Laporan Praktikum Mikrobiologi

Nama NIM Kelompok Hari/Tanggal Waktu PJP Asisten TEKNIK MOLEKULER

: Vivin Buldan Sy. : J3L211184 :9 : Jumat, 21-12-2012 : 07.00 - 09.00 WIB : M. Arif M, S.Pi : Ebta B.

UNTUK PROSES IDENTIFIKASI MIKROBA

Data dan Pembahasan Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain ytang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secra kimiawi. Jika dengan cara mekanik bisa dilakukan dengan memblender atau menggerus dengan menggunakan mortar dan pistil. Teknis pengisolasian DNA dengan kit komersial pertama-tama adalah satu ml suspensi kultur murni mikroba spesifik yang terdapat dalam media HIB atau sampel susu UHT dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan dengan 1 ml CTAB sebagai suatu modifikasi metode dari prosedur yang ditunjukkan pada handbook produsen kit, kemudian divortex hingga homogen. Suspensi tersebut disentrifus selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm dan supernatan yang dihasilkan dibuang sehingga menyisakan pelet pada tabung mikrosentrifus. Jika tidak dihasilkan pelet, maka suspensi disisakan sebanyak 200 l supernatan pada tabung mikrosentrifus. Kemudian ditambahkan proteinase K sebanyak 30 l ke dalam tabung mikrosentrifus, dan dihomogenkan dengan vortex kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65oC. Setelah itu, ditambahkan buffer AL sebanyak 300 l dan dihomogenkan dengan vortex. Suspensi diinkubasi selama 10 menit di dalam water bath pada suhu 65oC. Setelah itu, ditambahkan 500 l etanol (96-100%), dihomogenkan dengan vortex dan disentrifus selama 2 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Supernatan yang

dihasilkan dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom mini yang sudah dipasang pada collection tube, kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Sebanyak 500 l buffer AW1 ditambahkan ke dalam kolom mini yang masih terpasang pada collection tube dan disentrifus 8000 rpm selama 1 menit (Yuwono 2006). Fungsi dari penambahan alkohol atau etanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu alkohol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan (Jamilah, 2005). Alkohol yang digunakan pada praktikum ini adalah alcohol 96%. Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air. Fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena pada garam ini memang dapat menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi. Penambahan garam juga dapat digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir dengan kutub negatif fosfat DNA. Dalam hal ini penambahan garam bisa dikatakan dapat membantu dalam hal pemekatan DNA. Selain itu, garam atau NaCl memegang peran penting yang lain untuk menghilangkan protein dan karbohidrat atau sebagai buffer karena garam dapat menyebabkan kedua terpresipitasi dan bersama sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer (Jamilah 2005). Tahap selanjutnya adalah kolom mini dipindahkan ke dalam collection tube yang baru dan ditambahkan dengan 500 l buffer AW2 ke dalam kolom mini, kemudian disentrifus 13000 rpm selama 3 menit. Kolom mini dipindahkan kembali ke dalam collection tube dan disentrifus kembali selama 1 menit 13000 rpm. Kolom mini dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifus steril dan ditambahkan ke dalamnya sebanyak 80 l buffer AE yang kemudian disentrifus 8000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh pada tabung mikrosentrifus merupakan isolat DNA yang akan digunakan pada tahap selanjutnya dan isolat tersebut disimpan pada freezer dengan suhu 20oC (Yuwono 2006).

Langkah awal saat PCR adalah mempersiapkan master-mix (MM). Komposisi dalam master-mix yaitu : dH2O (steril) Forward primer (5 M)* Reverse primer (5 M) ** dNTP (2,5 mM) Buffer (10 x) Taq DNA Polymerase MgCl2 15.1 l 1 l 1 l 2.5 l 2,5 l 0,2 l 2.0 l Master mix (MM) dibuat di dalam satu tabung eppendorf 1.5 l. Volume stok dikalikan sebanyak sampel yang akan diuji ditambah dengan kontrol positif dan kontrol negatif. Selanjutnya disiapkan dan diberi kode tabung PCR (200 l). Distribusikan MM ke dalam tabung tersebut dengan volume masing-masing 24.5 l/tabung. Tahap terakhir template yaitu ekstraksi DNA dimasukkan ke dalam masing-masing tabung PCR. Tabung eppendorf dimasukkan ke dalam mesin PCR dan atur program sesuai suhu reaksi untuk primer yang digunakan. Tahapan proses identifikasi yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi atau elongasi serta elekroforesis. Pada tahap denaturasi, molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94oC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat. Tahap penempelan (Annealing), enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang rendah sekitar 55 0C selama 30-60 detik. Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida (Sulandari 2003). Elekroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya (Sulandari 2003). Pembuatan gel agarosa untuk elektroforesis, gel agarose 1,5 % dibuat dengan cara melarutkan agarosa dengan larutan bufer TAE atau TBE dan dipanaskan dengan microwave selama lebih kurang 1 menit. Setelah gel agarosa memadat, gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE. Sebanyak 10 l produk PCR ditambahkan dengan 2 l loading dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder sebagai marker untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 80 volt selama 35 menit. Gel agarosa diwarnai dengan larutan etidium bromida (10 mg/L) selama 10 menit. Tahap ini sering dikenal dengan staining gel (pewarnaan gel). Tahap selanjutnya adalah destaining gel (penghilangan warna gel). Tahap ini dilakukan dengan perendaman di dalam air selama lebih kurang 10 menit. Gel agarosa selanjutnya divisualisasi dengan chemidoc gel system (Sulandari 2003).

Gambar 1 Pola MS-PCR produk (Charalsawadi et. al 2005) Keterangan : - promotor FMR 1 (fragile X mental retardation) unmethylated (PU), 318 bp - promotor FMR1 alkohol (PM), 288 bp

- promotor XIST alkohol (XM) 241 bp - promotor XIST unmethylated (XU), 198 bp. - Jalur 1 100 bp penanda - Jalur 2 laki-laki normal - Jalur 3 premutation laki-laki - Jalur 4 laki-laki mutasi penuh - Jalur 5 laki-laki dengan mosaik premutation dan mutasi penuh (keberadaan dari kedua PU dan produk PM) - Jalur 6 perempuan - Jalur 7 H2O Metilasi DNA memainkan peran penting dalam peraturan epigenetik ekspresi gen. Pada manusia, metilasi hampir secara eksklusif sitosin mendahului guanosin (CpG) dalam urutan DNA. CpG hampir selalu ditemukan dalam promotor dari gen dan biasanya tidak dimetilasi. MS-PCR telah dikembangkan untuk mengandalkan modifikasi diferensial alkohol dan genomik yang tidak dimetilasi DNA dengan bisulfit natrium dan selanjutnya amplifikasi PCR. Hal ini karena PCRbased, metode yang memiliki sensitivitas yang lebih tinggi daripada analisis Southern blot, yang membuatnya lebih berguna untuk deteksi metilasi dalam jumlah kecil sampel DNA seperti untuk diagnosis prenatal dan dalam kasusmosaicisms (PM / FM atau Normal / PM). Namun, MSPCR tersebut tidak dapat digunakan untuk wanita, karena random X-inaktivasi, metode ini tidak dapat membedakan PM atau FM perempuan dari wanita normal yang memiliki pola yang sama (Gambar 1). Namun, mayoritas kasus FXS adalah laki-laki, sehingga pembatasan ini tidak besar masalah bagi skrining FXS. PCR tidak mengidentifikasi jumlah pengurangan CGG karena PCR tidak diperkuat di seluruh wilayah ini. Oleh karena itu, tidak dapat membedakan laki-laki yang normal dari laki-laki PM. Jumlah pegulangan CGG sangat penting untuk konseling genetik di PM perempuan, karena mengetahui informasi ini dapat memungkinkan dokter untuk mendiskusikan risiko memiliki terkena keturunan (Charalsawadi et. al 2005).

Daftar Pustaka

Charalsawadi C, Sripo T, Limprasert P. 2005. Multiplex Methylation Specific PCR Analysis of Fragile X Syndrome: Experience in Songklanagarind Hospital. J Med Assoc Thai Vol. 88 No.8 2005. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika [skripsi]. Malang : Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang. Sulandari S. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bogor: Bidang Zoologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Yuwono T. 2006. Teori dan aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta : Andi Pustaka.