Anda di halaman 1dari 3

metode Bidang serum

Serum sempel dikumpulkan dari bertani rubah biru di kabupaten Norwegia Hedmark dan Oppland selama wabah encephalitozoonosis pada tahun 1992. Hewan-hewan yang diklasifikasikan sebagai positif atau negatif untuk antibodi E. cuniculi menggunakan CIA, dan sampel disimpan pada suhu -40C. Hewanhewan seropositif berasal dari peternakan di mana encephalitozoonosis telah dikonfirmasi dengan pemeriksaan patologis kasus klinis. Hewan-hewan seronegatif berasal dari peternakan tanpa pecahnya encephalitozoonosis klinis dan tanpa indikasi penyakit lain.

Serum Acuan
Sebuah gabungan serum acuan positif diperoleh oleh penggabungan serum 3 rubah biru. Secara klinis dan patologi, hewan-hewan ini memiliki gejala encephalitozoonosis kronis, dan 2 dari mereka telah diisolasi E.cuniculi (Mathis et al. 1996). Gabungan serum acuan negatif dicampur dari 5 rubah biru tanpa gejala encephalitozoonosis.

Produksi spora parasit


Spora isolat IPZ: N-F82 dan N-F220 diproduksi dalam kultur sel lapisan tunggal (monolayer)sel fitbroblast manusia (MRC-5, Mathis et al, 1996). Sel-sel ditumbuhkan dalam MEM dengan larutan EBS dilengkapi dengan serum janin sapi yang dilemahkan, natrium bikarbonat, L-glutamin, dan antibiotik. PH diatur menjadi 7,4 dan sel-sel diinkubasi pada suhu 37 C ditambah dengan karbondioksida 5 %. Spora dipanen dalam media kultur pada rentang mingguan dan disimpan hingga 3 bulan pada suhu 4C sebelum preparasi. Spora dicuci dua kali dalam PBS dengan sentrifugasi. Kemudian pelet disuspensikan dengan SDS dalam PBS, dan diinkubasi. Setelah itu, spora dicuci dua kali lagi, dan pelet itu disuspensikan kembali dalam PBS hingga konsentrasi spora E. cuniculi 10 8 tiap ml untuk ELISA, atau suling air IFAT.

Persiapan antigen larut


Menurut 3 siklus pembekuan - pencairan, spora dicampur dengan butiran kaca padat (1:3, Jencons (Ilmiah) Limited, UK), dan disonikasi. Jumlah spora sebelum dan sesudah gangguan dihitung dalam haematocytometer untuk memastikan setidaknya 95 % gangguan spora dalam homogenat. Setelah sentrifugasi, kandungan protein supernatan diukur dengan deteksi UV seperti yang dijelaskan oleh Harlov & Lane (1988). Dengan protokol yang digunakan untuk preparasi antigen kurang lebih 10 8 spora E.cuniculi tiap ml memberikan konsentrasi protein dalam larutan antigen akhir 0,3 mg / ml. Kelarutan larutan antigen disimpan pada suhu -40 C sampai digunakan. Dari kultur sel yang tidak terinfeksi supernatan diatur merata menghasilkan antigen kontrol.

Enzyme linked immunosorbent assay

Campuran Buffer elisa : karbonat bikarbonat (100 mM, pH 9.6), phosphat buffer saline (PBS) (170 mM, pH 7,4), asam sitrat fosfat (70 mM, pH 4,0 dan 150 mM, pH 5.0), etanol (70% v / w), dan air suling. Larutan blocking : serum sapi (BSA: 10 mg / ml), serum kuda (100 ml/ml), susu kering tanpa lemak (30 mg/ml). Lempeng Polystyrene microtitre yang dilapisi dengan larutan antigen 150 l selama 3 hari pada suhu 4 C. Lempeng dicuci 3 kali dalam PBS dan diinkubasi selama 1 jam dengan suhu 37 C dengan salah satu larutan blocking, setelah itu lakukan pencucian 5 kali menggunakan PBS dengan Tween 20. Buffer ELISA ditambahkan ke larutan blocking ketika lempeng diinkubasi dengan larutan blocking. Serum sampel (dari kambing) diencerkan dalam buffer ELISA dan ditambahkan dalam tiap lubang/sumur, lalu diinkubasi selama 2 jam. Setelah dicuci, horseradish peroksidase (HRP) dikonjugasikan dengan antibodi kambing IgG (ICN /Cappel, Aurora, OH, USA) diencerkan dalam buffer ELISA dan ditambahkan ke lempeng, kemudian diinkubasi (2 jam) dan dicuci. Setelah itu, substrat, 2,2 azinobis dicampur dalam campuran buffer sitrat-fosfat dan hidrogen peroksida 30%, lalu ditambahkan ke lempeng. Setelah inkubasi dalam selama 45 menit, reaksi warna enzimatik dihentikan dengan menambahkan larutan sodium acid pada setiap lubang/sumur, dan intensitas warna dibaca pada 405 nm. Semua serum diuji dalam 4 sumur, 2 sumur dilapisi dengan antigen E. cuniculi dan 2 sumur dilapisi dengan kontrol antigen. Dengan demikian, setiap miocrotitre 96lubang lempeng melakukan maksimal 22 uji serum dan positif dan kontrol negatif. Nilai ELISA serum sampel dinyatakan sebagai sampel untuk rasio positif {S: P-rasio = (OD sampel - OD kontrol negatif) / (OD positif Kontrol - OD kontrol negatif)} (Tijssen 1985). Nilai tengah untuk 2 pasang nilai S: P masing-masing sampel digunakan ketika memilih nilai cut-off dari pengujian tersebut. Untuk memilih nilai cut-off ELISA, digunakan plot TG-ROC (Greiner et al. 1995, Zweig & Campbell 1993). Dengan demikian, pasangan sensitivitas dan spesifisitas bisa dibaca langsung dari nilai ambang plot TG-ROC manapun. Dua nilai cut-off dipilih dimana sensitivitas dan spesifisitas masingmasing sama dengan tingkat akurasi yang telah dipilih sebelumnya. Nilai diantara nilai-nilai cut-off yang dianggap menengah. Tafsiran nilai cut-off dilakukan dengan metode non-parametrik. Hasil ELISA diinterpretasikan sebagai berikut: ketika kedua rasio S: P berada di atas nilai cut-off tertinggi, serum sempel dianggap positif untuk antibodi E.cuniculi. Sampel dengan kedua nilai di bawah nilai cut-off terendah dianggap negatif. Sampel serum, yang memiliki kedua nilai di antara nilai-nilai cut-off, berada di kisaran menengah (IR) dari tes. Sampel yang memiliki nilai di kedua sisi nilai cut-off, dianggap tidak ditafsirkan(NI).

Carbon immunoassay

Masing-masing serum sampel diencerkan dengan PBS perbandingan 1:50. Setiap sampel yang diencerkan tadi dicampur dengan 300.000 spora E. Cuniculi dan diinkubasi pada suhu kamar selama 2 menit. Kemudian campuran ditambahkan tinta India pada glass slides dan ditutupi dengan kaca. Hasilnya dibacakan langsung pada 1000 perbesaran dalam mikroskop cahaya. Untuk serum positif, spora E. cuniculi yang bernoda hitam keabu-abuan pada latar partikel karbon. Sementara serum negatif, parasit muncul berwarna putih pada latar gelap. Serum yang menggumpal spontan pada tes, diencerkan 1:100 dan diuji ulang.

Immunofluorescence antibody test


Masing-masing lubang/sumur dari 12 lubang glass slides dilapisi dengan 80000 spora E. cuniculi yang diencerkan dalam 10 ml air suling. Slide dikeringkan, dicampurkan dalam aseton dan salah satunya digunakan segera atau disimpan dalam kantong plastik tertutup dengan silika gel pada suhu 40 C. Untuk uji ini, setiap lubang/sumur diblokir dengan serum kelinci dalam PBS dan slide diinkubasi dalam ruang lembab selama 30 menit. Slide dicuci dua kali selama 5 menit dengan PBS. Serum sampel diencerkan 1:40 dengan serum kelinci dalam PBS, dan 25 l sampel yang diencerkan ditambahkan pada setiap sumur. Baik positif maupun negatif serum kontrol ditambahkan ke setiap slide, diinkubasi pada suhu 4C. Hari berikutnya, slide dicuci, dan 25 l FITC terkonjugasi antibodi kelinci IgG (Sigma , St Louis, MO, USA) diencerkan 1:25 dengan serum kelinci dalam PBS dan Evans biru (1:10000)ditambahkan ke setiap sumur. Slide diinkubasi pada suhu kamar dalam kegelapan selama 60 menit, dicuci dan dikeringkan. Pemeriksaan slide dilakukan pada perbesaran 400 kali dalam epifluorescence mikroskop (Leitz di Wetzlar, Jerman) dilengkapi dengan lampu merkuri 50 W. Lubang/sumur dengan fluoresensi perifer yang kuat, setidaknya 50 persen dari spora, dianggap positif.

Analisis statistik
Kesalahan analitis (s) dapat dihitung dari hasil ELISA dari nilai uji serum dengan rumus: s = (d2 / 2n) dimana n adalah jumlah duplikat penentuan dan d adalah perbedaan dalam pasangan tertentu (Larsson 1987). Perjanjian () antara uji dihitung untuk mengklasifikasikan sampel sebagai positif dan negatif dalam ELISA dibandingkan dengan hasil IFAT (Martin et al. 1987). Perjanjian itu dianggap rendah, moderat dan tinggi, yaitu 0,4 <0,6, 0,6 <0,8 dan 0,8 1, masing-masing. Uji pasti Fisher digunakan untuk mengevaluasi apakah perbedaan antar uji signifikan atau tidak (Altman 1993).