Anda di halaman 1dari 3

Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk Diagnosis Human Immunodeficiency Virus (HIV)

Muljati Prijanto Pusat Penelitian Penyakit Menular, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan RI., Jakarta

PENDAHULUAN Human Immunodeficiency Virus (HIV) adalah retrovirus yang menyebabkan penyakit AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrome). Saat ini dikenal adanya virus HIV-1 dan HIV-2 yang berbeda baik genetik maupun antigenik. Penyakit AIDS pertama dilaporkan tahun 1981 di Amerika Serikat dan kini meluas menjadipandemi dan masalah internasional. Bi1a HIV masuk ke dalam tubuh, ia akan menyerang limfosit T4 yang berperan penting dalam mengatur sistem kekebalan; kini diketahui bahwa virus tersebut juga merusak sel-sel tubuh lainnya. Adanya enzim reverse transcriptase yang dapat mengubah RNA menjadi. DNA menyebabkan virus dapat berintegrasi dengan sel hospes; selanjutnya sel berkembang biak dengan mengandung bahan genetik virus. Infeksi oleh HIV menjadi irreversibel dan berlangsung seumur hidup(1). Diagnosis laboratorium penyakit virus dapat dilakukan dengan 2 metode yaitu: 1. langsung: secara isolasi virus dari sampel dan 2. tidak langsung, dengan melihat respon zat anti spesifik. Metoda langsung yang umum digunakan antara lain elektron mikroskopis dan deteksi antigen virus. Pada tahun-tahun terakhir ini ada perhatian besar pada metode langsung berdasarkan ditemukannya asam nukleat (AN) spesifik dari virus dengan teknik hibridisasi. Teknik ini dalam laboratorium klinik dibuktikan sangat berguna untuk infeksi dengan non cultivated (2). Dasar teknik hibridisasi adalah ikatan hidrogen dari AN probe yang di label dengan target genome virus dan pendeteksian dari ikatan ini dengan menggunakan kolorimetri atau zat radioaktif. Untuk deteksi, diperlukan sedikitnya 1041O salinan target genome. Jumlah AN virus

tersebut dapat ditemukan dalam banyak infeksi virus, namun ada juga yang jumlahnya terlalu kecil untuk uji hibridisasi. Pada infeksi tahap awal yang mungkin ada hanya sejumlah kecil partikel dan adanya respon imun. Pada infeksi lanjut, mungkin ada integrasi dari DNA virus ke dalam genome hospes, kadang-kadang dengan genome virus yang sangat sedikit dan tanpa adanya petanda virus. Infeksi virus seperti HIV dan HBV mungkin juga menekan sistem imun sehingga sedikit atau tidak ada zat anti spesifik yang dihasilkan terhadap protein virus. Dalam keadaan seperti ini diperlukan teknik untuk dapat mendeteksi virus yang jumlahnya sangatkecil. Hal ini mungkin dapat dicapai dengan cara isolasi virus dalam kultur jaringan dan juga dengan mengamplifikasi DNA menggunakan teknik PCR. Isolasi virus adalah cara diagnosis yang tepat, tapi dalam beberapa hal PCR analog dengan pertumbuhan virus dalam kultur jaringan. Kelebihan yang ada pada PCR adalah bahwa hal-hal seperti inokulum yang cukup dan persyaratan lain seperti halnya dalam sistem kultur tidak diperlukan lagi. Inokulum dari PCR adalah naked ' AN dan tidak lebih hanya spesifik "primer" dari target sekuendan tidak semua genome harus ada. LATAR BELAKANG Uji serologis yang digunakan sekarang memberikan hasil cepat dan sensitif untuk menapis darah dan produk darah terhadap adanya zat anti HIV tipe I (HIV-1). Sampel yang reaktif kemudian diperiksa lebih lanjut dengan cara Western Blot, immunofiuorescentassay(IFA), radioimmunoprecipitationassay (RIPA). Walaupun pemeriksaan ini sensitif dan spesifik untuk HIV,

Cermin Dunia Kedokteran No. 75, 1992 17

deteksi virus secara langsung dapat dipertimbangkan mengingat beberapa alasan : 1. Infeksi virus HIV yang laten; uji langsung dapat membantu identifikasi individu yang terinfeksi virus tanpa adanya perubahan serologis. 2. Mendeteksi HIV pada bayi; zat anti maternal dapat bertahan sampai 15 bulan sehingga sulit untuk dibedakan dengan zat anti bayi. 3. Mendeteksi virus secara langsung dapat membantu inenentukan status individu dengan hasil Western Blot negatif ke dalam kelompok risiko tinggi atau rendah. 4. Berguna untuk membantu pembelahan virus secara aktif maupun laten pada pasien selama pengobatan. Mengingat sirkulasi virus bebas dalam tingkat rendah, keberhasilan deteksi bervariasi antara 10% 75%, namun ada beberapa laboratorium melaporkan virus recovery dari penderita yang mendekati 100%(2). Pada mulanya PCR digunakan untuk mendiagnosis penyakit genetik keturunan seperti sickle cell anemia (Saiki dkk, 1985). Selanjutnya PCR dapat digunakan untuk mendiagnosis virus terutama HIV. Pengembangan terhadap virus lain telah dilakukan pula. PCR dapat digunakan untuk mendeteksi sekuen DNA HIV dari established cell lines dalam jaringan set, semen, sel mononuklear dan supernatan dari penderita AIDS atau penderita ARC. (Kwok dkk, 1987). Studi lebih jauh menunjukkan adanya kemungkinan untuk mendeteksi HIV dalam DNA langsung yang diisolir dari set darah tepi set mononuklear (PBMCs) individu seropositif, tetapi tidak dalam DNA dari individu seronegatif(Ou dkk, 1988). Oleh karena itu pemeriksaan ini digunakan untuk mendiagnosis infeksi HIV pada anak-anak (DeRossi dkk, 1988,Laure dkk, 1988) dan selanjutnya digunakan untuk mengindentifikasi HIV dalam individu seronegatif dalam kelompok risiko tinggi (Loche & Mach, 1988) dan DNA HIV pada penderita seropositif haemophiliacs (Taylor, 1988). Pasangan "primer" yang biasa digunakan untuk HIV-1 dan HIV-2 atau spesifik untuk masing-masing virus telah digunakan untuk membedakan antara 2 virus yang berhubungan (Raufield dkk, 1988). Spesimen patologis pada umumnya difiksir dengan formalin, parafin dan disimpan. Lai Goldman dkk (1988) menunjukkan bahwa DNA yang diekstraksi dari jaringan tersebut merupakan substrat yang cocok untuk PCR HIV. Beberapa kelompok telah memodifikasi protokol PCR dengan memasukkan reverse transcriptase; dengan demikian RNA HIV dapat dideteksi seperti halnya DNA. (Byrne dkk, 1988, Hart dkk 1988, Murakawa dkk 1988). Hal ini memungkinkan deteksi virus bebas dalam darah dan membedakan antara replikasi aktif dan infeksi laten tanpa RNA transcriptase dengan memonitor RNA ekstraseluler, RNA intraseluler dan DNA intraseluler(1). INDIVIDU YANG PERLU DIPERIKSA Penggunaan PCR pada sampel yang diketahui mengandung zaf anti HIV, antigen atau kultur positif, bukan merupakan pemeriksaan penapis yang tepat. Namun secara umum pe-

meriksaan ini paling baik digunakan untuk tersangka penderita, yang secara serologi tidak jelas menunjukkan adanya infeksi, termasuk anak-anak dari ibu seropositif (De Rossi dkk, 1988; Laure dkk 1988), pasangan yang salah satunya seropositif; pemakai obat secara intravena dan untuk individu yang meskipun tidak secara pasti seropositif tetapi mungkin terkena atau tertular infeksi dari retrovirus yang lain. Tersangka yang diperiksa dengan PCR menunjukkan hasil positif terhadap HIV 1 dan 2, bukan berarti bahwa ada reaksi silang virus, tetapi karena memang tersangka terinfeksi kedua jenis virus tersebut. PCR direkayasa tidak hanya membedakan antara virus RNA dan DNA, tetapi juga dapat memonitor jenis virus. Secara nyata dapat ditunjukkan dengan peningkatan antigen atau zat anti pada pasien yang sedang dalam pengobatan. Selain itu dapat untuk memeriksa darah dari sejumlah besar donor untuk memastikan apakah mereka bebas virus dan untuk memeriksa kandidat vaksin. PCR PCR adalah cara in vitro untuk memperbanyak target sekuen spesifik AN untuk analisis cepat atau karakterisasi, walaupun material yang digunakan pada awal pemeriksaan sangat sedikit. Pada dasarnya PCR meliputi tiga perlakuan yaitu: denaturisasi, hibridisasi dari "primer" sekuen DNA pada bagian tertentu yang diinginkan, diikuti dengan perbanyakan bagian tersebut oleh Tag polymerase; dikerjakan dengan mengadakan campuran reaksi dalam tabung mikro yang kemudian diletakkan pada blok pemanas yang telah diprogram pada seri temperatur yang diinginkan. Teknik ini ditemukan oleh Kary Mullis dari Cetus Corporation (Saiki dkk 1985, Mullis dan Faloona 1987, Saiki dkk 1988) dan sekarang digunakan secara luas dalam penelitian biologi (Orkin 1987, Marx 1988, Schochetman dkk 1988) (1). Pada dasarnya, target DNA diekstraksi dad spesimen dan secaraspesifikmembelah dalam tabungsampai diperoleh jumlah cukup yang akan digunakan untuk deteksi dengan cara hibridisasi. Replikasi yang mungkin dicapai adalah dalam kelipatan jutaan atau lebih dengan menggunalcan oligonukleotid primer yang berkomplemen terhadap masing-masing rantai dari target sekuen ikatan rangkap. Jarak antara letak ikatan dari 2 primer menetapkan ukuran produk yang diamplifikasi. Target mula-mula didenaturisasi pada suhu 9095C dan didinginkan antara 3750C untuk membiarkan annealing spesifik antara primer dan target DNA. Ini membuat cetakan untuk enzym Taq polimerase yang pada suhu 6772C mengkopi masing-masingrantai. Setiap produkakan terdiri dari sekuen yang saling melengkapi 1 dari 2 primer dan akan menguatkan dalam lingkaran sintesis berikut. Hubungan antara tingkat amplifikasi (Y) dengan efisiensi reaksi (X) dan jumlah cycle adalah: Y = ( 1 + 1 )n Sebagai contoh: untuk 20 cycles dengan 100% efisiensi adalah 1.048.576 kali amplifikasi, dengan 80% efisiensi turun menjadi 127.482, berarti ada 88% produk yang hilang(1). Salah satu hambatan dalam diagnosis PCR adalah adanya

18 Cermin Dunia Kedokteran No. 75, 1992

false negative. Hart dkk (1988) menemukan 1 dari 21 spesimen seropositif adalah negatif untuk HIV melalui analisis PCR dari DNA dan RNA. Ou dkk (1988) menemukan 6 dari 11 spesimen seropositif adalah negatif untuk HIV dengan PCR. Penggunaan lebih dari 1 pasang primer merupakan cara untuk menghindari hasil false negative yang dianjurkan oleh peneliti berikutnya, juga Laure dkk (1988). Beberapa hasil false negative dapat dihindarkan dengan memilih primer dari bagian yang berlawanan dari genome. Primer SK 38/39 dan SK 68/69 merupakan pilihan yang baik digunakan untuk HIV (Ou dkk, 1988). Pada penggunaan pasangan primer ganda, satu dari masingmasing secara terpisah diperiksa dengan masing-masing pasangan, atau 2 atau lebih pasangan primer digunakan pada pemeriksaan yang sama; cara kedua tidak selalu mudah dilakukan selama pasangan primer mungkin memiliki perbedaan dalam annealing, sifat ikatan polimerase yang berbeda dan mungkin bekerja sebagai penghambat yang bersaing. Dalam hal ini penting untuk menenukan secara empirik primer mana yang dapat dikombinasikan dalam reaksi yang sama. Pasangan primer SK-3839 dan atau SK-145101 telah berhasil digunakan untuk mendeteksi HIV pada lebih dari 96% individu dengan zat anti positif (Ou dkk, 1988, Jackson dkk, Liston dkk). PCR dapat mendeteksi molekul tunggal dari target DNA dan juga mengamplifikasi target yang ada sebagai pasangan yang tidak komplet; sebaliknya kontaminasi dan campuran reaksi dengan sejumlah target DNA yang tidak terdeteksi akan memberikan hasil false positive (Lo dkk, 1988). Ketaatan mengikuti prosedur dapat mengurangi risiko kontaminasi. Cara yang cepat dan sederhanadalam menyiapkan sampel dapatpula mengurangi false positive (Kwok, Higurachi,1989) (3). PENGGUNAAN PCR Identifikasi HIV dengan PCR telah memberikan sumbangan dalam diagnosis dan penelitian AIDS sebagai berikut(4): 1) Prosedur telah berhasil digunakan untuk memeriksa bayi lahir dari ibu seropositif selama zat anti maternal masih dimiliki bayi sampai umur 15 bulan, sedangkan diagnosis infeksi HIV secara serologis terhambat. Pada beberapa studi selama ini pe-

nemuan HIV dengan PCR pada bayi memiliki korelasi yang baik dengan perkembangan penyakit. 2) Prosedur telah digunakan untuk menetapkan status infeksi path individu seronegatif. Studi pada golongan risiko rendah, hasil seronegatif menunjukkan bahwa individu tidak terinfeksi. 3) Prosedur telah digunakan untuk mendeteksi sekuen HIV pada individu seropositif dengan gejala, yang hasilnya negatif dengan uji deteksi langsung lainnya, termasuk dengan cara mengkultur virus. 4) Telah digunakan untuk mengindentifikasi infeksi pada sejumlah kecil individu berisiko tinggi sebelum serokonversi. 5) Bila PCR digunakan untuk menapis pasangan seksual seronegatif infeksi HIV-1, hemophiliacs, maka talc satupun (0122) ditemukan mempunyai sekuen HIV, menunjukkan bahwa frekuensi infeksi HIV-1 pada pasangan seksual dengan zat anti negatif mungkin sangat rendah. 6) PCR telah digunakan untuk konfirmasi kasus pertama dan HIV-2 di Afrika Barat yang menjalani pengobatan di Amerika Serikat (CDC 1988). Sebagai tambahan, kasus yang tercatat di Afrika Barat telah terinfeksi oleh HIV-1 dan 2 telah dikonfirmasi dengan PCR (Reyfield dkk,1988). 7) PCR telah digunakan untuk mengevaluasi heterogenisitas virus dalam HIV yang diisolasi (Goodenow dkk 1989).

KEPUSTAKAAN 1. Clewley JP. The polymerise chain reaction, a review of the practical limitatons for human immunodeficiency virus diagnosis,' VirolMethods 1989; 25: 179-88. 2. Jackson KM. The Polymerase Chain Reaction. Kumpulan makalah simposium DNA probing dan tehnik penerapannya, 1990: 13-14. 3. Gibson KM, McLean KA, Clewley JP. A simple and rapid method for detecting human immunodeficiency viru s by PCR. J Virol Methods 1991;00: 00-00. 4. Kellog DE, S Kwok. PCR protocols. A guide to methods and applications. Part IV Diagnostic and forensics. Detection of human immunodificiency virus. Academic Press, 1990; 337-47. 5. Surjadi G. AIDS dan penanggulangannya. Diskusi ilmiah Badan Litbang Kesehatan, 1988. Jakarta; 1-17.

KALENDER PERISTIWA October 11 15, 1992 Kongres Nasional Ikatan Farmakologi Indonesia ke VIII Hotel Pangeran Beach, Padang, INDONESIA Secr..: Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Andalas, Jl. Perintis Kemerdekaan Padang 25128, INDONESIA

Cermin Dunia Kedokteran No. 75, 1992 19