Anda di halaman 1dari 8

Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile

phase). Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau didalam pori. Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa keterangan tentang beberapa macam kromatografi, antara lain HPLC ( High Performance Liquid Chromatography), GC (Gas Chromatography). 1. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi/HPLC( High Performance Liquid Chromatography) HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekulmolekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran. Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang da walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada banyak laboratorium. Alat HPLC niaga terdiri atas system pencampur pelarut yang sangat canggih yang mampu menghasilkan campuran landaian yang mengandung sampai empat linarut yang berbeda, pompa yang mampu menghasilkan tekanan sampai 6000psi atau 10.000 psi, kolom yang mengandung fase diam (atau lebih tepat penyangga), dan system pendeteki sinambung yang bermacam-macam jenisnya. Yang paling sering ditemukan, seluruh radas itu dipimpin dan dikendalikan olehmikroprosesor. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi yang mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh pemisahan yang sangat baik; seringkali, hasil dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative. Sedikit banyak HPLC dan GC saling melengkapi. GC telah dilengkapi instrumen dan dikembangkan demikian rupa sehingga daya pisah yang

tinggi dan hasil kuantitatif mudah diperoleh. Akan tetapi, GC mensyaratkan bahwa seyawa yang dipisahkan haruslah atsiri. HPLC mempunyai pembatas yang sebanding yaitu cuplikan harus larut didalam zat cair. Akan tetapi ini bukan pembatas yang berat., dan setidaknya HPLC dapat dipakai untuk sebagia besar senyawa tak atsiri dan senyawa berbobot molekul tinggi. Selain itu HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik, yang sebagian besar tidak atsiri. HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar. Jadi, senyawa yang tidak tahan panas dapat diangani dengan mudah. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas denganberacam diameter.parikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang ; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. 2. GC (Gas Chromatography ) Kromatografi gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat yang mudah menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa diam (stationary phase). GC terdiri dari aliran gas, tempat injeksi, kolom pemisah dan detector. Senyawa-senyawa organic dipisahkan karena perbedaan sifat penyerapan antara fasa gas dan bahan padat berpori dalam kolom. Karena sifat penyerapan tergantung pada suhu, maka kolom pemisahnya disimpan dalam oven yang terkontrol secara thermostat. Pemisahan juga disempurnakan dimulai pada suhu oven rendah hingga suhu yang lebih tinggi untuk mengelusi komponenkomponen yang mempunyai titik didih tinggi. Kromatografi Gas dikembangkan pada jaman instrument dan elektronika yang telah merevolusikan keilmuan selama lebih dari 30 tahun. Sekarang GC dipakai secara rutin di sebagian besar laboratorium industri dan perguruan inggi. GC dapat dipakai untuk setiap campuran yang komponennya atau akan lebih baik lagi jika semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti pada suhu yang dipakai untuk pemisahan. Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen menguap danbergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas. Pada kromatografi cair pembatasan yang bersesuaian ialah komponen cairan

harus mempunyai kelarutan yang berarti didalam fase gerak yang berupa cairan. Secara sepintas tampaknya pembatasan tekanan uap pada Kromatografi gas lebih serius daripada pembatasan kelarutan pada kromatografi cair, secara keseluruhan memang demikian. Akan tetapi, jika kita ingat bahwa suhu sampai 4000C dapat dipakai pada kromatografi gas dan bahwa kromatografi dilakukan secara cepat untuk meminimumkan penguraian, pembatasan itu menjadi tidak begitu perlu. Disamping itu, pada KG, senyawa yang tak atsiri sering dapat dibah menjadi turunan yang lebih atsiri dan lebih stabil sebelum kromatografi. Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya adalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fase gas bergerak dan fase diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya. Ada beberapa kelebihan kromatografi gas, diantaranya kita dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang tinggi. Gs dan uap mempunyai viskositas yang rendah, demikian juga kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat, sehingga analisis relative cepat dan sensitifitasnya tinggi. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat-zat terlarut. Kelemahannya adalah tehnik ini terbatas unruk zat yang mudah menguap. Kromatografi gas merupakan metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik utnuk campuran sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Komponen campuran dapat diidentifikasikan dengan menggunakan waktu tambat (waktu retensi) yang khas pada kondisi yang tepat. Waktu tambat ialah waktu yang menunjukkan berapa lama suatu senyawa tertahan dalam kolom.waktu tambat diukur dari jejak pencatat pada kromatogram dan serupa dengan volumetambat dalam KCKT dan Rf dalam KLT. Dengan kalibrasi yang patut, banyaknya (kuantitas) komponen campuran dapat pula diukur secara teliti . kekurangan utama KG adalah bahwa ia tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar. Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan campuran pada tingkat g mungkin dilakukan; tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika tidak ada metode lain. Pada KG dan KCKT, kolom dapat dipakai kembali dan jika dirawat dengan baik dapat tahan lama. Perawatan harus dilakukan karena kolom dapat sangat mahal. Fase diam pada KG biasanya berupa cairan yang disaputkan pada bahan penyangga padat yang lembab , bukan senyawa padat yang berfungsi sebagai permukaan yang menyerap (kromatografi gas-padat). Sistem gaspadat telah dipakai secara luas dalam pemurnian gas dan penghilangan asap, tetapi kurang kegunaannya dalam kromatografi. Pemakaian fase

cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat beragam yang akan memisahkan hampir segala macam cmapuran. Satu-satunya pembatas pada pemilihan cairan yang demikian ialah bahwa zat cair itu harus stabil dan tidak atsiri pada kondisi kromatografi. Akan tetapi, keadaan ini berubah akibat pengembangan fase terikat dan pemakaian kolo kapiler atau kolom tabung terbuka yang sangat efisien. Pada fase terikat, cairan sebenarnya terikat pada penyangga padat atau pada dinding koplom kapiler, tidak hanya disaputkan begitu saja. Pemakaian detector untuk menganalisis efluen kromatograf secara sinambung telah memungkinkan adanya KG dan KCKT. Pada KG, tersedianya berbagai detector, pemakaiannya yang umum untuk banyak jenis senyawa, dan tingkat kepekaannya yang tinggi telah memungkinkan penentuan secara teliti berbagai jenis komponen dalam kisaran yang besar, kadang-kadang dalam jumlah yang sangat kecil. Tersedianya detector selektif, misalnya detector yang hanya mendeteksi senyawa yang mengandung P, N, atau S merupakan hal yang sangat penting pula. Ini berbeda dengan KCKT yang hanya menyediakan lebih sedikit jenis detector dan kurang peka.

KROMATOGRAFI GAS dan HPLC


A. Kromatografi Gas Dalam kromatografi gas, fase bergeraknya dalah gas dan zat terlarut terpisah sebagai uap. Pemisahan tercapai dengan partisi sampel antara fasa gas bergerak dan fasa diam berupa cairan dengan titik didih tinggi (tidak mudah menguap) yang terikat pada zat padat penunjangnya. Sedangkan dalam kromatografi padat-gas, digunakan suatu zat padat penyerap. Ide untuk memfraksionasikan gas-gas dengan menginteraksikannya terhadap suatu zat padat atau cairan tidak bergerak memalui suatu aksi selektif terhadap suatu komponen tertentu, pertama kali disarankan pada tahun 1941. Metode ini menjadi populer setelah tahun 1955. Pemakaian zat cair sebagai fasa diam ternyata lebih meluas dibandingkan zat padat, sehingga teknik ini kadangkala dikenal sebagai kromatografi gas-cair. 1. Prinsip Kerja Kromatografi Gas Senyawa gas yang sedang dianalisis berinteraksi dengan dinding kolom yang dilapisi dengan berbagai tahapan fasa diam. Ini menyebabkan setiap kompleks elute diwaktu yang berbeda, yang dikenal sebagai ingatan waktu yang kompleks. Perbandingan dari ingatan kali yang memberikan kegunaan analisis kromatografi gasnya. Kromatografi gas yang pada prinsipnya sama dengan kromatografi kolom (serta yang lainnya untuk kromatografi, seperti HPLC, TLC), tetapi memiliki beberapa perbedaan penting. Pertama, proses memisahkan senyawa alam campuran dilakukan antara fasa cair diam dan fasa gas gerak, sedangkan pada kromatografi kolom yang seimbang adalah tahap yang solid dan bergerak adalah fasa cair. Kedua, melalui kolom yang lolos tahap gas terletak disebuah ovendimana temperatur gas yang dapat dikontrol, sedangkan kromatografi kolom (biasanya) tidak memiliki kontrol seperti suhu. Ketiga, konsentrasi majemuk dalam fasa gas adalah hanya salah satu fungsi dari tekanan uap dari gas. 2. Cara Kerja Kromatografi Gas Sampel diinjeksikan melalui suatu sampel injection port yang temperaturnya dapat diatur, senyawa-senyawa dalam sampel akan menguap dan akan dibawa oleh gas pengemban menuju kolom. Zat terlarut akan taradsorpsi pada bagian atas kolom oleh fasa diam,

kemudian akan merambat dengan laju rambatan masing-masing keomp[onen yang sesuai dengan nilai Kd masing-masing komponen tersebut. Komponen-kompomnen tersebut terelusi sesuai dengan urut-urutan makin membesarnya nilai koefisien partisi (Kd) menuju ke detektor. Detektor mencatat sederetansinyal yang timbul akibat perubahan konsentrasi dan perbedaan laju elusi. Pada alat pencatat sinyal ini akan tampak sebagai kurva antara waktu terhadap komposisi aliran gas pembawa. 3. Skema Alat Kromatografi Gas

4. Interpretasi Data Kromatografi Gas Berbagai jenis detaktor yang digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen yang telah terpisahkan di dalam kolom kromatografi gas. Jenis detektor meliputi detektor daya hantar panas (thermal conductivity detector), detektor ionisasi nyala (flame ionization detector), detektor fotometri nyala (flame photometric detector), detektor penamgkap elektron (electron cupture detector), dan detektor nyala alkali (alkali flame detector). Setiap detektor mempunyai karakteristik tersendiri seperti terlihat dalam tabel berikut. Detektor Perkiraan batas deteksi Rentang Daya hantar panas 100 pg/mL (propan) >105 Ionisasi nyala 2 pg/s >107 Penangkap elektron 5 pg/s 104 Fotometrik nyala < 1 pg/s (fosfor) >104 Nyala alkali < 10 pg/s (belerang) >103 Spektrometri massa 25 fg to 100 fg 105 Tabel batas deteksi dan rentang linear detektor kromatografi gas 5. Aplikasi Kromatografi Gas Kromatografi gas telah digunakan pada sejumlah besar senyawa-senyawa dalam berbagai bidang. Berikut ini beberapa aplikasi kromatografi gas, yaitu: a. Polusi udara Kromatografi gas merupakan alat yamg paling penting karen daya pemisahan yang digabungkan dengan daya sensitivitas dan pemilihan detektor GLC menjadi alat yang ideal untuk menentukan banyak senyawa yang terdapat dalam udara yanng kotor. b. Klinik Di klinik, kromatografi gas menjadialat untuk menangani senyawa-senyawa dalam dalam klinik, seperti asam-asam amino, karbohidrat, CO, dan O dalam darah dan lain-lain. c. Bahan-bahan pelapis Digunakan untuk menganalisa polimer-polimer setelah dipirolisa, karet dan resin-resin sintesis.

d. Minyak atsiri Digunakan untuk pengujiankualitas terhadap minyak permanen, jeruk sitrat, dll. e. Bahan makanan Digunakan dalam TLC dan kolom-kolom, untuk mempelajari pemalsuan atau pencampuran, kontaminsai dan pembungkusan dengan plastik pada bahan makanan, juga dapat dipakai untuk menguji jus, aspirin, kopi dll. f. Sisa-sisa peptisida KGC dengan detektor yang sensitiv dapat menentukan atau pengontrolan sisa-sisa peptisida yang siantaranya senyawa yang mengandung halogen, belerang, nitrogen, dan fosfor. g. Perminyakan Kromatografi gas dapat digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi hasil-hasil dari gas-gas hidrokarbon yang ringan. h. Bidang farmasi dan obat-obatan Kromatografi gas digunakan dalam pengontrolan kualitas, analisa hasil- hasil baru dalam pengamatan metabolisme dalam zat-zat alir biologi. i. Bidang kimia/penelitian Digunakan untuk menentukan lama reaksi pada pengujian kemurnian hasil.

B. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) Kromatografi HPLC adalah salah satu pengembangan kromatografi cair. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fasa diam yang terikat secara kimia pda penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit (kolom) dan fasa gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang tekendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waqktu yang relativ singkat. Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solut melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya, dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak depat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalm HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam proses pemisahan. Kolom utama berisis fasa diam dan jenisnya bervariasi bergantung keperluan. Fasa diam jenis terikat dapat dengan mereaksikan silika denan alkilklorosilana yang dikenal dengan reaksi silanisasi. 1. Prinsip Kerja Kromatografi HPLC Dalam metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacammacam diameter. Pertikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagaipenunjang statsioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fasa bergerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memerlukan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel menunjukan satasioner tidak selalu menguntungkan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter sekitar 2-8 mm dengan ukkuran panjang partikel 50 mm, sedangkan laju alilran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan

tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yanng biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fas geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi). Misalnya air: asetonitril (80:20). Hal ini bergantung pada kepolaran anallit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatan untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. 2. Cara Kerja HPLC Adapun cara kerja dalam metode HPLC ini adalah sebagai berikut : a. Instrumen diperiksa, terutama jika todak dipakai terus-menerus Ini dilakukan untuk menecek apakah telah dipasanga kolom yang tepat, apakah spektrum injektor tidak rusak (apakah ada lubang besar atau bocor karena sering dipakai), apakah sambungan saluran gas kadap, apakah tutp tanur tertutup, apakah semua bagian listrik bekarja dengan baik, dan apakah detaktor yang terpasang sesuai. b. Aliran gas ke kolom dimulai atau disesuaikan Ini dilakukan dengan membuka katup uatama pada tangki gas dan kemudian memutar katup (diafragma) sekunder sekitar 15 psi dan membuka katup jarum sedikit. Ini memungkinkan aliran gas yang lambat (2-5 ml)/menit untuk kolom kemas dan sekitar 0,5ml/menit untuk kolo, kapiler melewati sistem dan melindungi kolom dan detektor terehadap perusakan secara oksidasi. Dalam banyak instrumen modern, aliran gas dapat diukur dengan rotameter atau aliran otomatis atau pengendali tekanan, atau dapt dimasukkna melalui modul pengendali berlandas mikroprosesor. Apapun jenisnya, sambungan sistem (terutama sambungan kolom) harus dicek denga larutan sabun untuk mengetahui apakah ada yang bocor, atau dengan larutan khusus untuk mendeteksi kebocoran (SNOOP), atau dapat juga dengan larutan pendeteksi kebocoran niaga. c. Kolom dipanaskan sampai suhu awal yang dikehendaki Ini dilakukan, pada instrumen, buatan lama dengan memutar transformator tegangan perubah yang mengendalikan gelungan pemanas dalam tanur sekitar 90 V. 3. Skema Alat HPLC

4. Interpretasi Data HPLC Berbagai detektor untuk HPLC tekah tersedia, walaupun demikian detektor harus memenuhi persyaratan berikut : a. Cukup sensitif b. Stabilitas dan keterulangan tinggi c. Respon linear terhadap solut d. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecapatan alir e. Reabilitas tinggi dan mudah digunakan

f. Tidak merusak cuplikan Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut. Sebaliknya, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa sifat solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yabg bersifat umum terhadap solut setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Tabel berikut memuat beberapa detektor HPLC. Detektor berdasarkan absorpsi UV merupakan detektor HPLC yang paling banyak dipakai. Detektor elektrokimia paling banyak dipakai terutama dalam HPLC penukar ion. Oleh karena itu, detektor UV dan elektrokimia akan diuraikan di bawah. Dasar Pendeteksian Jenis Maksimum Sensitifitas Peka terhadap kecepatan alir? Sensitivitas suhu Absorpsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah Absorpsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah Indeks bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 oC Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% oC Spektrometri massa Umum 10-10 Tidak Tidak ada Elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% oC Tabel karakteristik detektor HPLC. Sumber : Skoog, D.A. (1985). Principles Of Instrumental 5. Aplikasi Kromatografi Gas Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan golongangolongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC berhasil paling baik untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spektrum UV atau spektrum sinar tampak. HPLC tidak cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

Dapus Mulja,h.muhammad. 1995. Analisis instrumental. Surabaya: Airlangga University press Rohman,Abdul. 2009. Kromatografi untuk analisis obat. Yogyakarta : Graha ilmu