EFECTO DE LOS INHIBIDORES EN LA CADENA RESPIRATORIA

I.

INTRODUCCIN Segn se ha indicado, en las oxidaciones biolgicas los hidrgenos sustrados al sustrato son transferidos en forma gradual a travs de aceptores que experimentan cambios reversibles en su estado redox. En la membrana interna de las mitocondrias estos aceptores estn dispuestos ordenadamente segn un gradiente de potencial de reduccin creciente y asociados ntimamente a las enzimas que catalizan las transferencias. El conjunto recibe el nombre de cadena respiratoria o cadena de transporte de electrones. (Blanco 2001) Dos hidrgenos cedidos en una reaccin redox representan la suma de dos protones (H+) y dos electrones (e-). Hidrgenos y electrones frecuentemente son denominados equivalentes de reduccin. La cadena respiratoria comprende una serie de etapas. Durante todo el recorrido, los electrones fluyen naturalmente en el sentido que les fija el desnivel en el potencial de reduccin de los aceptores. En este sistema, los electrones se deslizan desde A a B, a C, a D, y al oxgeno secuencialmente, impulsados por el potencial creciente. Todos los integrantes de la cadena de transporte de electrones se encuentran en la membrana interna de la mitocondria, constituyendo un sistema multienzimtico altamente ordenado. Su inclusin en la membrana asegura la disposicin espacial adecuada para un ptimo funcionamiento. (Blanco 2001) Al analizar el proceso de oxidacin de un sustrato y la transferencia de electrones, uno podra preguntarse por qu el sustrato no entrega sus hidrgenos directamente al oxgeno o a otros aceptores con mayor potencial de reduccin que el NAD por ejemplo ya que esas reacciones son termodinmicamente ms favorables. Esto se explica si se recuerda que, en las condiciones existentes en la clula, toda reaccin qumica transcurre gracias a la existencia de catalizadores. Slo la presencia de enzimas especficas asegura el cumplimiento de las etapas y la liberacin de energa en forma gradual y controlable. Los hidrgenos no pasan directamente de un sustrato dado al oxgeno o a cualquier otro aceptor si no existen enzimas que catalicen la transferencia. (Blanco 2001)

A excepcin de la ubiquinona (CoQ), que se encuentra libre en el interior de la doble capa lipdica, y del citocromo c, cuyas molculas estn adosadas a la cara externa de la membrana interna, los restantes componentes de la cadena respiratoria se agrupan en cuatro complejos multimoleculares que ocupan todo el espesor de la membrana. Estos complejos son designados con nmeros romanos. Complejo I es la NADH-ubiquinona reductasa. Por intermedio de NAD, recibe hidrgenos de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a esa coenzima. Contiene FMN y varios centros Fe-S. Entrega los hidrgenos a ubiquinona. Complejo II corresponde a la Succinato-ubiquinona reductasa. Posee un grupo prosttico FAD y tres centros Fe-S. Transfiere equivalentes de reduccin desde succinato a coenzima Q. Complejo III es la Ubiquinona-citocromo c reductasa. Contiene citocromos b566, b562 y c1 y un centro Fe-S, Transfiere electrones desde ubiquinona a citocromo c. Complejo IV es la Citocromo oxidasa, en la cual estn incluidos los citocromos a y aa3 y dos iones Cu. Cataliza la reduccin de O2 a H2O. Un recurso til para establecer la secuencia de la cadena ha sido el uso de inhibidores que actan en sitios especficos. El estado redox de los distintos componentes puede determinarse por espectrofotometra directamente en suspensiones de mitocondrias. Cuando se agrega a la preparacin un inhibidor que bloquea la transferencia de electrones en un punto determinado, los componentes de la cadena que participan en las instancias previas al sitio afectado aparecern reducidos y los de etapas posteriores estarn oxidados, pues no reciben electrones. Los estudios con distintos agentes bloqueantes del transporte de electrones apoyan el ordenamiento propuesto. Como ejemplo se mencionarn algunos de los inhibidores ms utilizados. Actan a nivel del complejo I (NADH-ubiquinona reductasa): rotenona, producto vegetal, poderoso veneno de peces, amital y otros barbitricos, y anestsicos como halotano. Estas sustancias impiden la llegada a la CoQ de hidrgenos procedentes de sustratos oxidados por deshidrogenasas ligadas a NAD. No afectan, en cambio, la oxidacin de succinato y otros sustratos que ceden hidrgenos a flavoprotenas con FAD, probando as que stos siguen otra va. El antibitico antimicina A inhibe el transporte de electrones en el complejo III. Cianuros (CN), monxido de carbono (CO)

y azidas (N3-) inhiben especficamente la citocromo-oxidasa o complejo IV y bloquean la etapa final de activacin del oxgeno. (Blanco 2001) El uso de inhibidores no slo ha ayudado a deducir la secuencia de la cadena respiratoria, sino que ha permitido conocer mejor el mecanismo de accin de algunos frmacos y venenos. El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto de algunos inhibidores sobre el flujo de electrones a travs de la cadena respiratoria ubicada en la mitocondria.

II.

MATERIALES 1. Material biolgico: Homogenizado heptico 2. Material y equipo de laboratorio: Juego de pipetas 10,5, 2 y 1 mL Tubos de ensayo Gradillas 3. Reactivos: Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4 2,6 Diclorofenolindofenol 0,02% Malonato 0,1 M Cianuro de sodio 0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M 4. Sustratos: Succinato 0,1 M(sustrato natural) p-Fenilendiamina(sustrato artificial)

III.

PROCEDIMIENTO Se prepararon los siguientes sistemas. A. SISTEMA DE SUCCINATO: TUBOS DE VIDRIO 1 Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4 2,6 Diclorofenolindofenol 0,02% Succinato 0,1 M Malonato 0,1 M Cianuro de sodio 0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M Homogenizado heptico 1.5 1.0 0.2 --------2 1.2 1.0 --------0.5 3 1.0 1.0 0.2 ------0.5 4 0.5 1.0 0.2 0.5 ----0.5 5 0.5 1.0 0.2 --0.5 --0.5 6 0.5 1.0 0.2 ----0.5 0.5

COMPONENTES(mL)

Mezclamos el contenido de cada sistema de reaccin (tubo). Dejamos en reposo a temperatura ambiente.

B. SISTEMA DE LA p-FENILENDIAMINA COMPONENTES(mL) Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7.4 Malonato 0,1 M Cianuro de sodio 0.1 M Barbiturato de sodio 0.1 M p-Fenilendiamina Homogenizado heptico TUBOS DE VIDRIO 1 2.0 ------0.5 --2 1.5 ------0.5 0.5 3 1.0 0.5 ----0.5 0.5 4 1.0 --0.5 --0.5 0.5 5 1.0 ----0.5 0.5 0.5

IV.

RESULTADOS: 1. Sistema de Succinato TUBO COLOR 1 Azul 2 Azul 3 Incoloro 4 Azul 5

Azul

6 Incoloro

2. Sistema de p-Fenilendiamina TUBO COLOR 1 Marrn claro 2 Marrn oscuro 3 Marrn oscuro 4 Marrn claro 5 Marrn oscuro

V.

DISCUSIN

Sistema de Succinato El tubo N 1 contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) pero no tiene el homogenizado heptico (enzima- cadena respiratoria) por lo que no se lleva a cabo ninguna reaccin de reduccin. En el tubo N 2 contiene 2,6 diclorofenolindofenol (indicador) pero a diferencia del tubo N 1 no tiene Succinato (sustrato) pero si tiene el homogenizado heptico (enzima-cadena respiratoria) por lo que no se reduce el indicador. En el tubo N 3 al contener el 2,6 diclorofenolindofenol (indicador), Succinato (sustrato) y homogenizado heptico (enzima- cadena respiratoria) se produce la reduccin de el indicador, porque este capta los e- liberados por la Flavoproteina reducida (fp H2) cadena. En el tubo N 4 el Malonato agregado acta a nivel del complejo II inhibiendo a la succinato deshidrogenasa evitando la reduccin del 2,6 diclorofenolindofenol. En el tubo N 5 la reaccin no fue la esperada.

En el tubo N 6 el barbiturato inhibe a nivel de complejo II e impide que la Flavoproteina done sus electrones a la CoQ. Por lo que el 2,6 diclorofenolindofenol acepta los e- reducindose.

Sistema de p-Fenilendiamina El tubo N 1 contiene solo p-Fenilendiamina (sustrato indicador) por lo que no hay reaccin redox. En el tubo N 2 la cadena respiratoria contenida en el homogenizado heptico oxidada a la p-Fenilendiamina (marrn oscuro) a nivel del Cyt c a la vez que este se reduce, luego este sigue transfiriendo los electronos por el resto de la cadena transportadora. En el tubo N 3 el Malonato acta a nivel de complejo II inhibindolo, pero la pFenilendiamina dona sus e- al Cyt c oxidndose (marrn oscuro).

En el tubo N 4 el Cianuro de sodio acta a nivel de complejo IV, impidiendo que reciba los electrones del Cyt c, donados por la p-Fenilendiamina, impidiendo que esta siga oxidndose, manteniendo su color claro.

En el tubo N 5 el Barbiturato de sodio inhibe la transferencia de e- de las flavinas a la CoQ, pero la p-Fenilendiamina dona sus e- al Cyt c oxidndose (marrn oscuro).

VI.

CONCLUSIONES El Malonato inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo II. El cianuro de sodio inhibe la cadena respiratoria a nivel de complejo IV. El Barbiturato de sodio impide la transferencia de e- a nivel de complejo I y II.

BIBLIOGRAFIA Blanco. Antonio, QUMICA BIOLOGICA, 8ta edicin, 2001, Editorial El Ateneo. Stryer. Lubert, BIOQUMICA, 5ta edicin, 2002, Editorial Reverte S.A.

CUESTIONARIO 1. Sealar los componentes de un sistema de oxido-reduccin biolgica. Para que exista una reaccin redox, en el sistema debe haber un elemento que ceda electrones y otro que los acepte: 5. El agente reductor: Es aquel elemento qumico que suministra electrones de su estructura qumica al medio, aumentando su estado de oxidacin, es decir; oxidndose. 6. El agente oxidante: Es el elemento qumico que tiende a captar esos electrones, quedando con un estado de oxidacin inferior al que tena, es decir; reducido. Cuando un elemento qumico reductor cede electrones al medio se convierte en un elemento oxidado, y la relacin que guarda con su precursor queda establecida mediante lo que se llama un par redox. Anlogamente, se dice que cuando un elemento qumico capta electrones del medio se convierte en un elemento reducido, e igualmente forma un par redox con su precursor reducido.

2. Sealar los componentes de la cadena respiratoria. Los tres componentes de la cadena respiratoria son: Tres grandes complejos proteicos con molculas transportadoras y sus correspondientes. Un componente no proteico: UBIQUINONA (Q) que estn embebidos en la membrana. Una pequea protena llamada citocromo c que es perifrica y se ubica en el espacio intermembrana, pero adosado laxamente a la membrana interna. enzimas

3. De ejemplos de sustratos y el nivel al que ingresan en la cadena respiratoria. El succinato: Ingresa a nivel del complejo II. La P Fenilendiamina: Ingresa a nivel del complejo IV.

4. De ejemplos de inhibidores de la cadena respiratoria. Los inhibidores reciben este nombre porque su principal funcin es el inhibir el transporte de electrones en la cadena de la respiracin. Los inhibidores del transporte de electrones ms comnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales segn el sitio de la cadena respiratoria donde actan: a. Sobre la NADH-deshidrogenasa, bloqueando la transferencia de electrones entre la flavina y la ubiquinona. (Inhibidores del sitio I): Barbitricos, como el amobarbital. Piericidina A (antibitico). Rotenona (insecticida).

b. Acta bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1. (inhibidores de sitio III): Antimicina.

c. Actan sobre el Hemo a3 de la citocromooxidasa impidiendo su interaccin con el oxgeno (inhibidores de sitio IV): Cianuro. Monxido de carbono. H2S.

5. Que entiende por fosforilacin oxidativa. La fosforilacin oxidativa es una ruta metablica que utiliza energa liberada por la oxidacin de nutrientes para producir adenosn trifosfato (ATP). Se le llama as para distinguirla de otras rutas que producen ATP con menor rendimiento, llamadas "a nivel de sustrato".

6. De ejemplos de desacopladores de la fosforilacin oxidativa. Una clase importante de antimetabolitos son los agentes desacopladores ejemplificados por el 2,4-dinitrofenol (DNP). Los agentes desacoplantes actan como cidos lipoflicos dbiles, que se asocian con protones en el exterior de la mitocondria, que pasan a travs de la membrana unidos a un protn, y que se disocian del protn en el interior de la mitocondria. Estos agentes causan tasas de respiracin mxima pero el transporte de electrones no genera ATP, debido a que los protones translocados no regresan a la matriz mitocondrial a travs de la ATP sintasa.

7. Que entiende por fosforilacin a nivel de sustrato. Es la sntesis de ATP (o de otro nucletido trifosfatado) por transferencia de un grupo fosforilo y una molcula fosforilada de ADP (o de otro nucletido difosfatado) en la que no participa la ATP-sintasa. Una fosforilacin a nivel de sustrato es la formacin de un nuevo enlace de fosfato de alta energa en la que NO PARTICIPA EL OXIGENO. Por ejemplo la fosfoglicerato quinasa y la piruvato quinasa catalizan la fosforilacin a nivel de sustrato en la glicolisis.

8. Establezca diferencias y semejanzas entre fosforilacin oxidativa en la cadena respiratoria y la fosforilacin a nivel de sustrato. La fosforilacin oxidativa a nivel de sustrato no utiliza la ATP sintasa, por el contrario las fosforilacin oxidativa si la utiliza. Las dos producen ATP, debido a la fosforilacin del ADP. La fosforilacion oxidativa a nivel de sustrato aparece en la glicolisis, la fosforilacin oxidativa aparece luego de la cadena de transporte de electrones. La fosforilacin oxidativa es apoyada por una fuerza protn motriz generado por los complejos de la cadena de transporte de electrones. La fosforilacin oxidativa es endergnica, pero la fosforilacin oxidativa a nivel de sustrato es exergnica.

La fosforilacin oxidativa se da en aerobiosis, la fosforilacin oxidativa a nivel de sustrato puede darse en anaerobiosis (glicolisis).

9. Interpretar el cambio del estado incoloro ha coloreado del p-Fenilendiamina. La p-Fenilendiamina participa como sustrato adems de ser indicador. La p-Fenilendiamina es un sustrato indicador artificial que en estado oxidado presenta un color marrn oscuro, en la cadena de electrones acepta electrones liberados por el Cyt c reducida, reduciendo a la forma marrn claro. La velocidad de transferencia de electrones puede entonces medirse siguiendo la perdida de color del pigmento.

10. Graficar en una cadena de oxido-reduccin biolgica la va de entrada del 2,6 Diclorofenolindofenol y la p-Fenilendiamina.