Anda di halaman 1dari 11

7 Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi

Posted on 22 November 2010 (http://belalangtue.wordpress.com/2010/11/22/pemotonganmolekul-dna-menggunakan-enzim-restriksi/) Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen yang Terpotong Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA olimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya. Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 1). Berikut adalah Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5- GAATTC-3. Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).

Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda.

Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5 atau ujung 3 yang menggantung. Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Teknik ini tergantung oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%.

Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern hybridization. Adapun tahapannya yaitu: 1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membran nilon. 2. Menyediakan hybrization probe. Sekuens molekul DNA yang komplementer dengan DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan autoradiography.

4 Biologi oleh Neil A, Campbell, Jane B, Reece, Lawrence G, Mitchell .Jakarta , Erlangga 2002 ( halaman 390) Enzim Restriksi digunakan untuk membuat DNA rekombinan Pengklonan gen dan rekayasa genetik telah digunakan oleh penemuan enzim yang bisa memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang jumlahnya terbatas. Enzim ini, disebut enzim restriksi ditemukan dalam bakteri pada akhir tahun 1960-an. Di dalam, enzim ini melindungi bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain, seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA asing,suatu proses yang disebut restriksi.Sebagian besar enzim restriksi ini sangat spesifik, mengenali urutan nukleotida pendek dalam molekul DNA dan memotong pada titik tertentu di dalam urutan. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil (-CH3) pada adenin atau sitosin di dalam urutan yang dikenal oleh enzim restriksi tersebut. Ratusan enzim telah diidentifikasi dan diisolasi , dan banyak yang telah teersedia secara komersial.

2 http://sciencebiotech.net/tag/genetic-engineering/ Kita harus berterima kasih kepada para bakteri dan archaea karena umumnya mereka memiliki gunting berupa enzim yang dapat memotong-motong DNA secara spesifik. Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahanan bakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri. DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidak akan membahayakan

bakteri lagi oleh enzim yang disebut Restriction Endonuclease (sering disebut enzim restriksi). DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga akan terhindar dari pemotongan. Suatu sistem pertahanan yang sangat cerdas untuk makhluk sekelas bakteri. Sedangkan lem DNA secara alami terdapat baik pada eukaryota maupun prokaryota. Secara komersial, enzim ini diperoleh dari virus tertentu seperti bakteriofage T4 yang memiliki enzim ligase yang dapat menyambungkan gugus -OH pada suatu utas DNA dengan gugus PO4 pada utas lainnya membentuk ikatan phosphodiester. Enzim ini pada dasarnya berfungsi untuk memperbaiki kerusakan-kerusakan pada kromosom. Nah, para ilmuwan rekayasa genetika telah berhasil mengisolasi ratusan jenis gunting untuk memotong-motong DNA dan lem DNA untuk menyambungkan kembali hasil potongan tersebut sehingga diperoleh DNA dengan susunan tertentu.
Restriction Endonuclease

DNA tersusun atas empat basa nukleotoda yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). Lihat kembali artikel tentang DNA . Enzim restriksi (dalam hal ini adalah Restriction Endonuclease Type II) alias gunting DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:
5'-GATATC-3' :::::: 3'-CTATAG-5'

Baik di utas atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5 ke 3)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja. Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG, enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya. Cara pemotongan DNA pun tidak sembarangan, masing-masing enzim punya titik pemotongan tertentu yang khas. Misalnya BamHI yang mengenali situ GGATCC akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang tidak berpasangan (cohesive atau sticky ends).
5'-G : 3'-CCTAG GATCC-3' : G-5'

Sedangkan enzim PovII yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):
5'-GGA ::: 3'-CCT TCC-3' ::: AGG-5'

Ada sekitar 600 enzim restriksi yang tersedia secara komersial saat ini. Berikut ini beberapa contoh enzim restriksi beserta situs pemotongannya.

List of Restriction Enzyme (Image from ncbi.nlm.nih.gov)

Situs Pengenalan dan Pemotongan Enzim Restriksi (Image from ncbi.nlm.nih.gov) Penamaan enzim restriksi

Huruf pertama adalah singkatan nama genus bakteri pemilik enzim tersebut Huruf kedua dan ketiga adalah singkatan nama spesies bakteri. Huruf keempat adalah dingkatan nama Strain. Huruf kelima adalah urutan penemuan enzim tersebut.

Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan lain-lain.

Beberapa Sifat Khusus Enzim Restriksi Isochizomer

Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda. Misalnya HpaII (situs pengenalan: CCGG) dan MspI (situs pengenalan: CCGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGGCCT) dan StuI (AGGCCT).
Neoschizomer

Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGTC) dan ZraI (situs pengenalan: GACGTC). Tabel yang berisi daftar isoschizomer dan neoschizomer dapat ditemukan di situs NEB (New England Biolabs).
Kompatibilitas Ujung Overhang

Ada beberapa enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan berbeda tetapi hasil pemotongannya memiliki ujung overhang yang sama. Misalnya AccIII (TCCGGA) dengan AgeI (ACCGGT) yang menghasilkan ujung overhang CCGG. Sifat ini sangat penting dalam aspek rekayasa genetika, terutama bila fragmen DNA yang akan kita klon memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang berbeda dengan vektornya. Asalkan hasil pemotongan memiliki ujung overhang yang sama maka proses ligasi dapat dilakukan kemudian.

3
Bikomia kedokteran dasar Joko suyono, vivi sadikin, lydia I, mandera , penerbit EGC jakarta tahun 2000 cetakan 1 hal 237-240 Teknik DNA rekombinan Untuk memahami mengapa gen dari satu individu berbeda dari individu lain bagaimana memanfaatkan perbedaan ini untuk mendiagnosis penyakit paling sedikit diperlukan pemahaman dasar mengenai teknik DNA rekombinan.

Strategi unutk memperoleh salinan Gen atau Fragmen DNA Fragmen Restriksi Enzim yang disebut sebagai endonuklease restriksi (restriction endonucleases) memungkinkanpara ahli biologi molekular memutuskan segmen DNA dari genom berbagai jenis se atau untuk memperoleh fragmen DNA yang berasal dari sumber lain. Enzim restriksi adalah suatu endonuklease yang mengenali uutan pendek DNA, biasanya panjangnya 4-6 pb (pasanagn basa), dan memutuskan kedua untai DNA di urutan tersebut. Sifat utama enzim restriksi adalah spesifitasnya, enzim ini selalu memutuskan urutan DNA yang sama dan hanya memutuskan di urutan tertentu. Sebagian besar urutan DNA yang dikenali oleh enzim restriksi adalah palindrom yaitu kedua untai DNA memiliki urutan basa yang sama apabila dibaca dalam arah 5 ke 3. Potongan yang dibuat oleh enzim ini mungkin tumpul/blunt (sehingga produk yang dibentuk beruntaidanda diujungnya) atau lengket/sticky (sehingga produk yang dihasilkan beruntai tunggal diujungnya) .

Fragmen resttriksi DNA yang dapat membentuk pasangan basa satu sama lain apabila fragmen tersebut memiliki ujung lengket yang bersifat komplementer. Oleh karena itu, dua frgamen DNA yang tidak berhubungan dapat membentuk pasangan basa satu sama lain apabila keduanya diputuskan oleh enzim restriksi yang sama. Setelah fragmen-fragmen tersebut membentuk pasangan basa, ujung-ujungnya digabungkan secara kovalen oleh kerja DNA ligase. Oleh karena itu penggunaan enzim restriksi bersamaan dengan DNA ligase dapat menghasilkan DNA rekombinan

atau kimerik ( chimeric) yaitu molekul DNA yang direkombinasikan in vitro ( dalam kaca, yaitu dalam tabung reaksi)

Teknik untuk mengindetifikasi urutan DNA 1. Probe Probe adalah DNA untai tunggal yang dapat membentuk pasangan basa dengan urutan komplementer pada polinukleotida untai tunggal lain yang tersusun dari DNA atau RNA. Proses ini dikenal sebagai penyatuan kembali (reannealing) atau hibridasi. Untuk mengidentifikasi urutan sasaran , probe harus membawa suatu label. Apabila probe membawa label radioaktif misalnya 32P, probe dapat dideteksi dengan autoradiografi. Dibuat autoradiogram dengan membungkus bahan yang mengandung probe dengan selembar film sinar X, elektron yang dipancarkan akibat kehancuran (disintegrasi) atom radioaktif menyebabkan film terpajan tepat diatas probe. Probe dapat terdiri dari cDNA (dihasilkan dari mRNA oleh reverse transcriptase) fragmen DNA genom (diputuskan dari genom oleh enzim restriksi) oligonium kleotida yang disintesis secara kimiawi atau kadang-kadang , RNA. Terdapat sejumlah teknik untuk memasukan label kedalam probe tersebut. Tidak semua probe diberi label radioaktif. Sebagian adalah produk kimia tambahan (adduct) senyawa yang berikatan secara kovalen dengan DNA yang dapat diidentifikasi misalnya dengan fluoresens. 2. Elektroforesis gel Gel elektroforesis adalah suatu teknik yang menggunakan medan listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan ukuran, karena mengandung gugus fosfat yang bermuatan negatif, didalam medan listrik DNA akan bergerak menuju elektroda positif. Molekul yang lebih pendek bermigrasi lebih cepat melalui pori-pori gel daripada molekul yang lebih panjang, sehingga pemisahan didasarkan pada panjang. Gel yang tersusun dari poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA yang perbedaan panjangnya hanya satu nukleotida dan digunakan unutk memisahkan fragmen DNA yang memiliki perbedaan ukuran lebih besar. Pita DNA pada gel dapat dilihat dengan berbagai teknik, pemberian zat warna misalnya etidium bromida menungkinkan visualisasi langsung semua pita DNA di bawah sinar ultra violet. Urutan spesifik biasanya dideteksi dengan probe berlabel.

3. Deteksi urutan DNA spesifik

Unutk mendeteksi urutan spesifik , DNA biasaanya dipindahkan ke suatu peyokong yang padat, misalnya selembar kertas nitroselulosa apabila bakteri ditumbuhkan pada suatu lempeng agar, sel dari masing-masing koloni akan melekat ke lembar kertas nitroselulosa yang ditekankan ke agar tersebut. Teknik yang serupa digunakan untuk memindahkan pita DNA dari gel elktroforetik ke lembrat nitroselulosa. Setelah koloni dipindahkan ke selembar nitroselulosa,kertas diberikan larutan basa, dalam hal ini dimana DNA dipisahkan sari gel agarosa, gel juga diberi suatu larutan basa. Larutan basa menyebabkan denaturasi DNA yaitu pemisahan kedua untai dari masing-masing heliks ganda. DNA untai tunggal dapat di hibridasikan dengan suatu probe dan dapat dilakukan identifikasi terhadap bagian-bagian pada kertas nitroselulosa yang mengandung DNA yang membentuk pasangan basa dengan probe.

6
Genetika , 2007 erlangga, schaums outlines Elord SL . Stansfield WD. Jakarta halmn 274 Nuklease adalah enzim-enzim yang menghidrolisis atau mematahkan ikatan-ikatan fosfodiester yang menggabungkan nukleotida-nukleotida. Nuklease yang menyingkirkan nukleotida-nukleotida terminal satu demi satu disebut eksonuklease : yang mematahkan tulang punggung gula fosfat pada situs-situs nonterminal disebut endonuklease. Fdeiksiribonuklease (Dnase) menyerang molekul-nolekul DNA , ribonuklease (RNase) mendegradasi molekul-molekul RNA terutama di daerah-daerah beruntai tunggal. Sejumlah endonuklease bekerja secara spesifik , memotong ikatan-ikatan fosfodiester pada sekuens-sekuens nukleotida berbeda secara acak. Endonuklease lain misalnya restriksi endonuklease mematahkan ikatan-ikatan hanya pada sekuens DNA spesifik, yang disebut situs pengenalan. Ada tiga kelas restriksi endonuklease : Tipe I, Tipe II, Tipe III. Tipe I dan Tipe III tidak memiliki sifat-sifat yang berguna bagi teknologi DNA rekombinan , enzim Tipe II mengenali dan berikatan ke sekuens DNA beruntai ganda yang spesifik. Bekitu terikata, enzim memotong tulang punggung fosfodiester pada masing-masing untai situs tersebut. Situs pengenalan enzim tersebut bersifat simetris dan umumnya terdiri dari 4-8 pasangan basa yang bbisa tidak terputus ( misalnya GAATTC ) ataupun terinterupsi (misalnya CANTG ,dimana N adalah basa apapun). Simetri itu terjadi disekitar titik tengah atau sumbu simetri, sehingga menbentuk untaian-untaian DNA bderlawanan dengan sekuens basa terbalik disebut palindrom. Enzim itu terdapat secara

alamiah di dalam bakteri, dan ratusan enzim telah diisolasi dan dikarakterisasi serta tersedia untuk digunakan oleh para perekayasa genetik. Dengan demikian , enzim tipe II adalah yang paling umum digunakan dalam teknologi DNA rekombinan saat ini. Di alam enzim restriksi berperan dalam melindungi bakteri dari serangan asam-asam nukleat asing, misalnya virus. Sistem enzim restriksi sel bakteri inang bisa mengenali DNA penyerang sebagai benda asing dan meghancurkannya, DNA inang dilindungi oleh modifikasi-modifikasi pasangan basa spesifik yang dilakukan oleh enzim-enzim metilase spesifik inang. Dengan demikian enzim restriksi bekerja sama dengan enzim pemodifikasi dan sistemnya disebut sistem restriksi modifikasi.