Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010 - 2

Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi
DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1 1

PRINSIP TEKNOLOGI
PRINSIP TEKNOLOGI
DNA REKOMBINAN
DNA REKOMBINAN
DEBBIE S. RETNONINGRUM
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2 2
PUSTAKA
PUSTAKA
1. Glick, BR and J J Pasternak, 2003, Molecular
Biotechnology: Principles and Applications of
Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110
2. Groves MJ , 2006, Pharmaceutical
Biotechnology, hal. 44-55
3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis,
hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme
berbeda: fenomena umum di alam.
Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus
menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap
gejala difteri.
Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh
virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam
alam.
Duplikasi fenomena alamdi laboratorium
Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi
genetik ke dalam suatu organisme.
Manipulasi genetik
E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri)
Saccharomyces cerevisiae (ragi)
Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara
tradisional.
CONTOH PRODUK REKOMBINAN
ANTIBODI REKOMBINAN
PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum
manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen
jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor
nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin
manusia
VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria
VAKSIN DNA
TERAPI GEN
PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit,
resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen
PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak,
penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)
LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR
(= VEKTOR REKOMBINAN)
TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG
& PERBANYAKAN DNA
SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR
REKOMBINAN
DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA
SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)
1972 Stanley Cohen dan
Herbert Boyer
DNA
kromosom
Potong dengan enzim restriksi
DNA
plasmid
ligasi
DNA rekombinan
transformasi sel
transforman
1 sel tumbuh jadi 1 koloni
klon
Kloning
Kloning
DNA
DNA
ke
ke
Plasmid
Plasmid
SUMBER DNA SISIPAN
SUMBER DNA SISIPAN
TIGA PENDEKATAN:
KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA
GENOMIK
PRODUK PCR
mRNA cDNA (eukariot)
Kepustakaan genomik
Kepustakaan genomik
(genomic library)
(genomic library)
Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup
semua gen dari suatu organisme
Contoh ukuran genom:
Bacillus anthracis: 5,1 5,2 Megabasa
Escherichia coli: 4 Megabasa
Pseudomonas putida: 6,0 6,1 Megabasa
Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa
KROMOSOM
KROMOSOM
vs
vs
PLASMID
PLASMID
PLASMID
PLASMID
DNA UNTAI GANDA
BERBENTUK LINGKARAN
BERSALINAN TINGGI
BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)
DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL
DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)
ADA DUA GEN MARKER:
UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR
UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN
VEKTOR (Plasmid)
VEKTOR (Plasmid)
VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA
VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan
komponen untuk mempermudah proses downstream/pemurnian)
Beberapa contoh vektor kloning
Beberapa contoh vektor kloning
Nama Tipe Sel inang Keterangan
pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin.
Vektor untuk tujuan umum
pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac. Vektor untuk tujuan umum
pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac.
gt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA
YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle
PETA PLASMID
PETA PLASMID
ENZIM RESTRIKSI
ENZIM RESTRIKSI
MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA
INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI
TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA
REKOMBINAN
MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE
MENGENALI URUTAN PALINDROM
5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
DNA (ligase)
5- NNNG
OH P
AATTCNNN -3
3- NNNCTTAA
P OH
GNNN -5
ligase
5- NNNGAATTCNNN -3
3- NNNCTTAAGNNN -5
ENZIM RESTRIKSI & LIGASE
ENZIM RESTRIKSI & LIGASE
DNA (enzim restriksi)
5- NNNGAATTCNNN -3
3- NNNCTTAAGNNN -5
EcoRI
5- NNNG
OH P
AATTCNNN -3
3- NNNCTTAA
P OH
GNNN -5
Sisi pengenalan enzimrestriksi
Urutan nukleotida rantai atas =
Urutan nukleotida rantai bawah
CONTOH
CONTOH
ENZIM RESTRIKSI
ENZIM RESTRIKSI
EcoRI (Escherichia coli galur R): GAATTC (ujung lancip)
BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): GGATCC (ujung lancip)
BglII (Bacillus globigii): AGATCT (ujung lancip)
SalI (Streptomyces albus): GTCGAC (ujung lancip)
PstI (Providencia stuartii 164): CTGCAG (ujung lancip)
HindIII (Haemophilus influenzae): AAGCTT (ujung lancip)
KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTACC (ujung lancip)
XbaI (Xanthomonas bradii): TCTAGA (ujung lancip)
HaeIII (Hemophilus aegyptius): GGCC (ujung tumpul)
Kloning
Kloning
Produk
Produk
PCR
PCR
PCR
S. pyogenes M12
Gen ska
Ligasi
pGEMT
rekombinan
SDM
Transformasi
pGEMT/ska
E. coli XL-Blue
LIGASI PRODUK PCR KE
LIGASI PRODUK PCR KE
pGEM
pGEM
-
-
T
T
Gen ska
A
A
pGEM-T
+
pGEM-T
REKOMBINAN
ligasi Transformasi
E. coli J M109
E. coli pGEM-T REK
Kontrol +
Kontrol
LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTG LB/Amp
Streptococcus pyogenes
Transformasi
Transformasi
info genetik ditransfer ke sel inang dengan
metode transformasi
Sel inang dibuat kompeten (siap menerima
DNA asing) modifikasi struktur dinding sel
Metode transformasi : heat shock/elektroporasi
Transformasi
Sel kompeten
Seleksi Biru-Putih
Seleksi
Seleksi
Transforman
Transforman
SELEKSI BIRU PUTIH
SELEKSI BIRU PUTIH
MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?
PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE
GALAKTOSIDASE)
X-GAL BIRU
DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ
GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI
X-GAL TIDAK DIURAIKAN PUTIH
Deteksi
Deteksi
keberadaan
keberadaan
DNA
DNA
sisipan
sisipan
Analisis migrasi
Analisis restriksi Elektroforesis gel
PCR
Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)
ELEKTROFORESIS
ELEKTROFORESIS
GEL
GEL
Gel agarosa atau poliakrilamid
DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat):
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya:
migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar
Visualisasi:
etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi
dengan pemaparan UV)
Elektroforesis
Elektroforesis
G
G
el
el
Agarosa
Agarosa
Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA
KONFIRMASI
KONFIRMASI
pGEM
pGEM
-
-
T REKOMBINAN
T REKOMBINAN
Isolasi pGEM-T/ska
(kit Qiaprep, Qiagene)
1 = pGEM-T rekombinan
2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan
1 2
Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan <
ukuran plasmid dengan DNA sisipan
1419 pb
517 pb
Isolasi Plasmid Rekombinan
1 2 3
Koloni Putih
Koloni Biru
Elektrogram hasil isolasi plasmid
koloni biru dan putih :
1. Koloni biru
2. Koloni putih
3. Koloni biru
Koloni
Biru
pGEM-T (3000 bp)
881 pb
DNA sisipan
1 2
Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI
1. Marka pUC19/HinfI
2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI
Analisis Restriksi pGEM-T
rekombinan
KONFIRMASI
KONFIRMASI
pGEM
pGEM
-
-
T REKOMBINAN
T REKOMBINAN
HASIL
HASIL
PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA
PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA
DNA SISIPAN
DNA SISIPAN
(DNA Sequencing)
(DNA Sequencing)
HASIL SEKUENSING
HASIL SEKUENSING
Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal
(Analisis homologi/kesamaan program BLAST dari NCBI)

Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010 - 2

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Prinsip Teknologi Dna Rekombinan 2010 - 2

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Sekolah Farmasi ITB Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Bioteknologi Farmasi Farmasi - -FA 4202 FA 4202 Prinsip Teknologi

DNA Rekombinan Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1 1

Anda mungkin juga menyukai