KLONING Kloning fragmen DNA menggunakan enzim restriksi dapat diibaratkan seperti naik pesawat terbang yang harus

transit beberapa kali untuk sampai ke tempat tujuan. Kita bisa sampai ke tempat tujuan, tetapi memerlukan waktu lebih lama dari waktu yang seharusnya. Selain waktu yang lebih lama, tempat restriksi tidak selalu ada pada daerah yang diinginkan, dan kadang-kadang juga tidak ditemukan di dalam vektor. Sistem kloning dengan bantuan rekombinase, memungkinkan peneliti dapat memindahkan DNA dari satu plasmid ke plasmid lain tanpa memerlukan enzim-enzim restriksi, sehingga menyederhanakan proses kloning. Selain itu juga bisa menghilangkan "kejengkelan" yang datang pada saat fragmen DNA (insert) yang akan kita sisipkan tidak memiliki tempat atau tempatnya tidak tepat. Sistem seperti ini sangat berguna untuk memindahmindahkan insert, dari suatu vektor ke vektor lain. Sebagai contoh sistem ini mempunyai tujuan untuk menandai protein di kedua ujung amino (N) dan karboksilnya (C), sehingga protein tersebut menjadi menyala atau tidak menyala, atau membuat konstruksi ekspresi pada sistem yang bervariasi. Beberapa metode telah dijelaskan secara detil, sampai saat ini sudah ada tiga jenis yang sudah dikomersialkan, yaitu Cre/lox, Flp/frt, dan rekombinase lambda. SISTEM GATEWAY Teknologi gateway yang dikembangkan oleh Invitrogen, Carlsbad-California menggunakan rekombinase lambda yang disebut sebagai Clonase yang mengkatalisa terjadinya rekombinasi secara in vitro antar sequens yang diapit oleh fragment 25-bp att. Seringkali, sequens tersebut berada pada plasmid yang berbeda, bila memindahkan sebuah insert dari vektor donor (entry) ke vektor resipien (destination). Tetapi, Invitrogen juga memiliki sistem untuk mengkloning fragmen DNA secara langsung ke dalam plasmid menggunakan Clonase, suatu sistem yang tidak memiliki enzim restriksi dan ligase. Dengan menggunakan kit konstruksi pustaka cDNA CloneMiner (harganya 1.221 dollar US, dapat digunakan untuk 5 kali konstruksi), pengguna dapat membuat pustaka cDNA utuh secara langsung ke dalam plasmid donor yang sesuai. Perusahaan telah mendisain bermacam-macam vektor resipien, yang bisa digunakan untuk mengganggu transkripsi RNA (dikenal dengan istilah RNA interference), menandai target dengan gen yang menyala (fluorescent tag), dan ragi. Dengan demikian, sistem ini adalah sangat serbaguna seperti yang diungkapkan oleh Pieter de Jong (ketua peneliti di BACPAC, Pusat penelitian dan Rumah Sakit Anak, Oakland, California). Sistem Gateway telah memberikan kemudahan kepada peneliti. Proyek ORFemoe pada Caenorhabditis elegans mendistribusikan 10.000 klon atau lebih ke dalam sistem Gateway. Dan tim kloning cDNA di Pusat Studi Genom Eukaryotik (CESG) di Universitas Wisconsin-Madison, telah menggunakan Gateway untuk membuat konstruksi ekspresi sekitar 4.000- 5.000 buah. Tetapi menurut salah seorang staf peneliti CESG, Russel Wrobel, tim merencanakan untuk kembali ke vektor dengan sistem enzim restriksi seperti pada Promega, karena ,i>gateway masih terlalu mahal. Meskipun demikian, Wrobel mengatakan meskipun harganya mahal, sistem ini sangat bermanfaat dan mudah digunakan. Menurut pengguna lainnya, Charles Buck dari Purdue University, sistem gateway masih perlu diperbaiki karena masih banyak insert tidak tersisipkan ke dalam vektor dan terkadang sistem tidak bekerja dengan baik. SISTEM CRE/LOX Sistem kloning Cre/lox lebih awal dikembangkan daripada sistem fagi dan masih digunakan secara luas sampai saat ini. Sistem ini dilaporkan oleh Steve Elledge (Harvard University) dalam jurnal Current Biology, pada saat beliau masih di Baylor College Medicine, 1998. Cre (diperoleh dari bakteriofagi P1) mengkatalis rekombinasi DNA antar fragmen 34-bp loxP. Vektor ini merupakan hasil penggabungan dari dua sistem yang masingmasing membawa satu loxP. Elledge menggunakan sistem ini untuk menempatkan gen penanda glutathione-S-transferase di bagian depan gen pengkode Skp1. Mountain View, Clontech-California membuat sistem yang dinamakan Creator menggunaan pendekatan yang sedikit berbeda. Donor plasmid dengan target sequens diapit oleh fragment loxP (disebut "floxed") dan sebuah plasmid penerima yang memiliki satu loxP. Creator akan memindahkan sequens "floxed" dari satu plasmid ke plasmid lain. Sementara itu, La Jolla-Stratagene-California membuat sistem yang memungkinkan pemindahan salah satu dari tiga gen penanda pengkode hydromycin, puromycin dan neomycin, ke dalam sebuah vektor inti menggunakan Cre. Keuntungan dari sistem ini, menurut Lisa Stilwell (manejer produksi Stratagen untuk sistem ekspresi protein) adalah pengguna dapat memakai penanda gen tahan antibotik yang berbeda tanpa harus melakukan kloning lagi, dan juga tidak harus meligasi loxP dengan target insert, sebelum melakukan kloning. SISTEM FLP/FRT Sistem rekombinase lainnya adalah menggunakan enzim Flp yang diperoleh dari plasmid ragi. Enzim ini mengkatalisa rekombinasi antar fragmen frt, dan Invitrogen membuat sistem Flp-in untuk kloning pada sel mammalia. Sistem ini menggunakan sel lines yang mengandung satu fragmen frt yang diinsert ke daerah kromosom yang sering ditranskripsi. Semua kejadian rekombinasi dalam plasmid akan menghasilkan insert pada tempat yang sama, menghasilkan sel lines yang isogenik. Hal yang sedikit mengganggu adalah kita harus membuat juga sel yang ditransfeksi Flp-in. Invitrogen menjual beberapa jenis Flp-in sel lines seperti 293, 3T3 dan Jurkat. Sistem ini mencakup vektor pFRT/lacZeo, sebuah konstruksi rekombinase Flp, dan vektor Flp-in pcDBA5/FRT. VEKTOR SELANJUTNYA Sistem vektor kloning dengan rekombinase mungkin akan laris di masa depan, tetapi sebagian besar produsen "menutup diri" dalam hal pengembangan teknologinya. Beberapa peneliti melakukan improvisasi teknik-teknik kloning tersebut dan kemudian mengharapkan adanya pembeli. Michele Calos, Ass. Prof. bidang genetika dari Stanford University School of Medicine, sedang mempersiapkan komersialisasi produknya yang dinamakan PhiC31 yang bisa berguna untuk terapi gen. Dengan menginjeksikan cDNA, plasmid yang memiliki fragmen attB, dan gen pengkode human blood clotting factor IX (orang hemofilia kekurangan protein ini), menghasilkan ekspresi yang sama dengan orang normal. Hal ini dilaporkan dalam jurnal Nature Biotechnology. Calos mengatakan bahwa sistem ini dapat menurunkan secara signifikan resiko mutagenesis yang kadang terjadi bila menggunakan vektor yang sifatnya terintegrasi secara bebas. KIT ATAU BUKAN KIT Sebagian besar peneliti tidak mempermasalahkan teknik kloning dengan rekombinase, tetapi masalahnya adalah pada kit. Teknik kloning adalah cukup mudah sehingga banyak peneliti mengatakan bahwa kit mungkin tidak diperlukan. de Jong mengatakan bahwa di laboratoriumnya terdapat lebih dari 25 juta klon dalam 100 freezer. Klon DNA tersebut berukuran besar dan semuanya menggunakan vektor buatan sendiri. Bagi yang membutuhkan pustaka tersebut bisa membelinya, tetapi kualitasnya mungkin tidak sebagus dengan buatan sendiri bila menggunakan kit. Kit adalah "sebuah jebakan bagi orang baru yang mungkin menerima apa adanya tanpa benar-benar mengerti apa yang mereka lakukan", kata Buck. Kemudian, de Jong mengatakan bahwa membuat sebuah konstruksi knockout (KO) untuk stem sel tikus menggunakan metode standar dengan enzim restriksi akan membutuhkan waktu yang sangat panjang. Adalah sangat sulit untuk melakukannya, sehingga perusahaan membuat kit. Dengan metode standar, untuk membuat stem sel tikus KO memerlukan waktu 2-3 bulan lebih lama. Banyak mahasiswa pascasarjana menghabiskan waktu 3-5 bulan hanya untuk membuat satu konstruksi. Dengan sistem homolog, kloning dapat dilakukan lebih cepat, sekitar 2 minggu. Bila menggunakan kit sistem rekombinase, peneliti dapat menyelesaikan pekerjaan yang sama hanya dalam beberapa hari saja. Lebih lanjut de Jong mengatakan bahwa biaya akan lebih murah dengan menggunakan kit komersial karena vektor sudah diuji, menjadi hemat tenaga dan uang. Namun demikian, bagi laboratorium yang sudah maju seperti CESG Wisconsin, sistem mereka mungkin lebih murah dan lebih cepat.