorbe una sustancia de concentracin conocida (Standard o Patrn).

b)

As tenemos: Fc = [ Standard ] / A

Donde: Fc = factor de calibracin. A = absorbancia del tubo standard. [ Standard ] = concentracin del standard. Con el factor de calibracin se puede fcilmente determinar la concentracin de una muestra desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia. Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera (diluciones) se podr usar directamente la siguiente frmula:

[ MP ] = A

mp

. Fc

Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrar el factor de dilucin (Fd) que es matemticamente la inversa de la dilucin (dil) y esta a su vez es: Dil = Vol / Vol

mp

Donde: Vol mp = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilucin. Vol t = Volumen total. Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentracin de una muestra problema se proceder usando la siguiente frmula: [ MP ] = A . Fc .

mp

Fd

Donde: A mp = Absorbancia de la muestra problema. Fc = Factor de calibracin. Fd = Factor de dilucin. [ MP ] = Concentracin de la muestra.

EXPERIMENTO
1. Preparar la siguiente batera de tubos: Bicromato de K Agua destilada Concentracin (mg %) Solucin stock: Bicromato de Potasio 40 mg%. Calcular la concentracin en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos. Tubo I 1 ml 9 ml Tubo II 2 ml 8 ml Tubo III 3 ml 7 ml Tubo IV 4 ml 6 ml

Leer las absorbancias de los cuatro tubos a 530 nm de longitud de onda () en el espectrofotmetro. 2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la grfica de absorbancia vs concentracin de bicromato de K . 3. Una vez obtenida la curva de calibracin, medir la absorbancia de la muestra problema que el profesor le har entrega. 4. Obtener el factor de calibracin (Fc) promedio con las soluciones standard utilizadas para construir las curvas de calibracin ajustadas. 5. Calcular la concentracin de la muestra problema por los siguientes mtodos: - Grficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibracin. - Analticamente, multiplicando su absorbancia por el factor de calibracin del standard.

1.Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotmetro. 2.Qu diferencias existen entre un fotocolormetro y un espectrofotmetro?. 3.Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus respectivas longitudes de ondas. 4.- Qu relacin matemtica existe entre Absorbancia y Transmitancia. 5.- Construya una curva de calibracin con los siguientes valores: Standard Standard Standard Standard Standard 1 2 3 4 5 Concentraci 5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dl n Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200 Con la curva obtenida hallar la concentracin de las siguientes muestras, sabiendo que sus absorbancias fueron: Muestra A........................0.015 Muestra B........................0.125 Muestra C........................0.350

CUESTIONARIO:

PRACTICA No 3
LOS AMINOCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS: SU CAPACIDAD AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO HUMANO
FUNDAMENTO BIOQUIMICO: Una propiedad importante de los aminocidos, consecuencia del hecho de que todos ellos tienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (NH2) es su conducto como electrolitos. Es costumbre considerar los grupos COOH como de naturaleza acdica y los grupos NH2 como de carcter bsico. Hemos estudiado en las clases tericas el comportamiento de los aminocidos como iones dipolares y la conducta de ellos durante su titulacin con cido y lcalis de modo que se comportan como verdaderas sustancias tampones, amortiguadores buffers, para el sostenimiento del pH del medio interno dentro de estrechos lmites (7.35 a 7.45). Explicamos tambin el comportamiento amortiguador del ion dipolar glicina al aadirle iones H+ o al aadirle OH- impidiendo las variaciones bruscas del pH sanguneo. La representacin de un aminocido tal como la glicina por la frmula NH2CH2COOH sugiere que se trata de una sustancia en la que el grupo amino acta como una base conjugada y el grupo COOH como un cido. Se ha observado, sin embargo, que esta formulacin no es la correcta del estado inico de un aminocido en solucin acuosa. La verdadera representacin es aquella que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente: (Estructura A)

Estructura (A)

H R C COONH3

H R C COOH Estructura (B) NH2

Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al pH fisiolgico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base conjugada, esto es, como Ion carboxilato R-COO-; y al mismo pH, la mayora de los grupos amnicos estn predominantemente en la forma protnica R-NH3+ La estructura (A) inica es la prevalente en la sangre y en la mayora de los tejidos. La estructura (B) no puede existir a ningn pH. La conveniencia nos ensea sin embargo que la estructura (B) se use por razones didcticas y para explicar la mayora de las ecuaciones que entraan reacciones distintas a las de los equilibrios protnicos. La contribucin ms importante a la conducta de una protena como electrolito procede de los grupos ionizables existentes en las cadenas laterales de los aminocidos. La curva de titulacin de una protena aminocido con cido lcali vendr determinada en gran medida por el nmero de cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas laterales de sus unidades de aminocidos. Por estas razones las soluciones de protenas tienen una poderosa capacidad tampn. Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas biolgicos y ha sido estudiada con especial cuidado con relacin a los amortiguadores de la sangre humana cuyo pH es controlado dentro de estrechos lmites, tal como les expliqu en la clase terica. Les dije que los valores de pH sanguneo varan dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45, cuando la sangre alcanza valores por debajo de 7.35 se produce acidosis; y cuando los valores de pH se elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros dos sistemas tampones que son: 1) El Sistema bicarbonato/Acido carbnico (pK: 6,1) 2) El sistema fosfato monosdico/disdico (pK:6,8) La protena ms importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que tiene gran capacidad tampn en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su elevado contenido de histidina (grupo imidazol) Aproximadamente el 60% de la capacidad tampn de la sangre total se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las protenas del plasma (seroalbminas y globulinas). Recordemos que segn lo propuesto por Bronsted: un cido es una sustancia que al ionizarse genera iones Hidrgeno, H+, una base es toda sustancia capaz de aceptar estos iones hidrgeno. Como los cidos ceden protones y las bases los captan, a cada cido le corresponde, como es lgico, una base conjugada. Es decir, si un cido cede un protn, el ion, as formado, puede captarlo de nuevo comportndose

como base. Por lo tanto, los procesos de cesin captura de protones transcurren de forma reversible: AH Acido Cesin de protones captacin de protones Abase + H+

El cido y la base conjugada forman un par cido/base. Las soluciones que contienen cidos dbiles y sus sales se llaman soluciones tampn, buffers amortiguadores. Su finalidad es impedir amortiguar las bruscas variaciones del pH. El pH de una solucin amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuacin de Henderson-Haselbach: pH = pK + log -----------ACIDO SAL

A partir de esta ecuacin se deduce que el pH de una disolucin tampn depende de la naturaleza del cido que la integra y de la proporcin entre la sal y el cido (logaritmo de la relacin entre ambos) y no de las concentraciones absolutas de cada uno de estos componentes. La eficacia amortiguadora es mxima cuando el cociente de la relacin sal/cido es prximo a la unidad. El objetivo de la presente prctica es demostrar la capacidad tampn de un sistema amortiguador empleando un cido dbil y la sal del cido dbil y estudiar la curva de titulacin valoracin de un cido dbil HA, como el cido actico (0.1N) y una base fuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a diferentes proporciones relativas entre la sal y el cido de una solucin tampn. (el pKa del cido actico es 4.76) antes de agregar la base, el pH se debe solamente a la presencia del cido. Pero tan pronto como se aade algo de la base (NaOH 0.1N), sta reacciona con una cantidad equivalente del cido y forma una cantidad equivalente de sal y agua. El cido dbil ms su sal disuelta constituyen una solucin tampn (par amortiguador), cuyo pH puede calcularse mediante el uso de la ecuacin de H-H: pH = pK log Sal/cido. Se determinar el pH con el potencimetro y se evaluarn los cambios en el pH con la adicin de volmenes definidos de una base conocida (NaOH 0.1N). Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los ml de base agregados y obtendremos as la curva de titulacin para el cido. Se emplear el equipo potencimetro para determinar el pH, instrumento que determina el pH en funcin de la fuerza electromotriz

(p de Nernst) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solucin problema y un electrodo de vidrio muy sensible a los hidrogeniones. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS: Potencimetro. Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo). Baguetas de vidrio (3 por cada mesa). Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa). Agua destilada. Solucin de CH3-COOH 0.1N. Solucin de NaOH 0.1N. Papel milimetrado cuadriculado. PARTE EXPERIMENTAL: Mezclar los volmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada sealados en la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de los 11 beakers con el potencimetro: Beaker N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Acido actico NaOH 0.1 N (ml) 0.1N (ml) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Agua destilada (ml) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 PH

En cada mesa los alumnos construirn su grfica de valoracin colocando en las ordenadas los valores de pH en orden creciente y en el eje de las abscisas los volmenes de sol. NaOH 0.1N aadidos en cada beaker.

pH

ml NaOH aadido CUESTIONARIO: 1.- Graficar la curva de valores del pH vs. NaOH 0.1N. 2.- Identificar el punto de semi-valoracin y mxima capacidad tampn. 3.- Explique que es un par tampn, como funciona y porqu las protenas sanguneas son amortiguadores. 4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del ser humano.

PRACTICA No 4
FACORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Los biocatalizadores especficos sintetizados por el organismo, llamados enzimas son protenas que intervienen en las reacciones biolgicas, acelerando la velocidad de reaccin hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente especficas en las reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados sustratos) sobre los que actan. La cintica enzimtica es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cintica proporcionan una herramienta bioqumica muy til para calcular la concentracin de una enzima en una muestra biolgica y comparar su actividad cataltica con la de otras enzimas. Adems, las mediciones cinticas permiten describir de manera cuantitativa los tipos de inhibicin enzimtica y el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima. La velocidad a la que procede una reaccin enzimtica est controlada en parte por las concentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que progresa la reaccin, aumenta la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin de los correspondientes sustratos, en tanto que la concentracin de la enzima no se altere. La actividad enzimtica puede expresarse: a) Por la desaparicin del sustrato (S). b) Por la aparicin de productos (P). c) Por modificacin de cofactores (C).

El mecanismo de reaccin enzima-sustrato puede simbolizarse as: [E] + [S] C C' [E] + [P]

Diversos factores modifican la actividad enzimtica, tales como: 1) Concentracin de sustrato [S] 2) Concentracin de la enzima [E] 3) pH del medio 4) Influencia de la temperatura 5) Efecto de inhibidores y activadores En la presente prctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimtica de la amilasa salival sobre el almidn. La amilasa es una enzima que degrada molculas hidrocarbonadas complejas en componentes mas pequeos, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es producida por el pncreas exocrino y las glndulas salivales para ayudar a digerir el almidn. La amilasa humana se denomina alfa-amilasa por su capacidad para romper los enlaces polisacridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de los puntos de ramificacin no se alteran. El producto final de la accin de la alfa-amilasa sobre el almidn es la formacin de dextrinas, maltosas y algunas molculas de glucosa. El pH ptimo al cual acta es 6.9 a 7 y se requiere cloro para su activacin. En la prctica la actividad enzimtica se medir por la desaparicin del sustrato (disminucin de la turbidez en los tubos que contienen almidn), la cual se determinar en el espectrofotmetro a 650 nm.

EXPERIMENTO A
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y DEL ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL 1) Preparar los siguientes tubos: I 1 ml 5 ml 2.8 ml --II 1 ml 5 ml 2.6 ml --III 1 ml 5 ml 2.4 ml --IV 1 ml 5 ml 2.2 ml --V 1 ml 5 ml --2.2 ml VI 1 ml 5 ml 2.2 ml ---

Tubos No. Solucin almidn 1% Buffer fosfato pH 6.6 Solucin salina (NaCl 1%) Agua destilada

2) 3)

Colocar los tubos I al V en un bao de agua a 37 C, durante 5 minutos. El tubo VI servir de comparacin para ver el efecto de la temperatura sobre la accin enzimtica por lo que se deja a temperatura ambiente. Agregar la solucin de enzima: I 0.4 ml II 0.8 ml III 1.2 ml IV V VI 1.6 ml 1.6 ml 1.6 ml

Tubos No. Solucin amilasa 4) 5)

Colocar nuevamente los tubos I al V en bao de agua a 37C durante 20 minutos, el tubo VI se mantiene a temperatura ambiente. Luego hacer el control final de la reaccin con el reactivo de yodo, de la siguiente manera: I 5 ml 0.5 ml 0.5 ml II 5 ml 0.5 ml 0.5 ml III 5 ml 0.5 ml 0.5 ml IV V VI 5 ml 5 ml 5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

Tubos No. HCl 0.05 N de los tubos de reaccin correspondientes agregar Solucin yodada 6) 7) 8) 9)

Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos. Leer las absorbancias al espectrofotmetro a 650 nm. La diferencia de las absorbancias entre los tubos nos indicar la actividad enzimtica para cada tubo. Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimtica en el eje Y vs concentracin de la enzima [E] en el eje X.

EXPERIMENTO B
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL 1) Preparar los siguientes tubos: Tubos No. Solucin de almidn 1% Buffer fosfato pH 6.6 Solucin salina (NaCl 1%) Agua destilada 1 2 2 5 I ml ml ml ml 2 2 2 4 II ml ml ml ml 3 2 2 3 III ml ml ml ml 4 2 2 2 IV ml ml ml ml 5 2 2 1 V ml ml ml ml

2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solucin yodada con todos los cinco tubos de la misma manera que se hizo en el experimento anterior y leer las absorbancias de dichos controles a 650 nm. Dichas absorbancias se tomarn como lecturas iniciales.

3) Luego aadir 1 ml de solucin de enzima a cada tubo y colocarlos en el bao de agua a 37C por 20 minutos. 4) Sacar los tubos y hacer un control con solucin yodada de cada uno. Las lecturas de absorbancia se tomarn ahora como lecturas finales. 5) Hacer la diferencia: Actividad enzimtica = Lectura inicial Lectura final El resultado de esta diferencia se considerar como actividad enzimtica. 6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidn a partir de una grfica de actividad enzimtica contra [S] (Ecuacin de MichaelisMenten) y una grfica de dobles inversas: 1/actividad enzimtica contra 1/[S] (Ecuacin de Lineweaver-Burk). Graficar en papel milimetrado.

EXPERIMENTO C
EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL 1) Preparar los siguientes tubos: Tubos No. Solucin de almidn 1% Solucin salina (NaCl 1%) Buffer fosfato pH 6.6 Buffer fosfato pH 3.7 Buffer fosfato pH 8.0 2) 3) 4) 5) I 5 ml 2 ml 2 ml ----II 5 ml 2 ml --2 ml --III 5 ml 2 ml ----2 ml

Mezclar y colocar los tubos en bao de agua a 37C por 5 minutos. Aadir a cada tubo 2 ml de solucin de enzima (amilasa). Colocar nuevamente los tubos a 37C por 20 minutos. Extraer los tubos del bao y realizar el control mediante la solucin yodada, como en el experimento anterior. 6) Realizar el estudio crtico comparativo de ellos. Sacar conclusiones. 7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimtica vs pH.

CUESTIONARIO:
1.2.3.4.5.Cul es la importancia del Km. Qu efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas. Como se clasifican las enzimas? A que se llaman zimgenos e isoenzimas. Que son cofactores y mencione ejemplos.

PRACTICA No 5
EVALUACIN NUTRICIONAL BIOQUMICA Y ANTROPOMETRICA
La evaluacin nutricional es parte de la evaluacin integral del estado de salud de un individuo. Es un requisito indispensable siempre que se desea mejorar, promover o mantener un buen rendimiento fsico, un buen estado de salud y nutricin, adems de dar una idea ms exacta del nivel de rendimiento que se tiene y que se puede alcanzar. El objetivo general de la prctica es determinar el estado nutricional mediante un diagnstico que permita conocer el nivel nutricional actual y anterior, y los posibles factores socioalimentarios, econmicos y de composicin corporal, que puedan afectar la participacin y rendimiento de una persona. Otros objetivos de realizar esta evaluacin son: Detectar dficit de nutrientes especficos, riesgo de desnutricin o sobrepeso. Brindar educacin nutricional Seleccionar personas de acuerdo a la composicin corporal, orientar el trabajo fsico y/o reubicar al nio en una actividad fsica determinada ESTADO NUTRICIONAL : Es la condicin de salud resultante en el tiempo, del balance entre lo consumido y lo requerido. Est determinado por la calidad y cantidad de los nutrientes consumidos y por la utilizacin de estos en el organismo.

EVALUACIN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropomtricos, dietarios, bioqumicos y clnicos, que correlacionados entre s, permiten dar un diagnstico nutricional y por tanto orientar el tratamiento o manejo nutricional. Una evaluacin completa debe incluir: 1. Evaluacin antropomtrica: Estudio de la forma y composicin corporal. Determina y compara los diferentes componentes (hueso, msculo, grasa y residuo) Analiza segn patrones ideales o establecidos (edad, sexo, deporte, nivel de rendimiento) Indispensable para intervenir en procesos de crecimiento, actividad fsica y estado nutricional. - Parmetros incluidos: Talla actual, talla/edad, Peso actual, peso usual, peso esperado, Metropolitan life) Circunferencias (Volumen muscular) Dimetros (estructura sea) Pliegues (% grasa)

peso/talla (Ref. NCHS,

2. Evaluacin bioqumica: Permite conocer los niveles sanguneos de los parmetros bioqumicos, indicadores del estado nutricional. Confirma datos clnicos y dietarios Susceptible a variaciones en la interpretacin segn edad, sexo, factores hereditarios o consumo inmediato de alimentos. - Parmetros incluidos: Cuadro hemtico (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y linfocitos) Protenas totales y diferenciales (albmina / globulinas) C reatinina urinaria 24hs/ Talla Trasferrna y Ferritina Glicemia y Perfil de lpidos

3. Evaluacin Clnica: Basada en la evaluacin mdica. Observa y analiza signos y sntomas clnicos que puedan indicar deficiencias nutricionales: - Parmetros incluidos: Sueo, fatiga, aspecto fsico, piel, cabello, uas, labios. Apetito / hambre Cambios de peso Frecuencia cardiaca Cicatrizacin Lesiones frecuentes Tiempo de recuperacin de las lesiones Comportamiento del deportista

4. Evaluacin dietaria: Analiza cualitativa y cuantitativamente el consumo dietario actual, comparndolo con la recomendacin para la edad, sexo y gasto energtico. Permite orientar, prescribir, calcular y disear un plan alimentario adecuado, ajustado a las necesidades nutricionales y calricas, condicin socioeconmica y hbitos del deportista. - Parmetros incluidos: Encuesta nutricional: - Historia socioalimentaria - Anamnesis alimentaria - Conductas alimentarias - Frecuencia de consumo de alimentos - Antecedentes personales y familiares Evaluacin cualitativa - Nmero de porciones diarias por grupos de alimentos Evaluacin cuantitativa - Cantidad de kcal y nutrientes (grs promedio) consumidos, promedio / da. Determinacin de la recomendacin calrica y de nutrientes - Comparar con el consumo para determinar excesos o dficit y disear frmula dietaria prescrita. EXPERIMENTO A DETERMINACIN DE PROTEINAS Y ALBMINA EN SUERO FUNDAMENTOS DEL METODO: Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan en un medio alcalino con el ion cprico del reactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un complejo de color violeta cuya mxima absorcin se da a 540 nm. NaOH Cobre + protena Complejo cupro-proteico El dosaje de protenas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la alteracin en una de las fracciones puede ser balanceada por una alteracin opuesta de otra fraccin. Por lo tanto, es importante que adicionalmente se determine la concentracin de albmina. La albmina tambin va a ser dosada por el mtodo de Biuret, pero previamente al suero se le hace un tratamiento con sulfato de sodio y eter etlico para lograr la separacin de las globulinas y permitir solo el dosaje de albminas. REACTIVOS: 1.- Reactivo para protenas (Biuret): Solucin de sulfato de cobre, hidrxido de sodio y tartrato.

2.- Solucin de sulfato de sodio al 22.6%. 3.- Eter etlico. 4.- Standard de protenas: Solucin patrn calibrada y estabilizada equivalente a 10.4 g/dl de protenas.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE PROTEINAS EN SUERO: Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:
Blanco (ml) ----4 1 Standard (ml) --1 4 --Muestra (ml) 1 --4 ---

Suero diluido 1/20 Standard Reactiivo Biuret Agua destilada

Mezclar y esperar 30 minutos. Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm. CALCULOS: Calcular la concentracin de protenas (en g/dl), utilizando el mtodo del Factor de Calibracin. La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra y standard para obtener una absorbancia neta, sin la intervencin del color propio del reactivo.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE ALBMINA EN SUERO : Preparar un tubo de la siguiente manera:

Suero sanguneo.................................0.3 ml. Colocar 5 minutos al bao mara a 37C. Solucin de sulfato de sodio................5.7 ml. Mezclar. ter etlico............................4.0 ml. Mezclar. Tapar el tubo y centrifugar.

Inclinando el tubo, extraer con una pipeta el suero tratado que se aprecia como un lquido claro que queda debajo del precipitado.
Blanco (ml) ----4 1 Standard (ml) --1 4 --Muestra (ml) 1 --4 ---

Suero tratado Standard Reactivo Biuret Sulfato de sodio

Mezclar y esperar 30 minutos. Leer las absorbancias a una longitud de onda de 540 nm. CALCULOS: Calcular la concentracin de albmina (en g/dl) utilizando el mtodo del Factor de Calibracin, en forma similar que para el caso de las protenas totales.

VALORES NORMALES: Protenas: 6.0 8.0 g/dl. Albmina: 3.5 5.5 g/dl.

CUESTIONARIO.-

1.- Qu diferencias hay entre desnutricin y malnutricin?

2.- Describa todos los tipos de protenas plasmticas y cules son sus funciones. 3.- Cules son los tipos de desnutricin que existen y como se valoran? 4.- Que son la transferrina, prealbmina y protena transportadora de retinol y cual es su rol en la valoracin del estado nutricional? 5.- Qu es el ndice de Masa Corporal, como se halla y cual es su interpretacin?

PRACTICA No 6
DETERMINACIN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIN DE GLUCOSURIA
El mantenimiento de la glIicemia, o concentracin plasmtica de glucosa, en los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los rganos, al ser la glucosa un metabolito energtico principal. La coordinacin de los procesos metablicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la relacin insulina/glucagn. La ingestin de glucosa o sustancias que la produzcan (almidn, fructosa, galactosa, protenas, pero no grasas) va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilizacin de glucosa (por gluclisis, entre otras), aceleracin de la glucogenognesis y disminucin de la glucogenlisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secrecin de insulina, una hormona pancretica de tipo polipeptdico. En el caso de que la produccin de insulina est disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las clulas, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia); as ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I". El diagnstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes, sntomas clnicos y comprobacin de una hiperglicemia significativa.

Experimento A: DETERMINACIN DIRECTA DE LA GLICEMIA (concentracin de glucosa en suero)

FUNDAMENTO TERICO
Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la concentracin de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera repentina y adems es severa. Una hiperglicemia superior a 124 mg/dL detectada en ms de una ocasin en ayunas, adems se considera tambin un valor mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de posible diabetes, diagnstico que debe confirmarse con otras pruebas. La determinacin de glucosa sangunea es una prueba muy frecuente en bioqumica y se puede llevar a cabo tanto por mtodos qumicos como enzimticos, siendo estos ltimos los ms especficos. Hay dos tipos de mtodos qumicos: a. Reducimtricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos mtodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa verdadera. Ejemplos son el mtodo de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson. b. Furfurlicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrir deshidratacin en un medio cido. Un ejemplo es el mtodo que emplea orto-toluidina. En cuanto a los mtodos enzimticos: a. Mtodo de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa6-fosfato deshidrogenasa. Por cada molcula de glucosa se forma una de NADPH, que puede medirse espectrofotomtricamente a 340 nm. Es el mtodo de referencia recomendado por las organizaciones internacionales. b. Mtodo de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en esta prctica para medir los niveles de glucosa sangunea de la muestra problema y de los standares. Se explica a continuacin: En el mtodo GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidacin de la D-glucosa a cido D-glucnico con formacin de perxido de hidrgeno. ste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color ser proporcional a la concentracin de glucosa presente inicialmente. El esquema de la reaccin es el siguiente:

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 10 ml. Pipetas. Espectrofotmetro. Agua destilada. Solucin patrn de glucosa (100 mg/dl). Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampn fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: La muestra de sangre extrada del paciente ser centrifugada y se separar el suero. Hacer una dilucin del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo 0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar. Luego se preparan los siguientes tubos:
Tubos: Suero diluido (ml) Estndar de glucosa (ml) Reactivo de glucosa (ml) Blanco ----3 Standard --1 3 Muestra 1 --3

Incubar los tres tubos en Bao Mara de 37C por 15 minutos. Luego de retirar del Bao Mara, agregar:

Agua destilada (ml)

Mezclar bien la solucin. Leer las absorbancias para cada una de las muestras en el espectrofotmetro a 520 nm.

CALCULOS Encontrar la concentracin de glucosa en la muestra utilizando el mtodo del factor de calibracin. VALORES NORMALES La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl. Para el diagnstico de diabetes se considera un valor mayor de glicemia en ayunas de 124 mg/dl mayor de 200 mg/dl en cualquier momento. Los pacientes cuyos niveles de glucosa se encuentren entre lo normal y lo diabtico, son clasificados en una categora denominada tolerancia alterada a la glucosa y requieren observacin y pruebas confirmatorias.

Experimento B: INVESTIGACIN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA

FUNDAMENTO TEORICO
En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos con los mtodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de glucosa en orina) se presenta en la Diabetes Mellitus pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de 180 mg/dl. La deteccin cualitativa de glucosa en orina se basa en la accin de la glucosa, que reduce las sales de cobre en medio alcalino por ebullicin. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio. MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 20 ml, pipetas, mechero Bunsen, Reactivo Benedict, pinzas porta tubos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Tubos: Orina normal (gotas) Orina DM (gotas) Reactivo de Benedict (ml) I VIII --5 II --VIII 5

Calentar directamente a la llama de un mechero durante 2 minutos y se deja enfriar. Si la orina contiene glucosa, se observa un precipitado color verde, amarillo rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle presente. De ser negativa la reaccin permanecer de color azul.

CUESTIONARIO:
1.- Qu es la Diabetes Mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del laboratorio?

2.-Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorcin de la glucosa. 3.- Describa los mtodos que existen para el dosaje de la glicemia.
4.Explique el mecanismo de accin de los reactivos de Benedict y de Fehling. 5.Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cul es su importancia en la diabetes?

PRACTICA No 7
TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POST PRANDIAL
Definicin de la Enfermedad Diabetes Mellitas.La Diabetes Mellitus es un grupo de enfermedades metablicas caracterizadas por la presencia de hiperglIcemia resultante de un defecto en la secrecin de insulina, en la accin insulnica, o en ambas.

Clasificacin de DM

Diagnstico
Es muy importante el diagnstico temprano de la enfermedad debido a que niveles elevados de glucosa, an cercanos al lmite superior normal, producen daos en la microvasculatura de retina y rin

Existen otras entidades fisiopatolgicas relacionadas con hiperglicemia que no llegan a cumplir los criterios de diabetes pero que son muy importantes ya que deben ser vigiladas ya que estos pacientes presentan riesgo elevado de evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa en ayunas anormal.

Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando despus de una prueba de tolerancia con 75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores mayores a 140 y menores a 200 mg/dl. La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas son mayores a 110 pero menores a 126 mg/dl.

Experimento A: TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POSTPRANDIAL

FUNDAMENTO TERICO Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo para diagnstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto para la Diabetes como para la intolerancia. Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos son los obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la solucin ms agradable al paladar y por lo tanto tendrn ms aceptacin por parte del paciente.

Ayuna s 30 min 1 hora 2 horas

70-110 mg/dl <200 mg/dl <180 mg/dl <140 mg/dl

En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en nios se debe utilizar una cantidad de glucosa correspondiente al peso del nio (1,75 g de glucosa por Kg de peso). Es de suma importancia recordar que antes de iniciar cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de orina al paciente, para hacerle un anlisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que la glucosuria indica en la gran mayora de los casos, niveles sanguneos de glucosa elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le podra provocar al paciente un shock hiperglicmico. Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organizacin Mundial de la Salud como por la American Diabetes Association, estas son las relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional. La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta en ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles son menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la prueba confirmatoria para DMG. Esta consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y hacer una curva de tres horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores indicados en la siguiente tabla, se hace el diagnstico de DMG. Ayuna s 1 hora 2 horas 3 horas 105 mg/dl 190 mg/dl 165 mg/dl 145 mg/dl

La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la glucosa acortada, donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas. Ayuna s 2 70-110 mg/dl <140 mg/dl

horas MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo de 5 ml. Micropipetas automticas de 10 uL. Espectrofotmetro. Solucin patrn de glucosa (100 mg/dl). Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona, fenol, tampn fosfato pH: 7.0

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: Se determinar la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal, a los 30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra sangunea basal se le d de tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas gotas de limn. Las muestras de sangre extradas de la persona sern centrifugadas y se separarn los sueros. Para la determinacin de las glicemias se utilizar el mtodo de la glucosa oxidasa peroxidasa (GOD-POD).
Tubos: Suero (uL) Estndar de glucosa (uL) Reactivo de glucosa (ml) Blanco Standar Muestr Muestr Muestr Muestr d a (0) a (30) a (60) a (120) ----10 10 10 10 --10 --------1 1 1 1 1 1

Incubar los tres tubos en Bao Mara de 37C por 5 minutos . Mezclar bien. Leer las absorbancias para cada una de los tubos en el espectrofotmetro a 500 nm.

CALCULOS Encontrar la concentracin de glucosa en cada una de las muestras utilizando el mtodo del factor de calibracin.

CUESTIONARIO:
1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel milimetrado una grfica de tiempo vs. Glicemia y apreciar la curva de tolerancia a la glucosa.

2.- Como sera esta curva en el caso de una persona normal, un diabtico y un intolerante a la glucosa. 3.- Que importancia tiene la deteccin de microalbuminuria en una persona. 4.- Qu son y en que casos se hace un dosaje de pptido C y de insulina en un paciente diabtico. 5.- Cules son las complicaciones agudas y crnicas de la diabetes?

PRACTICA N 8
DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA
La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la fraccin exocrina del pncreas y en las glndulas salivales. Su accin se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosdicos de los polisacridos como almidn y glicgeno. En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa srica empieza a elevarse en las primeras 2 a 3 horas de la enfermedad, alcanzando los valores ms elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre el 3 y 6 da. Tambin se ve aumentada en este caso la excrecin urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 das, luego de que la actividad srica ha alcanzado los niveles normales. Tambin es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gstrica o duodenal perforada, obstruccin intestinal, obstruccin de conductos biliares, pancreatitis crnica, hipertiroidismo, carcinoma de cabeza de pncreas, administracin de opiceos y en general cualquier caso de abdomen agudo o intervencin quirrgica en regiones prximas al pncreas. Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secrecin de amilasa salival, se asocian tambin con elevaciones en los niveles de amilasa srica. PANCREATITIS AGUDA: Definicin: Es un desorden inflamatorio del pncreas, en el cual la funcin pancretica normal debe ser restaurada una vez que la causa primaria del evento agudo es superado. Causas: Pancreatitis por clculos biliares: 60% (en nuestro medio) Pancreatitis alcohlica: 80% (en pases Anglosajones) Pancreatitis de causa idioptica: 30% Pancreatitis por tumores ampulares-coledococele-Pn-creas Divisum Pancreatitis por condiciones metablicas asociadas Hipertriacilgliceridemia Hiperparatiroidismo

- Hipercalcemia - Hiperlipoproteinemia Tipo V; tambin tipos I y IV - Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas) - Pancreatitis por picadura de escorpin en Amrica del Sur y Central - Pancreatitis por Metanol - Pancreatitis traumtica (Trauma abdominal) - Pancreatitis Iatrognica: ERCP, por corte esfnter de Oddi Ciruga pancreatobiliar, transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis PANCREATITIS CRNICA:
Definicin: Es un estado inflamatorio crnico que determina un dao irreversible de la estructura y funcin pancretica. El curso clnico de la pancreatitis crnica puede consistir en ataques recurrentes agudos o una relativa progresin de sntomas. En 1988 la clasificacin Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoci la Pancreatitis Crnica Obstructiva subsiguiente a la pancreatitis crnica. sta es causada por la lesin obstructiva, es la forma ms comn de pancreatitis, la que se caracteriza por cambios crnicos irreversibles. Causas: Pancreatitis Pancreatitis Pancreatitis Pancreatitis Pancreatitis Pancreatitis Alcohlica Idioptica Crnica Tropical Hereditaria por Hiperparatiroidismo por Lesiones Traumticas del Conducto Ductal

Experimento A: DETERMINACIN DE AMILASA EN SUERO FUNDAMENTOS DEL METODO:

En este mtodo el sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra, producindose la hidrlisis enzimtica. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidn no hidrolizado. La disminucin de color respecto de un sustrato control (sin muestra) es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en Unidades Amilolticas (Smith & Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarognicas (Somogy)/decilitro.

MATERIALES Y REACTIVOS:
-

Espectrofotmetro. Micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados. Tubos de ensayo y cubetas de lectura. Bao mara a 37C. Reloj de intervalos. Substrato: solucin de almidn 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfato 0.1 mol/l en NaCl 0.15 mol/l. Reactivo de yodo: solucin 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Preparar los siguientes tubos: Control Muestra Sustrato 1 ml 1 ml Dejar unos minutos en bao de agua a 37C y agregar: Muestra --20 uL Incubar a 37C. A los 730 exactos, agregar: Reactivo de yodo 1 ml 1 ml Mezclar por agitacin suave. Retirar los tubos del bao y agregar: Agua destilada 8 ml 8 ml Mezclar por inversin. Leer en espectrofotmetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con agua destilada.

Experimento B: DETERMINACIN DE AMILASA EN ORINA

El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este caso la muestra en lugar de suero es orina diluida la cual debe obtenerse de la siguiente manera: El paciente debe orinar descartando esta miccin, dos horas despus vuelve a orinar y recoge toda la orina. Esta muestra, que corresponde a dos horas de diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada. La determinacin se efecta con 20 uL de esta dilucin, obtenindose el resultado directamente en Unidades Amilo lticas/hora.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Para ambos experimentos se emplear la siguiente frmula: Abs. Control - Abs. Muestra Amilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000 Abs. Control Unidades: Una Unidad Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos, en las condiciones de la reaccin. En esta tcnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5 mg de almidn contenidos en 1 ml de Sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidn durante 30 minutos. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la muestra sera de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilsica, la fraccin de almidn digerido se multiplica por 1000.

VALORES DE REFERENCIA:
Suero (UA/dl) <120 300 a 12000 Hasta 200 200 a 350 complicacin Ms de 350 Orina (UA/hora) <260 Ms de 900 Ms de 300 350 a 750 Ms de 750 Normal

Normal Pancreatitis aguda Pancreatitis crnica Parotiditis Parotiditis con pancretica Procesos abdominales agudos (sin Normal pancreatitis)

CUESTIONARIO:

1.- Explique como se produce la activacin de las enzimas producidas por el pncreas exocrino ? 2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa, tripsina, elastasa y fosfolipasa A2? 3.Explique como se produce la digestin completa del almidn en nuestro tubo digestivo. 4.- Cul es el cuadro clnico de una pancreatitis aguda? 5.- Qu otros exmenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el diagnstico de pancreatitis?

PRACTICA N 09 CETOACIDOSIS DIABTICA

BASE BIOQUMICA. La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglicemia y otros desarreglos que se deben a una inadecuada accin de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea porque exista un reducido nivel circulante de Insulina una resistencia de los tejidos blanco a sus acciones .La Diabetes se divide en dos categoras a) Diabetes Tipo I Diabetes Insulino dependiente Diabetes juvenil (llamada as porque se inicia en la juventud) y la Diabetes tipo II no insulino dependiente (diabetes de inicio en la edad madura). Puede haber tipos intermedios que se superponen. (A )LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabticos y la dependencia de la Insulina significa que no solamente que la insulina es necesaria para el ptimo control de la glucosa sangunea, que tambin podra ser cierto para la forma tipo II, sino que sin Insulina exgena el paciente es mas proclive a desarrollar CETOACIDOSIS diabtica. (1) Se sabe que esto refleja una completa casi ausencia de insulina en estos pacientes, en contraste con la falta parcial de insulina la resistencia a la insulina caracterstico de los pacientes del tipo II. (2) Otra caracterstica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su presencia en nios y adultos jvenes y su presencia en las personas mas bien delgadas que obesas. ( B ) LA DIABETES TIPO II comnmente afecta a las personas de edad madura, y con sobrepeso. ( 1 ) Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce cetoacidosis ( 2 ) Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la severa hiperglicemia. Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria alterarse la tolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades que afectan la produccin la accin de la Insulina, tales como la pancreatitis crnica, el Sndrome de Cushing, la acromegalia, la alteracin de los receptores de insulina y otras. El sntoma mas comn que produce la hiperglicemia es la poliuria(Aumento del volumen urinario) y la polidipsia( incremento en la ingesta de agua), lo cual se debe a la diuresis osmtica inducida por la glucosa. El incremento en la ingesta de agua es una respuesta a deshidratacin y sed..Se produce disminucin de peso corporal, debido a la prdida de glucosa por la orina y a los efectos catablicos de la disminucin de la accin de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos (Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones metablicas .Las infecciones de la piel, vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los casos no controlados debido a que la

hiperglicemia disminuye la resistencia a las infecciones. La alteraciones en la retina son precoces.

CET0ACIDOSIS DIABETICA:

Se produce en los diabticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante es insuficiente para permitir una utilizacin de la glucosa por los tejidos perifricos y para inhibir la produccin de glucosa y el catabolismo tisular. El incremento del Glucagon y el aumento de las hormonas que aumentan en respuesta al stress ( como la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del crecimiento) contribuyen a los desarreglos metablicos. La insuficiente cantidad de insulina reduce la utilizacin perifrica de glucosa y junto con el exceso de glucagon incrementan la produccin heptica de glucosa a travs de la estimulacin de la gluconeognesis y la glucogenolisis y la inhibicin de la gliclisis.La degradacin de las protenas en los tejidos perifricos suministra un flujo de aminocidos hacia el hgado como substrato para la gluconeognesis.El resultado es la hiperglicemia .La diuresis osmtica resulta de la elevacin de la glucosa ( y cuerpos cetnicos ) y genera hipovolemia, deshidratacin y prdida de sodio, fosfato de potasio y otras substancias por la orina. La deplecin del volumen estimula la liberacin de catecolaminas lo cual se opone a la accin de la insulina en el hgado y contribuye a la LIPOLISIS. CETOGENESIS: La liplisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de catecolaminas moviliza los acidos grasos no esterificados desde sus depsitos en el tejido adiposo y en lugar de reesterificarse con el glicerol para formar triacilgliceroles, el hgado desva sus rutas metablicas hacia la produccin de cuerpos cetnicos. El glucagon incrementa el nivel de carnitina, que capacita a los cidos grasos a entrar en la mitocondria, donde ellos sufren beta oxidacin hacia cuerpos cetnicos. Adems el glucagon disminuye el contenido heptico de malonil CoA, que es un inhibidor de la oxidacin de acidos grasos. ACIDOSIS: El incremento de la produccin heptica de cuerpos cetnicos( acetoacetato y beta hidroxibutrico) excede la capacidad corporal de metabolizarlos excretarlos. Sus H + son tamponados por el bicarbonato, conduciendo a una cada del bicarbonato srico y del pH sanguneo. Se encontrar entonces: hiperglicemia, hipercetonemia, acidosis metablica, disminucin del bicarbonato, disminucin del pH sanguneo y presencia en la orina de glucosa (glucosuria) y cuerpos cetnicos cetonuria.

OBJETIVO DE LA PRACTICA.-

Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato srico, pH sanguneo y presencia de cuerpos cetnicos en la orina en presencia de Cetoacidosis Diabtica.

EXPERIMENTO A: DOSAJE DE BICARBONATO SRICO

Reactivos y materiales: HCl 0.01 N NaOH 0.01 N Fenoltalena 20 mg% solucin alcohlica Alcohol corriente caprlico. Muestras problemas de bicarbonato para titularlas.. Pipetas de 5 ml graduadas al dcimo Pipetas de 1 ml graduadas al centsimo Beakers de vidrio de 100 50 ml Baguetas de vidrio Bao Mara de 37C Reloj de intervalos Mtodo: En un beaker de vidrio colocar: 5 ml de HCl 0.01 N 1 ml de suero 2 gotas de alcohol Agitar y luego reposo 2 min. Aadir 3 gotas del indicador Fenoltalena. Colocar a 37 C en Bao Mara por 10 minutos. Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado plido. Anotar la cantidad de NaOH gastado. Clculos: ( 5 - X ml gastados de NaOH en la titulacin) x 10 = mMol/ Litro de HCO3Considerar que: a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3 b)Vol. de muestra usada en la titulacin : 1 ml c)Expresar los valores de HCO3- en mMol/Litro Valores Referenciales (Normales):

22 34 mMol/Litro

EXPERIMENTO B: INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA

Test de Rothera .- Esta prueba depende de la reaccin entre la Acetona y el nitroprusiato para formar un complejo coloreado prpura rojizo que indica la presencia de acetoacetato y/o acetona. Reactivos para el test de la Rothera: Cristales de sulfato de amonio Solucin de Nitroprusiato al 10% en solucin acuosa, la cual deber ser fresca. Amoniaco solucin ( Hidrxido de amonio concentrado) Muestra problema: orina Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamente Pipetas Pasteur capilares pipetas de vidrio de 1 ml terminales Esptulas bajalenguas de madera. Baguetas de vidrio. Procedimiento: NO SE DEBER PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO HACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y aadirle con la esptula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales. Disolver con bagueta. Aadir 2 3 gotas de sol. Nitroprusiato 10% . Mezclar bien Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca, lentamente, en zona deslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur pipeta de vidrio. Debern quedar dos capas bien definidas. Esperar unos minutos y ver la formacin de un anillo morado en la interfase en caso positivo para cuerpo cetnicos .Si no aparece este color la prueba es negativa.

CUESTIONARIO:

1.- Explique la formacin de cuerpos ce tnicos y porque se producen. 2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabtica y coma hiperosmolar. 3.- Como se diagnostica a un paciente que est en cetoacidosis diabtica? 4.- A qu se llama: exceso de bases y reserva alcalina. 5.- Explique los diferentes mtodos de laboratorio que existen para el dosaje tanto de bicarbonato en sangre como de cuerpos cetnicos en orina.

PRACTICA N10 PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO

El nivel srico de colesterol ha sido objeto en los ltimos aos de numerosas investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos.
Desde un punto de vista mdico la determinacin de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnstica limitada. Sin embargo, su concentracin vara de manera ms o menos predecible en un gran nmero de condiciones clnicas. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formacin de ateromas dado que las complicaciones arteriosclerticas prevalecen en individuos hipercolesterolmicos. Diversos estudios epidemiolgicos han permitido observar adems, que el riesgo de contraer enfermedad cardaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de ms de 40 aos) con colesterolemia menor igual a 200 mg% es 3 veces menor que entre individuos con ms de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos con ms de 260 mg%. Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer adems la distribucin de las lipoprotenas encargadas del transporte: HDL (lipoprotenas de alta densidad), considerada como el factor protector y LDL (lipoprotenas de baja densidad), consideradas como el verdadero factor de riesgo. Las funciones biolgicas inherentes a los distintos grupos de lipoprotenas, las variaciones en su composicin y los resultados de los diversos estudios epidemiolgicos, indican que los valores aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como ndices predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipdico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.

Experimento A: DETERMINACIN DE COLESTEROL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:

El colesterol es oxidado enzimticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrlisis enzimtica de los steres mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidacin, produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4aminofenazona (4-AF) mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinonimina roja con absorbancia mxima a 505 nm.

Lipasa steres de colesterol CHOD Colesterol + O2 POD H2O2 4 H 2O REACTIVOS: Standard: solucin de colesterol 200 mg% Enzimas: suspensin conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3 U/ml) y peroxidasa (20 U/l). Reactivo 4-AF: solucin de 4-aminofenazona (25 mmol/l). Reactivo Fenol: solucin de fenol (55 mmol/l). Reactivo de trabajo : de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50 partes de agua destilada, 5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente homogenizadas. Mezclar por inversin, sin agitar. PROCEDIMIENTO: + 4-AF 4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona + colesten-3-ona + H 2O2 colesterol + cidos grasos

En tres tubos colocar:

Blanco ----2 ml Standard 20 uL --2 ml Muestra --20 uL 2 ml

Tubos Standard Muestra Reactivo de trabajo

Incubar 15 minutos en bao de agua a 37C. Leer en el espectrofotmetro a 505 nm. CALCULO DE RESULTADOS: Calcular la concentracin de colesterol total en suero, aplicando el mtodo del factor de calibracin. Recordar que la concentracin del standard de colesterol es de 200 mg% VALORES DE REFERENCIA:

Los valores de colesterol en sangre fluctan segn edad, sexo y hbitos de dieta y de ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores normales, pues la norma promedio de una poblacin no necesariamente refleja ausencia de riesgo patolgico en el caso de colesterol. Menos de 200 mg% valor deseable 200 a 239 mg% valor frontera Mayor de 240 mg% valor alto

Experimento B: DETERMINACIN DE COLESTEROL HDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO: Las lipoprotenas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoprotenas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de Sulfato de Dextrn de PM 500,000 en presencia de iones Mg++. En el sobrenadante separado por centrifugacin, quedan las HDL y se realiza la determinacin del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema ms conveniente. REACTIVOS: REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solucin de Sulfato de Dextrn y de Cl2Mg.H2O PROCEDIMIENTO: En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml de Reactivo Precipitante. Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 15 minutos en refrigeracin. No colocar en el congelador. Centrifugar a 3000 rpm. Usar el sobrenadante como muestra. En tres tubos colocar:
Tubos Standard Sobrenadante Reactivo de trabajo Blanco ----2 ml Standard 20 uL --2 ml Muestra --100 uL 2 ml

Incubar 15 minutos en bao de agua a 37C. Leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

CALCULOS: De acuerdo al mtodo del factor de calibracin, considerando que la concentracin del standard es de 45.7 mg%. VALORES NORMALES: 30 65 mg%

Experimento C: DETERMINACIN DE COLESTEROL LDL EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:

Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitndolas selectivamente mediante el agregado de polmeros de alto peso molecular. Luego de centrifugar, en el sobrenadante quedan las dems lipoprotenas (HDL y VLDL), el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema ms conveniente. Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se obtiene el colesterol unido a las LDL. REACTIVOS: REACTIVO PRECIPITANTE.- Solucin de sulfato de polivinilo disuelto en polietilenglicol (PM 600). PROCEDIMIENTO: En un tubo, colocar 0.2 ml de suero problema y aadir 0.1 ml de Reactivo Precipitante. Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos. Dejar 15 minutos en un bao de agua a 20-25C. Centrifugar a 3000 rpm. Usar el sobrenadante como muestra. En tres tubos colocar:
Tubos Standard Sobrenadante Reactivo de trabajo Blanco ----2 ml Standard 20 uL --2 ml Muestra --100 uL 2 ml

Incubar 15 minutos en bao de agua a 37C. Leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

CALCULOS: LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibracin) La concentracin del standard es de 62.4 mg%. VALORES NORMALES: Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg% Riesgo moderado : 140 a 190 mg% Riesgo elevado : Mayor de 190 mg% CUESTIONARIO: 1.- Qu es RIESGO CORONARIO y como se calcula? 2.- Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis? 3.- Describa como se produce la biosntesis de colesterol dentro del organismo. 4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula. 5.- Que rol cumplen los triglicridos y como se realiza su metabolismo.

PRACTICA N11 PERFIL LIPIDICO II: TRIACILGLICERIDOS

Los triacilglicridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo por lo tanto una potente forma de almacenamiento de energa. El movimiento de cidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se produce con gran rapidez en respuesta a diversos estmulos (dieta, actividad fsica, stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los triglicridos (uno de los ms importantes vehculos para el transporte de cidos grasos) varen tambin su concentracin en respuesta a estos factores fisiolgicos. Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a niveles anormales de triacilglicridos circulantes. La persistencia de esta condicin, se asocia con numerosas patologas, tales como enfermedad heptica, renal, hiperlipidemias esenciales, etc. Un caso que resulta de particular inters es el aumento de traciliglicridos en individuos obesos, en los cuales tiene importancia pronstica, respecto a la probabilidad de desarrollar enfermedad cardaca coronaria. Alrededor del 50% de los lpidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son triglicridos, por lo que es posible relacionar a los triacilglicridos con la patognesis de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista est sustentado por el hecho de que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio tambin exhiben hipertriacilgliceridemia. Para la determinacin de triacilglicridos en suero se usar la determinacin enzimtica de glicerol a partir de glicridos. Los mtodos enzimticos se basan en la determinacin del glicerol contenido en las molculas de los traciliglicridos, tras la hidrlisis (qumica enzimtica) para remover los cidos grasos. La determinacin enzimtico del glicerol ha sido usada durante muchos aos; sin embargo, en estos mtodos se empleaba la hidrlisis alcalina de los triglicridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrlisis, ha posibilitado el empleo de mtodos directos, rpidos y especficos. Los sistemas totalmente enzimticos

eliminan el uso de reactivos custicos, extraccin con solventes, baos de altas temperaturas y mezclas de adsorcin para la remocin de fosfolpidos. Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente los traciliglicridos.

Experimento A: DETERMINACIN DE TRIACILGLICERIDOS EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO: Se producen reacciones qumicas basadas en la determinacin qumica de glicerol a partir de glicridos. La primera etapa consiste en que los triacilglicridos son hidrolizados enzimticamente por una lipoprotein lipasa especfica, produciendo glicerol y cidos grasos. lipoprotein lipasa Triacilglicridos Glicerol + 3 cidos grasos

En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerolkinasa. Glicerol + ATP Glicerol kinasa Glicerol-1-P + ADP

En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa (GPO), con produccin de agua oxigenada. Glicerol-1-fosfato + O2 GPO H2O2 + dihidroxiacetonafosfato

Finalmente el agua oxigenada as formada produce la unin oxidativa del fenol y la 4-aminofenazona, en reaccin catalizada por la peroxidasa (POD), con formacin de una quinonimina roja. POD 2 H2O2 + 4-AF + clorofenol monoimino)fenazona + 4 H2O 4-(p-benzoquinona

REACTIVOS PROVISTOS:

Standard: solucin acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de triacilglicridos. Buffer: solucin de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5. Enzimas: Viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).

INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO: - Standard: listo para usar. - Reactivo de trabajo: 5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas. Mezclar hasta disolucin completa. Homogenizar y fechar. 4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porcin de Buffer y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar y fechar. MATERIAL REQUERIDO: - Espectrofotmetro. - Probeta, micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados. - Frasco de vidrio color mbar. - Tubos de fotocolormetro o cubetas espectrofotomtricas. - Bao de agua a 37C. - Reloj timer. PROCEDIMIENTO: Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos. En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar: Tubos Muestra Standard Reactivo de Trabajo Blanco ----1 ml Standard --10 uL 1 ml Muestra 10 uL --1 ml

Mezclar. Incubar 10 minutos en bao de agua a 37C. Enfriar y leer en espectrofotmetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua destilada.

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los clculos. Para hallar la concentracin de traciliglicridos en el suero problema, se debe utilizar el mtodo del factor de calibracin. Triacilglicridos (mg%) = M x Fc Fc = 200 / S M = Abs muestra Abs blanco S = Abs standard Abs blanco VALORES DE REFERENCIA: El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de triglicridos: Deseable: < 150 mg%. Moderadamente elevado a elevado: 150 199 mg%. Elevado: 200 499 mg%. Muy elevado: > 500 mg%.

CUESTIONARIO:

1.Describa las caractersticas principales de los lpidos y su clasificacin. 2.- Explique la importancia biolgica de los triacilglicridos. 3.Como se produce la digestin y absorcin de los tracilglicridos. 4.Mencione la proporcin de triacilglicridos dentro de las lipoprotenas y la accin de la lipasa lipoproteica. 5.Enumere los diferentes mtodos tanto qumicos como enzimticos para el dosaje de triacilglicridos.

PRACTICA N12 MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELTICA

Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo proteico (sntesis y degradacin). Las protenas en el organismo se distribuyen didcticamente en dos compartimientos: a) Compartimiento Proteico Visceral. b) Compartimiento Proteico Somtico esqueltico. Las protenas del compartimiento visceral se evalan mediante los niveles de Transferrina, Pre-albmina, Protenas totales y Albmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida (albmina es de 20 das) rinde una estimacin razonable del compartimiento proteico visceral. En esta prctica utilizaremos la Protena Total y la Albmina srica. Las protenas del compartimiento somtico esqueltico la evaluaremos mediante la relacin entre la excrecin de la creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la persona, relacin que es un fiel ndice de la masa muscular esqueltica. As mismo mediante el Peso y la Talla se evaluar la masa corporal total.

Experimento A: DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES Y ALBMINA EN SUERO

FUNDAMENTOS DEL METODO:

Determinacin de Protenas Totales: Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con mximo de absorcin a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra. Determinacin de Albmina: La albmina reacciona especficamente (sin separacin previa) con la forma aninica de la Bromo Cresolsulfon Ftalena (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albmina presente en la muestra. REACTIVOS: Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril politer (AAP). Reactivo BCF: solucin de Bromo Cresolsulfon Ftalena (en polioxietiln lauril ter). Suero Patrn: solucin de albmina y globulinas en estado nativo con ttulo conocido de protenas (Biuret Kjeldhal) y albmina (unin BCF). MATERIAL REQUERIDO: Espectrofotmetro. Micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados. Tubos de ensayo. Bao Mara a 37C. Reloj de intervalos PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES:

En tres tubos colocar:

Agua destilada Suero Patrn Muestra Reactivo EDTA/Cu

Blanco 50 uL ----3,5 ml

Standard --50 uL --3,5 ml

Muestra ----50 uL 3,5 ml

Mezclar los tubos. Incubar durante 15 minutos en bao mara a 37C. Leer en espectrofotmetro a 540 nm. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE ALBMINA:

En tres tubos colocar:

Suero Patrn Muestra Reactivo BCF

Blanco ----3,5 ml

Standard 10 uL --3,5 ml

Muestra --10 uL 3,5 ml

Mezclar los tubos. Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Leer en espectrofotmetro a 625 nm.

CALCULO DE LOS RESULTADOS: Protenas totales (g/dl) = M x fc Albmina (g/dl) = M x fc VALORES DE REFERENCIA: fc = P.T. (g/dl) / S fc = Alb. (g/dl) / S

PROTENAS TOTALES : 6,1 a 7,9 g/dl.

ALBMINA : 3,5 a 4,8 g/dl.

Experimento B: DETERMINACIN DE CREATININA URINARIA

FUNDAMENTOS DEL METODO:

La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinizacin con cido pcrico, obtenindose un cromgeno que se mide a 510 nm.

REACTIVOS: Reactivo 1: cido pcrico 41,4 mmol/l. Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4. Standard: solucin de creatinina 2 mg% MATERIAL REQUERIDO:

Espectrofotometro.

Tubos de ensayo. Micropipetas y pipetas capaces de medir los volmenes indicados. Reloj timer. PROCEDIMIENTO:

Recolectar orina de 24 horas.

Medir la diuresis, tomar una alcuota y efectuar una dilucin 1:50 de la misma. Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente: Standard Orina diluda (1:50) Agua Reactivo 1 Reactivo 2 Blanco ----1 ml 2 ml 0,5 ml Standard 0,5 ml --0,5 ml 2 ml 0,5 ml Muestra --0,5 ml 0,5 ml 2 ml 0,5 ml

Mezclar por inversin. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente. Leer en espectrofotmetro a 510 nm. CALCULO DE LOS RESULTADOS:

M Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V S Siendo: V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas. M = Absorbancia neta del tubo muestra. S = Absorbancia neta del tubo standard. VALORES DE REFERENCIA:

900 a 1,500 mg/24 horas.

VALORACIN DEL ESTADO NUTRICIONAL PROMEDIO POBLACIONAL Hombres: 830 Mujeres: 680 Hombres: 37 Mujeres: 34 7 4 DESNUTRICIN Hombres: < 660 Mujeres: < 430 Hombres: < 30 Mujeres: < 29 <6 < 3,5

Relacin CrU 24h / Talla (mg 24h/m) Relacin Peso / Talla (Kg/m) Protenas totales (g/dl) Albmina (g/dl)

CUESTIONARIO:
1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoracin nutricional de dicha persona sabiendo que es varn, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen urinario en 24 horas fu de 1000 ml. 2.- Como hubiera sido la valoracin nutricional en el caso que la persona hubiera sido mujer? 3.- Mencione las caractersticas generales de las protenas y su clasificacin. 4.- Qu son las globulinas y cules son sus clases? 5.- Describa los mtodos de dosaje tanto qumicos como enzimticos para protenas totales, albmina, globulina y creatinina.

PRACTICA N13 METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA

Base Bioqumica.La bilirrubina es un pigmento amarillo , que se produce en el ser humano a partir del Ncleo HEM ( que es una Protoporfirina Tipo IX Tetrapirrol macrocclico, molcula que tiene insertado un tomo de Hierro ).Sobre este ncleo HEM actua la enzima Oxigenasa Heme de los microsomas. Esta Oxigenasa rompe el enlace alfa meteno del anillo tetrapirrlico y se abre la molcula , conviertindose en el pigmento verde Biliverdina, el cual es subsecuentemente hidrogenado y forma Bilirrubina .Esta reduccion la realiza la enzima citoslica biliverdina reductasa que es una enzima NADPH dependiente. Por cada mol de HEME catabolizado por esta ruta se produce un mol de bilirrubina, de CO 2 y de in frrico.La produccin diaria de bilirrubina a partir de todas sus fuentes en el hombre es de 250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de la bilirrubina total producida se deriva de la molcula del HEM de la Hb liberada a partir de los eritrocitos senescentes que son destrudos en el sistema retculo endotelial del hgado, bazo y mdula sea. El 15% remanente se produce a partir de la destruccin de las clulas precursoras de los eritrocitos en la mdula sea ( llamada eritropoyesis inefectiva) y tambin proviene del catabolismo de otras protenas que contienen ncleo Hem como la mioglobina,citocromos, peroxidasas y que estn distribudas a travs de todo el organismo. Despus de su produccin en los tejidos perifricos, la bilirrubina es transportada al hgado asociada a la albmina .La Bilirrubina es rpidamente captada por los hepatocitos , se transporta y se conjuga al acido glucurnico ( UDP glucuronilo transferasa) para producir mono y diglucuronato de bilirrubina los cuales se excretan en la bilis. y despus de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los glucornidos de bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al alcalino del intestino delgado, y por la accin cataltica de la betaglucuronidasa del hgado, clulas epiteliales intestinales y las bacterias.La bilirrubina no conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaerbica intestinal para formar un grupo de tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados Urobilingenos que luego se reducen y forman tres productos: estercobilingeno, mesobilingeno y urobilingeno.Hasta el 20% de los

urobilingenos producidos diariamente son reabsorvidos desde el intestino hacia la circulacin pra ir al hgado(Circulacin entero.heptica). La mayor parte del urobilingeno reabsorvido es capatado por el hgado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2 a 5 % entra a la circulacin general y aparece en la orina. En la parte mas baja del tracto intestinal, los tres urobilingenos se oxidan espontneamewnte y producen los pigmentos estercobilina,mesobilina y urobilina, y as estos pigmentos adquieren color marrn y que son los pigmentos que le dan color a las heces. Existen enfermedades congnitas y enefermedades adquiridas que afectan uno mas de los pasos involucrados en la produccin,capatacin, depsito,metabolismo y excrecin de la bilirrubina y la hiprbilirrubinemia es frecuentemente el resultado de estos transtornos.Esta bilirrubinemia puede ser a predominio No conjugado( Indirecta ) Conjugado( Directa) dependiendo del tipo de desorden. La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre excede de l mg % , existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede deberse a la produccin de mas bilirrubina de la que el hgado normal puede excretar o a la insuficiencia de un hgado daado para excretar la bilirrubina producida en cantidades normales. Ante la ausencia de dao heptico, la obstruccin de los conductos excretorios del hgado , previniendo la excrecinde la bilirrubina, tambin causar hiperbilirrubinemia. En todos estos transtornos , la bilirrubinase acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta concentracin( aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los tejidos los cuales adquieren color amarillo, este transtorno se denomina ictericia. La concentracion de bilirrubina en el suero es de gran valor , por eso en la presente practica la emplearemos. Estado NORMAL Iictericia Hemoltica Hepatitis Ictericia Obstructiva Bilirrubina Srica Mg% Conjug: 0.1 a 0.4 mg No Conjug 0.2 a 0.7 Elevac.No Conjug Elevacines de Ambas,con pred.Conjug Elecvacin de ambas a predominio Conjugada Urobilinogeno Bilirrubina Urobilingeno Urinario Urinaria fecal 0.a 4 mg/24 hs Aumentado Disminudo Ausente Ausente Ausente Presente Prresente 40 a 280 mg/ 24 hs Aumentado Disminudo Escaso o ausente

Dentro de las causa de Ictericia Hemoltica tenemos: Anemias hemolticas,ictericia fisiolgica neonatal( Inmedurez heptica para captacin, conjugacin y secrecin de la bilirrubina), Sindrme de Crigler-Najar ( Alteracin de la conjugacin de bilirrubina),Enfermedad de Gilbert,Hiperbilirrubinemia txica(Agentes farmacolgicos).

Experimento A: DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA FUNDAMENTO: El suero sanguneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanlico + Nitrito de sodio) y se produce un complejo coloreado de color rojo violceo debido a la presencia de bilirrubina conjugada al ac. glucurnico (Directa) color que desarrola directamente.. La Bilirubina no conjugada (Indirecta) requiere adems la presencia de cafena alcohol metlico para que se desarrolle el color . Entonces para obtener la produccin de color debido a ambas bilirrubinas debemos aadir cafena metanol y tendremos la produccin de un color debido a la suma de ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparados espectrofotomtricamente con el color producido por una solucin standard de bilirrubina de concentracin conocida. REACCTIVOS NECESARIOS: - Acido Sulfanlico en medio cido - Solucin acuosa de nitrito de sodio - Alcohol metlico solucin de cafena amortiguada - Agua destilada - Standard de Bilirrubina - Preparacin de reactivo Diazo( Sol. Nitrito de sodio + Sol cido sulfanlico), segn intrucciones del profesor. - Muestras problema
METODOLOGIA.Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados ,segn la siguiente tabla: Tubo Blanco (B) 200 uL 2,5 ml --200 uL --Tubo Bilir Directa (D) 200 uL 2.5 ml ----200 uL Tubo Bilir Total (T) 200 uL --2.5 ml --200 uL Tubo Standard de Bilirrubina (mg %) ----2,5 ml --200 uL 200 uL

Reactivos
Muestra (suero) Agua destilada Sol Cafena Acido Sulfanlico Reactivo Diazo Standard

Mezclar de inmediato, cada tubo por inversin. Reposo 5 minutos a temperatura ambiente. Lectura en espectrofotmetro en 530 nanmetros, colocando el espectrofotmetro en cero de Absorbancia con Agua destilada. Anotar los resultados de cada lectura. CALCULOS: Bilirrubina Total mg% Bilirrubina Conjugada (Directa) mg % = ( T - B ) x Factor = ( D B ) x Factor

Bilirrubina No Conjugada(Indirecta Libre) = (Bilirrub.Total Bilirrub.Directa) VALORES DE REFERENCIA: - Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/% Total: hasta 1.0 mg/% Recin nacidos =

Nacidos a trmino Prematuros Sangre de cordn 2.5 mg% Hasta las 24 horas 6.0 mg% 8.0 mg% Hasta las 48 horas 7.5 mg% 12.0 mg% Del 3 al 5 da 12.0 mg% 24.0 mg% Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan ms en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez heptica

Experimento B: INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA

El Urobilingeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se encuantra en todas las orinas normales en muy pequeas cantidades, menores de 4 mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos sealado en las clases tericas por la accin de las bacterias sobre los los pigmentos biliares excretados por el hgado.Tambin dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es reabsorvida sino que : o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma en UROBILINOGENO ( y derivados asociados) por accipn de las bacterias del colon. El urobilingeno se puede reabsorver en el intestino delgado (leon ) y en el colon y pasa a la circulacin portal , llega al Hgado y all se re-excreta a la bilis y el resto llega al rin y se excreta con la orina . Cuando existe una alteracin en la captacin y excrecin heptica de urobilingeno ( como en la enfermedad hepatocelular) la sntesis de bilirrubina como en la hemlisis, la excrecin diaria del urobilingeno aumentar en forma significativa Por el contrario,si no pasa bilis al intestino, como en la colostasis u obstruccin biliar extraheptica interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y ocasiona un descenso notable en la produccin y excrecin urinaria del urobilingeno. Entonces, la medida del urobilingeno en la orina resulta muy til para diferenciar las posibles causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstruccin completa de los conductos biliares, la urobilina estar ausente en la orina. La excrecin se incrementar en todas aquellas condiciones en que exista una excesiva destruccin de los eritrocitos y en aquellos casos de dao parcial del parnquima heptico. En las nefritis muy avanzadas puede estar ausente la Urobilina Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigacin de Urobilingeno en orina (Mtodo Cualitativo).: Esta prueba se basa en la reaccin entre el urobilingeno y el reactivo de paradimetil aminobenzaldehido,para rendir un complejo coloreado rojo cereza Reactivo de Ehrlich: Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de agua y y 75 ml de HCl concentrado.

Procedimiento:A 2 ml de orina en un tubo de prueba , aadirle 0.5 ml del Reactivo de Ehrlich y mexclar bien. Observar el color de la mixtura. Interpretacin. Cantidades normales de Urobilingeno en la orina no producirn color. Cantidades aumentadas(patolgicas) del piegmento urobilingeno producirn un color rojizo cereza que se observa bien mirando el tubo desde arriba del tubo(boca del tubo) contra un fondo blanco. En la actualidad usamos para la investigacin de Urobilina en orina el mtodo de las tiras reactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas cintas estn impregnadas en el rea correspondiente de una sal de metoxibenceno diazonio estable que produce con el urobilingeno, casi instantneamente un complejo de color rojo azoico.Se considera normal que en la zona reactiva para urobilingeno no se produzca decoloracin alguna o que los colores que aprezcan sean mas claros que los observados para l mg % .Esta prueba es especfica para el urobilingeno.

CUESTIONARIO:

1.- Explique la formacin de la bilirrubina.

2.- En que casos se produce una elevacin de la bilirrubina total , tanto a expensas de la bilirrubina directa como de la indirecta. 3.- Como se forma el urobilingeno y qu importancia tiene? 4.- Qu es la ictericia y como se evala. 5.- Cules son los mtodos conocidos para el dosaje de bilirrubina.

PRACTICA N 14 TRANSAMINACION
IMPORTANCIA CLINICA: Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, en una de las ms importantes reacciones del metabolismo proteico. El inters clnico est centrado especialmente en dos de ellas: TGO (transminasa glutmico oxalactica) y TGP (transaminasa glutmico pirvica). Estas enzimas tienen accin eminentemente intracelular, por lo que la actividad srica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad ser evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran, de los cuales resultan particularmente importantes corazn e hgado. Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de la TGO, debido a la liberacin al torrente sanguneo de esta enzima, tan abundante en msculo cardaco. En este caso no existir aumento en la actividad srica de TGP ser mnimo. En hepatitis virales y otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis de tejido, habr un incremento considerable de la actividad srica de transaminasas, incluso antes de la aparicin de sntomas clnicos como ictericia. En este caso, la TGP ser la enzima predominante debido a su gran concentracin en el tejido heptico. Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse tambin en traumas accidentales o quirrgicos y en distrofias musculares y algunas miopatas. FUNDAMENTOS DEL METODO: Una reaccin de transaminacin consiste en la interconversin de un grupo amino (NH2-CH-COOH) de un aminocido, con un grupo cetnico (O=C-COOH) de un cetocido. Este intercambio est catalizado por enzimas conocidas con el nombre de transaminasas. En el suero humano, por lo general, se

determinan dos tipos principales: la Glutmico Oxalactica (TGO) y Glutmico Pirvica (TGP).

Ellas catalizan las siguientes reacciones:

TGO l-aspartato + -cetoglutarato TGP l-alanina + -cetoglutarato

oxalacetato + glutamato piruvato + glutamato

El oxalacetato y el piruvato as formados, reaccionan con el reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4 DNFH), generando fenilhidrazonas, las cuales en medio alcalino (NaOH) producen un complejo coloreado cuya intensidad es proporcional a la actividad enzimtica de transaminasas en la muestra.
REACTIVOS: 1.- Sustrato TGO: Solucin conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfacetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.

2.- Sustrato TGP:Solucin conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2 mmol/l de alfa-

cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4. 3.- Reactivo 2,4-DNFH: Solucin conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en cido clorhdrico 1 mmol/l. Esta solucin es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro. 4.- Standard de Calibracin: Solucin de piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de calibracin. Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva de TGO. 5.- Hidrxido de Sodio para Enzimas: Solucin de hidrxido de sodio 4 mol/l Antes de usarse, se deber diluir el contenido de este frasco a 1 litro de agua destilada para as alcanzar la concentracin requerida de NaOH 0.4mol/l. Es importante notar que el hidrxido de sodio debe conservarse en frasco de plstico y no de vidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los vapores pueden contaminar ambos reactivos.

EXPERIMENTO A DETERMINACIN DE TRANSAMINASAS (TGO Y TGP) EN SUERO

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO TGP EN SUERO: Preparar los tubos: Blanco Muestra Sustrato (TGO TGP) 0.5 ml 0.5 ml Colocar en bao de agua a 37C unos minutos y luego agregar: Muestra (suero) --100 Ul Agua destilada 100 uL --Mezclar por agitacin suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar: Reactivo 2,4-DNFH 0.5 ml 0.5 ml Mezclar. Dejar 10 minutos a 37C. Luego agregar: NaOH 0.4 mol/l 5 ml 5 ml Mezclar por inversin y retirar del bao. Despus de 2 minutos leer en el espectrofotmetro a 505 nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua destilada. Nota: Para el clculo de resultados se debe emplear una curva de calibracin. ( Ver experimento B)

EXPERIMENTO B
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN PARA TRANSAMINASAS
Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de calibracin para TGO y otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones: Pipetear en dos series de tubos: Tubo Agua destilada (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Sustrato (ml) 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.50 Standard de calibracin (ml) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.50 TGO (U/l) 0 7 12 20 28 37 48 81 --TGP (U/l) 0 9 18 25 37 46 56 79 113

I
II III IV V VI VII VIII IX

Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibracin de TGO y sustrato TGP para la curva de calibracin de TGP, respectivamente. Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH. Mezclar. Incubar 10 minutos a 37C.

Agregar 10 ml de hidrxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.

Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer. Leer la tramitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El color es estable durante solo 30 minutos. Restar a cada lectura la obtenida con el tubo N1, obtenindose las Absorbancias Netas. Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje vertical, y en el eje horizontal las U/l de TGO TGP segn sea el caso, que se indica en la tabla superior. Determinar en el grfico los puntos correspondientes a cada tubo. Unindolos se obtienen las curvas respectivas para TGO y TGP. Tener en cuenta que para cada tcnica debe utilizarse el grfico correspondiente. VALORES DE REFERENCIA: Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si bien se han hallado individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de transaminasas que se encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse sospechosos.

CUESTIONARIO:

1.- Explique en que consiste el fenmeno de transaminacin y donde se realiza en el organismo? 2.- Que relacin existe entre las transaminasas y las enfermedades hepticas? 3.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio? 4.- Seale cules son los mtodos de anlisis conocidos para dosaje de transaminasas? 5.- Existe variacin de transaminasas con la edad?

PRACTICA N 15 BALANCE NITROGENADO

El objetivo de esta prctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el Balance Nitrogenado. Explicaremos los parmetros mas representativos de la excreta nitrogenada en general. Se evala los egresos de N mediante el nitrgeno ureico urinario en 24 horas y la excrecin de nitrgeno creatinnico urinario en 24 horas empleando la frmula de nitrgeno total estimado (NTE), segn Ramrez Velasco. FORMULA : BN = INGESTA N (NTE + 2) NTE = N. UREICO + N. CREATININICO Excrecin fecal : 2 gr/24 horas. N Ingerido: gr de protenas/6.25 Nota: Si el paciente presenta albuminuria, aadir a la excreta: Protena urinaria/6.25

EXPERIMENTO A : DETERMINACIN DE CREATININA URINARIA

La creatinina se forma endgenamente en el metabolismo muscular y es removida de la sangre por filtracin glomerular y excretada en la orina sin ser reabsorbida en los tbulos. Por lo tanto, es el rin el que regula, como nico rgano excretor, el nivel de creatinina en la sangre. Si se restringe la funcin renal aumenta la creatinina en el plasma, proporcionalmente a la lesin orgnica. Un aumento continuo aunque escaso del nivel de creatinina en suero debe considerarse como un

signo de pronstico desfavorable, ya que puede tratarse de una irreparable restriccin de la funcin renal. Como se forma en el organismo, los factores exgenos no pueden influir su nivel srico. Por este motivo la determinacin simultnea de la creatinina en suero y orina permite el clculo del clearence o depuracin de creatinina y representa un mtodo excelente de la medida de la filtracin glomerular.

FUNDAMENTOS DEL METODO: En un medio alcalino que contiene picrato, la creatinina presente en la muestra, reacciona con ste formando un complejo rojizo, cuya mayor absorcin se d a 530 nm. Creatinina + picrato picrato REACTIVOS: Reactivo 1.- Solucin de cido pcrico 0.05M Reactivo 2.- Solucin de hidrxido de sodio 0.75N PROCEDIMIENTO: Recolectar orina de 24 horas. Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada. Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera los 2000 ml la prueba debe realizarse sin diluirla, pero en el momento de realizar los clculos en vez de multiplicar el resultado por 2000, debe multiplicarse por el volumen total (ml). Preparar los siguientes tubos: Orina diluida Standard Agua Reactivo 1 Reactivo 2 Blanco (ml) ----2.5 3.5 1.0 Standard (ml) --1.0 1.5 3.5 1.0 Muestra (ml) 0.02 --2.5 3.5 1.0 Complejo creatinina-

Mezclar bien. Despus de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud de onda de 530 nm contra el blanco. CALCULOS:

Abs muestra Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000 Abs standard VALORES NORMALES: 500 1500 mg/24 h. Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrgeno creatinnico.

EXPERIMENTO URINARIA

DETERMINACIN

DE

UREA

El producto final ms importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es excretada en la orina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia. Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada funcin excretora y por consiguiente de la funcin renal. La urea sangunea puede aumentar por otras razones adems de excrecin renal insuficiente, dichas causas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales se altera la circulacin por el rin y Postrenal por obstruccin de las vas urinarias. Por ello la informacin ms exacta con respecto a la habilidad excretora de la urea por los riones requiere de una comparacin de la concentracin de urea en sangre (BUN) y en la orina. Fisiolgicamente la urea se eleva debido a una dieta hiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo valor proteico. FUNDAMENTOS DEL METODO: La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amonaco y dixido de carbono, mediante una reaccin catalizada por la enzima ureasa: Ureasa

Urea + H2O

CO2 + 2 NH3

El amonaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio formando azul de indofenol. La intensidad de color azul es proporcional a la cantidad de urea en la muestra. REACTIVOS: Reactivo 1.- Solucin de fenol y nitroprusiato de sodio. Reactivo 2.- Solucin de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625N Enzima.- Solucin de ureasa.

PROCEDIMIENTO: Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada. Preparar los siguientes tubos: Blanco (ml) ----2 gotas Standard (ml) 0.01 --2 gotas Muestra (ml) --0.01 2 gotas

Standard Orina diluida Enzima

Mezclar e incubar los tubos en un bao mara a 37C por 5 minutos. Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos. Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del Reactivo 2. Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un bao de agua a 37C por 5 minutos. Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo. Mezclar los tubos por inversin y proceder a leer la absorbancia en un espectrofotmetro a 540 nm vs el blanco. CALCULOS: Abs muestra Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilucin Abs standard Urea x 0.466 = Nitrgeno ureico.

Dato:

VALORES NORMALES: Nitrgeno ureico.- 7 a 14 gr/24 hrs. Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs. BN = Ingesta nitrogenada (N ureico + N creatinnico + 2) BN = ...................... gr/24 hrs.

CUESTIONARIO:

1.Con los datos obtenidos en la prctica , calcular el balance nitrogenado del paciente sabiendo que ingiri 8 gr de protenas en 24 horas . 2.- De donde proviene la creatinina? 3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae? 4.- A que se llama BUN y que representa?

5.- Para que sirve la depuracin de creatinina en orina de 24 horas? 6.- Que mide el ndice Creatinina Urinaria 24 hs/ Talla, y porqu.