Anda di halaman 1dari 3

2.4.

Automation Platform Description Pipet otomatis yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tecan Freedom Evo 100 (Tecan, Reading, Inggris) dilengkapi dengan empat saluran cairan berlengan dan satu gripper, RoMa, lengan. Alat ini mampu mengontrol lingkungan (suhu, O2 dan tingkat CO2), dan prosesnya terintegrasi dengan lempeng. Lihat pada Gambar . 1 ( a) . lengan penanganan cair dilengkapi dengan jarum suntik 1 mL dan digunakan hanya untuk meminimalkan kontaminasi silang. Pengendalian platform otomatis dan peripheral terkait adalah melalui EvowareTM Standard. Skema dari dek platform otomatis menunjukkan lokasi perangkat, seperti ditunjukkan pada Gambar . 1 ( b ) 2.5. Automated Standard Operating Procedures (SOPs) SOP dirancang secara otomatis. Sebelum memulai setiap bagian secara otomatis, semua reagen yang diisi ulang dan sudah dihangatkan sebelumnya dalam reagen melalui rak oleh sirkulasi air hangat dari inkubator. Setiap lempeng kultur diterima setelah 2 hari pertumbuhan yang telah menunjukkan cukup untuk mencapai > 80% pertumbuhan dan optimal untuk mempertahankan pluripotency (kemampuan sel untuk berdiferensiasi menjadi salah satu dari 3 layer berikut yaitu endoderm, mesoderm atau eksoderm) dari ESCs. Lalu setiap lempeng dikeluarkan dari inkubator. Rak kemudian di miringkan 30o relatif terhadap dek robot. DPBS yg sudah dihangatkan sebelumnya, ditambahkan dan dengan begitu permukaan dapat dicuci dengan baik dengan memiringkan rak antara 0 dan 30 derajat serta dilakukan sebanyak lima kali. Lalu DPBS dikeluarkan dan tripsin hangat ditambahkan ke setiap sumur. Setelah memastikan tripsin menutupi permukaan, piring itu dikembalikan ke inkubator selama 5 menit pada suhu 37 C. Setelah inkubasi itu selesai, tripsin itu dipadamkan menggunakan serum berisi media dan suspensi sel dicampur, untuk memastikan pemulihan yang efisien sel. Suspensi sel kemudian dipindahkan ke persegi 96-deep square well plate (ABgene, Epsom, Inggris) dengan basis kerucut untuk di sentrifugasi. Setelah sentrifugasi, plat sel disuspensikan dalam medium segar. Jika terjadi 'perpecahan pada sel' suspensi sel digunakan untuk langsung menyuntik kultur baru menggunakan proporsi yang ditetapkan dari sel yaitu, seperenam. Optimum waktu inkubasi tripsin ditentukan dengan mengekspos kultur lempeng untuk

beberapa kali setelah media pendinginan ditambahkan dan suspensi sel dipisahkan. Sel-sel yang masih melekat ditambahkan dengan tripsin selama 8 menit untuk memastikan semua sel

telah dipisahkan dan jumlah sel ditentukan untuk memungkinkan perhitungan efisiensi disosiasi. Jumlah sel dan kelangsungan hidup disajikan sebagai rata-rata disatu plate. 2.6. Analytical methods 2.6.1. Cell density, viability and GFP expression Konsentrasi sel hidup dan kelangsungan hidup sel diukur dengan pewarnaan. Setelah itu di inkubasi 10 menit sampel dianalisis pada EasyCyte Guava 96-flow cytometry menggunakan Guavas ExpressPlusTM software. Populasi yang bisa terus hidup diukur berdasarkan copewarnaan dengan ViaCount tersebut. 2.6.2. Quantitative RT-PCR Terbalik transkripsi polymerase chain reaction (RT - PCR) adalah salah satu dari banyak varian polymerase chain reaction (PCR) . Teknik ini umumnya digunakan dalam biologi molekuler untuk mendeteksi tingkat ekspresi RNA . RT - PCR sering kali dianggap real-time polymerase chain reaction (qPCR) oleh mahasiswa dan ilmuwan Namun, mereka adalah teknik yang terpisah dan berbeda. RT - PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen kualitatif melalui penciptaan DNA komplementer (cDNA) transkrip dari RNA, qPCR digunakan untuk mengukur secara kuantitatif amplifikasi DNA menggunakan probe neon. qPCR juga disebut sebagai PCR kuantitatif. RT-PCR kuantitatif digunakan untuk mengukur mRNA baik secara relatif dan absolut. Itu dapat diterapkan untuk kuantifikasi mRNA dinyatakan dari gen endogen, dan ditransfeksikan gen stabil atau transien transfeksi. Ini adalah metode yang paling sensitif dalam analisis kuantitatif mRNA. 2.6.3. Immunocytochemistry (ICC) Teknik laboratorium umum yang menggunakan antibodi untuk menargetkan peptida tertentu atau antigen protein dalam sel melalui epitop tertentu. Antibodi terikat kemudian dapat dideteksi dengan menggunakan beberapa metode yang berbeda. ICC memungkinkan peneliti untuk mengevaluasi apakah atau tidak sel dalam sampel tertentu mengekspresikan antigen yang bersangkutan. Dalam kasus di mana sinyal immunopositive ditemukan, ICC juga memungkinkan peneliti untuk menentukan kompartemen sub-seluler mengekspresikan antigen.