Anda di halaman 1dari 10

Efek Sitotoksik dari Dua Larutan Asam dan Sodium Hipoklorit 2,5% yang Digunakan dalam Perawatan Endodontik

Abstrak

Tujuan: Evaluasi sitotoksisitas asam sitrat 15%, asam fosfat 5% dan NaOCl 2,5% pada kultur fibroblas dengan menggunakan uji Kolorimetrik MTT. Metodologi: Larutan irigasi asam fosfat 5%, asam sitrat 15%, dan NaoCl 2,5%, diencerkan dengan konsentrasi 0,1% dan 0,5%, ditempatkan pada kultur sel fibroblas 3T3L1. Viabilitas sel ditentukan dengan cara uji rata-rata kolorimetri MTT setelah periode 1, 6 dan 24 jam. Persentase viabilitas sel dianalisis menggunakan uji KruskalWallis untuk perbandingan secara umum dan uji Mann-Whitney U untuk pasangan perbandingannya. Hasil: Persentase viabilitas sel berkurang secara progresif di semua larutan pada kedua pengenceran selama 24 jam. Pengenceran 0,1% dari NaOCl 2,5% (63,39%) dan asam sitrat 15% (53,91%) menunjukkan persentase viabilitas sel yang tertinggi (p = 0,083). Larutan irigasi NaOCl 2,5% dengan konsentrasi pengenceran 0,5% menunjukkan nilai sel viabilitas tertinggi (48,51%). Simpulan: Larutan irigasi yang mempunyai persentase viabilitas sel tertinggi adalah NaOCl 2,5% baik pada pengenceran 0,1% dan 0,5%. Persentase viabilitas sel yang sangat rendah diperoleh asam sitrat 15% dan asam fosfat 5% pada konsentrasi pengenceran 0,5%. Kata kunci: Asam sitrat, asam fosfat, sodium hipoklorit, sitotoksisitas.

Pendahuluan

Tujuan

utama

perawatan

endodontik

adalah

membersihkan

dan

mensterilkan sistem saluran akar. Penggunaan larutan irigasi pada pembersihan dan desinfeksi saluran akar akan menyebabkan ekstrusinya cairan ke periapeks, sehingga mengganggu proses perbaikan jaringan periodontal 1. Bahan irigan dapat

ekstrusi pada gigi dewasa dengan apeks yang utuh, baik pada kasus gigi vital maupun non vital. Potensi sitotoksik bahan irigan endodontik harus dianalisis selain sebagai antiseptik dan efek untuk menghilangkan lapisan smear 2. Standar larutan irigasi saluran akar adalah kombinasi dari asam atau larutan chelating dengan sodium hipoklorit, pada konsentrasi yang berbeda dan selama periode waktu yang berbeda 3,4. Sodium hipoklorit (NaOCl) adalah larutan irigasi yang paling banyak digunakan di bidang endodontik, dengan konsentrasi 0,5% -5,25%, karena spektrum antibakteri yang luas dan kapasitas untuk melarutkan bahan organik dan jaringan nekrotik
5,6

. Sifat-sifat pelarut dan

antiseptiknya lebih besar pada konsentrasi yang lebih tinggi 7, tapi begitu juga efek toksisitasnya8. Penelitian yang menggunakan uji kolorimetrik MTT
9,1

melaporkan bahwa sitotoksisitas NaOCl dengan konsentrasi yang berbeda-beda, lebih rendah dari larutan EDTA 17%, REDTA, dan MTAD (doksisiklin, asam sitrat dan Tween 80). Asam dan larutan irigasi chelating meningkatkan penghapusan lapisan smear, pembersihan dinding dentin, dan desinfeksi saluran akar 6. Serper dan Armaral telah mempelajari toksisitas EDTA dan larutan asam sitrat pada konsentrasi yang berbeda dalam berbagai sampel sel
9-13

. Chan dkk. (1999)

melaporkan angka kematian yang lebih tinggi pada gigi yang tingkat keasaman sel pulpanya lebih besar dari larutan asam sitrat 14. Penggunaan asam fosfat untuk menghilangkan lapisan smear endodontik telah beberapa kali diteliti. Becce dan Ayad merekomendasikan bahan ini sebagai irigasi saluran akar, dengan konsentrasi 10% atau 32% untuk sediaan cair dan

37% untuk sediaan gel 3,15. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa asam fosfat 5% dikombinasikan dengan larutan NaOCl 2,5% efektif untuk penghapusan lapisan smear selama instrumentasi saluran akar dan memiliki kemampuan dekalsifikasi pada dentin akar
4,16

. Tidak ada laporan yang menunjukkan sitotoksisitas asam

fosfat sebagai larutan irigasi dalam preparasi saluran akar. Tujuan dari penelitian ini untuk membandingkan sitotoksisitas dari asam fosfat 5%, asam sitrat 15% dan NaoCl 2,5% dengan kultur fibroblas 3T3 mengunakan uji Kolorimetrik MTT.

Bahan dan Metode

Fibroblas 3T3-L1 (ECACC 86052701) yang digunakan untuk menguji sitotoksisitas larutan irigasi diperoleh dari Koleksi Kultur CIC Univesitas Granada (Spanyol). Sel ditempatkan dalam kondisi steril pada flask 75cm2 yang berisi 30 ml media kultur yang terdiri dari Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) + glutamin 2mm + inactivated fetal bovine serum (PBS) 10%. Flask disimpan pada suhu 37C dengan konsentrasi CO2 5% dan kelembaban 95% sampai sel menyatu, ketika media kultur dikeluarkan dari flask, sel di dalam flask mengalami tripsinisasi oleh pencucian larutan PBS dan EDTA / tripsin selama 5 menit, diikuti dengan pengocokan dan pembuangan cairan ini hingga sel terpisah. Sel-sel yang tersebar dalam flask ditambahkan media kultur DMEM + PBS 10% yang baru dan disentrifugasi 80-100 G selama 5 menit. Suspensi sel dihitung dibawah mikroskop dengan menggunakan tempat penghitungan Neubauer, dan sel (1x104) ditempatkan di 96 buah well plate (Dimittis GMBH & Co KG, Weisbaden,

Jerman) dengan 100 l media kultur selama 48 jam dalam oven pada suhu 37 C konsentrasi CO2 5% dan kelembaban 95%. Sebuah pipet multichannel (Finnipippette, BOECO, Boeckel + Co (GmbH + Co), Hamburg, Jerman) digunakan untuk menghapus media kultur dari semua well plate kecuali untuk kelompok kontrol, lalu penambahan 10 l di tiap larutan irigasi. Plate ditutup dan ditempatkan dalam oven pada suhu 37 C dalam suasana CO2 5% dan kelembaban 95%. Pengujian dilakukan dalam rangkap empat pada semua kelompok studi. Kultur media selalu ditangani dalam kondisi steril di bawah Laminar Flow Hood (Nuaire, Fernbrook Lane, Plymouth, MN) untuk menghindari kontaminasi bakteri. Kelompok eksperimental adalah: (1) kelompok kontrol, kultur DMEM yang segar, (2) DMEM yang mengandung larutan asam sitrat 15% diencerkan hingga 0,5%, pH 3,54 (3) DMEM yang mengandung larutan asam sitrat 15% diencerkan hingga 0,1%, pH 7.40 (4) DMEM yang mengandung larutan asam fosfat 5% diencerkan hingga 0,5%, pH 2,70 (5) DMEM yang mengandung larutan asam fosfat 5% diencerkan hingga 0,1%, pH 6,44 (6) DMEM yang mengandung larutan NaOCl 2,5% diencerkan hingga 0,5%, pH 7,97 dan (7) DMEM yang mengandung larutan NaOCl 2,5% diencerkan hingga 0,1%, pH 7,94. Sitotoksisitas larutan irigasi dinilai pada 1, 6, dan 24 jam setelah inkubasi, dengan menggunakan uji kolorimetrik MTT (Roche Diagnostics GMBH, Mannheim, Jerman). Uji kolorimetrik MTT menilai tentang kemampuan viabilitas sel untuk mengkonversi garam tetrazolium yang larut, MTT [3 - (4.5dimethylthiazol-2-il) - 2-5-diphenylterazolum bromida], menjadi produk akhir

formazan biru oleh enzim dehidrogenase mitokondria. Setiap kultur ditambahkan 10l stok MTT (5 mg / ml MTT dalam PBS). Kultur dinkubasi selama 4 jam dengan suhu 37C konsentrasi CO2 5% dan kelembaban 95%, kemudian setiap well plate ditambahkan 100 ml SDS 10% pada konsentrasi HCl 0,01M. Larutan dibiarkan untuk larut semalaman di kelembaban 100%. Absorbansi ditentukan dengan menggunakan scanning multiwell spectrophotometer ELISA (Bio-Tek Instruments Inc, VT) pada 550nm dan dinyatakan sebagai persentase dari absorbansi yang diperoleh pada kelompok kontrol. Rata-rata dan standar deviasi dari persentase viabilitas sel dihitung pada empat kategori. Fullfactorial regression model digunakan untuk menilai signifikansi dari interaksi antara tiga faktor (jenis larutan irigasi, konsentrasi larutan irigasi, dan waktu kerja dari larutan irigasi) untuk persentase viabilitas sel. Uji Kolmogorov-Smirnov digunakan untuk menilai distribusi data. Variabel dianalisis menggunakan uji non-parametrik karena hasil untuk setiap kelompok tidak mengikuti distribusi normal. Persentase viabilitas sel dari larutan irigasi yang berbeda dianalisis menggunakan uji Mann-WhitneyU (perbandingan berpasangan) dan uji Kruskal-Wallis (perbandingan global). Tingkat signifikansi statistik diatur pada p <05.

Hasil

Full-factorial regression menganalisis pengaruh jenis larutan irigasi (asam sitrat 15%, asam fosfat 5%, atau NaOCl 2,5%), konsentrasi larutan irigasi (0,1

atau 0,5%) dan waktu kerja larutan irigasi (1, 6, atau 24 jam) menunjukan interaksi yang signifikan secara statistik antara ketiga faktor dalam persentase viabilitas sel (p <0,001) yang digambarkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Viabilitas sel: dipengaruhi oleh waktu dan konsentrasi dari larutan irigasi
1 Jam
Kontrol Asam sitrat 15% Asam fosfat 5% NaOCl 2.5% [0.1] [0.5] [0.1] [0.5] [0.1] [0.5]
98.99 78.04 1.20 31.48 1.01 97.78 95.73 1.871 4.13a,1,2 0.32a,1 2.36b,1,2 0.00b,1,2 1.271,2 2.011,2 99.20 62.75 1.46 14.71 1.46 70.11 54.03

6 Jam
0.632 2.16b,1,3 0.00b,2 3,85c,1,3 0.30c,1 6.94d,1 3.49d,1,3 93.48 53.91 1.80 6.91 1.47 63.39 48.51

24 Jam
3.801,2 4.77b,2,3 0.19b,1,2 0.92c,2,3 0.33c,2 4.63d,2 2.93d,2,3

* Fullfactorial regression model, p bernilai < .001 (larutan irigasi x konsentrasi larutan x interaksi waktu).
Lihat secara teliti, huruf yang sama mengindikasi perbedaan yang signifikan antara dua konsentrasi dari larutan yang sama

Gambar 1. Kurva viabilitas sel 3T3L1 diperlakukan dengan larutan irigasi yang berbeda-beda diencerkan hingga 0.1% dan kelompok kontrol. Semua kultur menunjukkan pengurangan persentasi viabilitas sel yang progresif. Kultur sel diperlakukan dengan asam fosfat 5% menunjukkan persentase viabilitas sel yang paling rendah dibandingkan kelompok lainnya (p < 0.05)

Gambar 1 menunjukkan kurva penurunan persentase viabilitas sel yang signifikan dari waktu 1 jam hingga 24 jam pada pengenceran 0,1% antara larutan NaOCl 2,5%, asam sitrat 15% dan asam fosfat 5%. Persentase viabilitas sel

tertinggi pada waktu 24 jam diperoleh NaOCl 2,5% (63,39%) dan asam sitrat 15% (53,91%), dengan tidak ada perbedaan yang signifikan diantara keduanya (p = 0,083). Persentase viabilitas sel terendah diperoleh asam fosfat 5% (6.91%), yang menunjukkan perbedaan signifikan dengan larutan lain (p = 0,021). Gambar 2 menunjukkan kurva pengenceran 0,5% dari tiap larutan irigasi, persentase viabilitas sel semakin berkurang secara signifikan dalam biakan sel NaOCl 2,5% (48,51%) dari 1 jam hingga 24 jam (p = 0,010), dan persentase viabilitas sel terendah diperoleh asam sitrat 15% dan asam fosfat 5% pada ketiga titik waktu (p = 0,015 dan p = 0,020). Perbandingan total antara larutan irigasi menunjukkan perbedaan yang signifikan, kecuali untuk perbandingan antara asam sitrat 15% dan asam fosfat 5% pada waktu 1 jam (p = 0,215), 6 jam (p = 1,0) dan 24 jam (p = 0,127).

Gambar 2. Kurva viabilitas sel 3T3L1 diperlakukan dengan larutan irigasi yang berbeda-beda diencerkan hingga 0.5% dan kelompok kontrol. Kultur yang diperlakukan dengan NaOCl 2.5% menunjukkan pengurangan persentase viabilitas sel yang progresif. Asam sitrat 15% dan asam fosfat 5% menunjukkan persentase viabilitas sel yang paling rendah.

Diskusi

Larutan irigasi tidak hanya dinilai sebagai antibakteri atau bahan chelating tetapi efek biologisnya ketika ekstrusi pada jaringan inang juga harus dipertimbangkan 1. Larutan irigasi yang ideal akan menjadi satu kesatuan yang menggabungkan efek maksimal dari antibakteri dan efek pelarut pada jaringan organik dan anorganik, dengan efek toksik minimal pada jaringan periapikal. Uji MTT tetrazolium dianggap indeks yang sensitif untuk mengevaluasi sitotoksisitas material gigi dan telah digunakan oleh beberapa penulis
1,9,13,14

Keuntungan utamanya adalah kecepatan dan keakuratan dalam teknik, reproduktifitas, dan fakta bahwa tidak ada radioisotop yang digunakan. Manfaat lainnya yaitu tidak diperlukan pencucian sampel, yang bisa menyebabkan variasi dalam sampel 17. Semua larutan irigasi yang diencerkan menjadi 0,5% atau 0,1% pada penelitian ini diaplikasikan pada kultur fibroblas, karena sel kultur lebih rentan dari jaringan periapikal untuk efek racun dari obat-obatan 11. Sel fagosit, saluran getah bening dan darah semua membantu untuk mencairkan dan membawa pergi obat-obatan tersebut. Obat-obatan tersebut diharapkan tidak akan begitu mengiritasi dalam situasi klinis seperti dalam studi sitotoksisitas 18. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pengenceran 0,1% dan 0,5% dari larutan NaOCl 2,5% kurang sitotoksik pada sel 3T3-L1 dibandingkan dengan pengenceran 0,1% dan 0,5% dari asam sitrat 15% dan larutan asam fosfat 5%, konsisten dengan laporan lain yang membandingkan sitotoksisitas NaOCl dengan larutan EDTA, REDTA, dan MTAD dengan menggunakan tes kolorimetri

MTT1,9. Hidalgo dkk. mengamati kematian sel dalam kultur fibroblas setelah aplikasi NaOCl pada konsentrasi > 0,05% untuk 2-24 jam dengan menggunakan uji XTT. Chang dkk. menemukan bahwa pengenceran 0,4% dan 0,2% dari larutan NaOCl 5,25% membunuh sel ligamen periodontal setelah 3 dan 24 jam pemaparan, yang menggunakan alat tes fluoresensi PI. Perbedaan hasil ini dapat terjadi karena penggunaan jalur sel yang berbeda, prosedur, dan kondisi eksperimental yang digunakan untuk menilai sitotoksisitas 19. Sitotoksisitas larutan asam (asam sitrat 15%, asam fosfat 5%) lebih rendah pada pengenceran 0,1% daripada 0,5%, dimana persentase viabilitas sel nyaris nol untuk kedua larutan. Asam sitrat 15% yang diencerkan pada 0,1% memiliki persentase viabilitas sel di atas 50% pada setiap titik waktu, sedangkan hampir tidak ada sel yang layak pada setiap titik waktu setelah eksposur untuk larutan yang sama pada pengenceran 0,5%. Malheiros dkk. menemukan kelangsungan hidup fibroblas NIH3T3 lebih tinggi pada asam sitrat 15% dengan pengenceran 0,5% pada waktu 24 jam dibandingkan dengan EDTA 17% dengan pengenceran 0,5% dan Scelza dkk. juga melaporkan ketahanan dan kelangsungan hidup sel lebih tinggi pada larutan asam sitrat 10% dibandingkan dengan pengenceran larutan EDTA-T 1%, 0,1% dan 0,01%. Tidak satupun dari studi melaporkan pH larutan irigasi yang digunakan dan kelangsungan hidup sel itu ditentukan menggunakan uji Trypan blue dye exclusion. Chan dkk. menunjukkan sitotoksisitas asam sitrat tergantung pada pH larutan dengan menggunakan uji MTT. Konsentrasi asam sitrat pada 0,1% (pH 7,20), 0,25% (pH 6.22), dan 0,50% (pH 4,74) mengurangi kelangsungan hidup sel dengan masing-masing persentase

10

20%, 74% dan 98%, dibandingkan dengan kelompok kontrol. Temuan ini tampaknya menunjukkan bahwa pH larutan irigasi asam menurunkan pH biakan kultur, yang menyebabkan penurunan yang signifikan dalam viabilitas sel. Larutan asam sitrat 15% dengan pH rata-rata yang menurun dari 7,40 untuk pengenceran 0,1% menjadi 3,54 untuk pengenceran 0,5%. Hasil terburuk viabilitas sel diperoleh dengan asam fosfat 5% di kedua pengenceran, dan hasil sitotoksisitas ini juga terkait dengan pH larutan (pH = 6,44 untuk pengenceran 0,1% dan pH = 2,70 untuk pengenceran 0,5%). Goldman dkk. melaporkan bahwa kematian sel ini disebabkan oleh efek asidosis ekstraseluler pada neuron dan sel glial setelah 10 menit terkena larutan asam laktat dengan pH 3,8-4,2, dengan tidak ada sel yang masih hidup setelah paparan 1 jam pada pH 5,2. Standar larutan irigasi saluran akar meliputi kombinasi larutan asam atau chelating dengan sodium hipoklorit pada konsentrasi yang berbeda dan selama periode waktu yang bervariasi
3,4

. Pemilihan suatu larutan irigasi didasarkan pada

sifat kimia, fisik dan biologis dan kejadian ekstrusi ke daerah periapikal juga harus dipertimbangkan. Penelitian in vitro yang dilakukan ini menunjukkan sitotoksitas semua bahan irigasi yang moderat hingga parah tergantung konsentrasinya. Persentase tertinggi kelangsungan hidup sel diperoleh NaOCl 2,5% dengan pengenceran 0,1% dan 0,5%. Persentase viabilitas sel yang sangat rendah diperoleh dengan pengenceran 0,5% pada asam fosfat 5% maupun asam sitrat 15%.