Anda di halaman 1dari 27

MAKALAH PRAKTIKUM BIOKIMIA KLINIS Antioksidan dan Oksidasi Biologi

Disusun Oleh: Dina Haryanti Faritz Azhar Septi Purnamasari Siti Mardiyanti Said Sivia Nurulliana Ummu Hikamah 108102000035 108102000031 108102000027 108102000029 108102000025 108102000010

KELOMPOK 4 FARMASI 5 A

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

10

ANTIOKSIDAN DAN OKSIDASI BIOLOGI


1.1 Tujuan Percobaan

1. Memperlihatkan proses oksidasi senyawa fenol oleh polifenol oksidase (PPO) dalam kentang. 2. Memperlihatkan efek antioksidan vitamin c terhadap oksidasi fenol oleh PPO kentang. 3. Memperlihatkan bahwa minyak bila mengalami oksidasi dapat menjadi tengik. 4. Menetapkan kadar peroksida lipid dalam cairan biologis.

1.2 Waktu dan Tempat 21 oktober 2010 di Lab Biokimia Klinis

1.3 Tinjauan Pustaka a. Uji Oksidase dalam Kentang dan Pengaruh Pemberia Vitamin C Fenol atau asam karbolat atau benzenol adalah zat kristal tak berwarna yang memiliki bau khas. Rumus kimianya adalah C6H5OH dan strukturnya memiliki gugus hidroksil (-OH) yang berikatan dengan cincin fenil. Kata fenol juga merujuk pada beberapa zat yang memiliki cincin aromatik yang berikatan dengan gugus hidroksil. Fenol memiliki kelarutan terbatas dalam air, yakni 8,3 gram/100 ml. Fenol memiliki sifat yang cenderung asam, artinya dapat melepaskan ion H+ dari gugus hidroksilnya. Pengeluaran ion tersebut menjadikan anion fenoksida C6H5O yang dapat dilarutkan dalam air.

Dibandingkan dengan alkohol alifatik lainnya, fenol bersifat lebih asam. Hal ini dibuktikan dengan mereaksikan fenol dengan NaOH, di mana fenol dapat melepaskan H+. Pada keadaan yang sama, alkohol alifatik lainnya tidak dapat bereaksi seperti itu. Pelepasan ini diakibatkan pelengkapan orbital antara satusatunya pasangan oksigen dan sistem aromatik, yang mendelokalisasi beban negatif melalui cincin tersebut dan menstabilkan anionnya. Fenol didapatkan melalui oksidasi sebagian pada benzena atau asam benzoat dengan proses Raschig. Fenol juga dapat diperoleh sebagai hasil dari oksidasi batu bara. Fenol merupakan komponen utama pada antiseptik dagang, triklorofenol atau dikenal sebagai TCP (trichlorophenol). Fenol juga merupakan bagian komposisi beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin, pembasmi rumput liar, dan lainnya). Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran kimiawi pada kulit yang terbuka. Rumus bangun fenol dapat dilihat pada gambar 1 di bawah ini. Fenol merupakan komponen utama pada anstiseptik dagang, triklorofenol atau dikenal sebagai TCP (trichlorophenol). Fenol juga merupakan bagian komposisi beberapa anestitika oral, misalnya semprotan kloraseptik. Fenol berfungsi dalam pembuatan obat-obatan (bagian dari produksi aspirin) pembasmi rumput liar, dan lainnya. Fenol yang terkonsentrasi dapat mengakibatkan pembakaran kimiawi pada kulit yang terbuka. Enzim merupakan protein yang dihasilkan oleh sel hidup yang bertindak sebagai katalis dalam reaksi kimia organik, yang dapat mengubah bahan sedangkan dia sendiri tidak mengalami perubahan. Enzim tersebut dapat terus bekerja setelah kematian organisme. Berkaitan dengan hal tersebut, kinerja fenol dalam enzim, telah dilaporkan oleh beberapa peneliti dengan objek percobaan yang berbedabeda. Sebagai senyawa aromatic, fenol -bila ingin dihilangkan keberadaanya-, dapat

dihilangkan dengan menggunakan enzim extra-cellular peroksidase dengan pH optimal 7-8. Pada pH netral, proses tersebut meningkat, namun mengalami penurunan seiring dengan meningkatnya suhu dari 0 -30 C. Kentang (Solanum tuberosum) mudah sekali mengalami pencoklatan (browning), bila penenganannya kurang baik , salah satu factor yang mempengaruhi adalah asam askorbat, tirosin, enzim polifenol oksidase dan oksigen yang tersedia. Reaksi pencoklatan dapat terjadi melalui dua proses yaitu proses pencoklatan enzimatik, disebabkan adanya enzim PPO dan tirosin yang berperan sebagai substrat sedangkan proses non enzimatis disebabkan karena reaksi Meillard, karamelisasi atau oksidasi asam askorbat (Richardson, 1983 dalam18).Proses pencoklatan yang terjadi akan mengurangi kualitas produk dan menurunkan minat konsumen (Friedman,1990 dalam18). Proses pencoklatan sebenarnya dimulai dari kentang yang dikupas, dipotong-potong, oksidasi asam askorbat, senyawa phenol seperti senyawa tirosin sebagai substrat, akan dikatalisis enzim PPO menjadi quinon dan

berpolimerisasi membentuk o quinon, sehingga menghasilkan warna kecoklatan. Penentuan asam askorbat dalam varietas kentang digunakan untuk proses penghambatan pencoklatan kentang atau proses browning (inhibitor), karena menurut Mondy,1993, asam askorbat dapat menghambat enzim PPO pembentuk melanin. Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat oksidasi, zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah. Antioksidan juga didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki elektron yang

tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam makromolekul biologi.Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit lainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan untuk menangkap radikal bebas. Antioksidan yang banyak ditemukan pada bahan pangan, antara lain vitamin E, vitamin C, dan karotenoid. Antioksidan diharapkan aman dalam penggunaan atau tidak toksik, efektif pada konsentrasi rendah (0,01-0,02%), tersedia dengan harga cukup terjangkau, dan tahan terhadap proses pengolahan produk. Antioksidan penting dalam melawan radikal bebas, tetapi dalam kapasitas berlebih menyebabkan kerusakan sel. Berdasarkan asalnya, antioksidan terdiri atas antioksigen yang berasal dari dalam tubuh (endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Adakalanya sistem antioksidan endogen tidak cukup mampu mengatasi stres oksidatif yang berlebihan. Stres oksidatif merupakan keadaan saat mekanisme antioksidan tidak cukup untuk memecah spesi oksigen reaktif. Oleh karena itu, diperlukan antioksidan dari luar (eksogen) untuk mengatasinya Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dibedakan menjadi antioksidan primer yang dapat bereaksi dengan radikal bebas atau mengubahnya menjadi produk yang stabil , dan antioksidan sekunder atau antioksidan preventif yang dapat mengurangi laju awal reaksi rantai serta antioksidan tersier. Mekanisme kerja antioksidan selular menurut Ong et al. (1995) antara lain, antioksidan yang berinteraksi langsung dengan oksidan, radikal bebas, atau oksigen tunggal; mencegah pembentukan jenis oksigen reaktif; mengubah jenis oksigen reaktif

menjadi kurang toksik; mencegah kemampuan oksigen reaktif; dan memperbaiki kerusakan yang timbul. Antioksidan primer berperan untuk mencegah pembentukan radikal bebas baru dengan memutus reaksi berantai dan mengubahnya menjadi produk yang lebih stabil. Contoh antioksidan primer, ialah enzim superoksida dimustase (SOD), katalase, dan glutation dimustase. Sedangkan, Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa radikal serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh antioksidan sekunder diantaranya yaitu vitamin E, Vitamin C, dan -karoten. Dan Antioksidan tersier berfungsi memperbaiki kerusakan sel dan jaringan yang disebabkan oleh radikal bebas, Contohnya yaitu enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel adalah metionin sulfoksida reduktase. b. Uji Ketengikan Lemak Reaksi oksidasi lemak/minyak merupakan reaksi yang terjadi jika ada kontak antara oksigen dengan minyak atau lemak. Reaksi ini mengakibatkan minyak atau lemak rusak yang ditandai dengan bau tengik. Pada reaksi oksidasi lemak/minyak ini terjadi proses oksidasi asam lemak tidak jenuh yang akan menghasilkan peroksida

Contoh Reaksi Oksidasi Minyak/Lemak

Untuk menghindari terjadinya oksidasi maka digunakan antioksidan. Antioksidan adalah bahan tambahan yang digunakan untuk melindungi komponenkomponen makanan yang bersifat tidak jenuh (mempunyai ikatan rangkap), terutama lemak dan minyak. Meskipun demikian antioksidan dapat pula digunakan untuk melindungi komponen lain seperti vitamin dan pigmen, yang juga banyak mengandung ikatan rangkap di dalam strukturnya. Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi lemak. Untuk mempermudah pemahaman tentang mekanisme kerja antioksidan perlu dijelaskan lebih dahulu mekanisme oksidasi lemak. Oksidasi lemak terdiri dari tiga tahap utama yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal asam lemak, yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif akibat dari hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). Pada tahap selanjutnya, yaitu propagasi, radikal asam lemak akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksi (reaksi 2). Radikal peroksi lebih lanjut akan menyerang asam lemak menghasilkan hidroperoksida dan radikal asam lemak baru (reaksi 3). Inisiasi Propagasi : RH - R* + H* : R* + O2 ROO* (1) (2)

ROO* + RH ROOH +R* (3) Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi lebih lanjut menghasilkan senyawa-senyawa karbonil rantai pendek seperti aldehida dan keton yang bertanggungjawab atas flavor makanan berlemak. Tanpa adanya antioksidan, reaksi oksidasi lemak akan mengalami terminasi melalui reaksi antar radikal bebas membentuk kompleks bukan radikal (reaksi 4)

Terminasi

: ROO* +ROO* - non radikal R* + ROO* - non radikal R* + R* non radikal

(reaksi 4)

Adanya ion-ion logam seperti besi, tembaga, iodium, dll, dapat mendorong terjadinya oksidasi lemak, pada uji ketengikan lemak ini digunakan kalium iodida, dimana minyak tidak jenuh yang mengalami oksidasi, ikatan rangkapnya dapat berubah menjadi peroksida lemak yang ditandai dengan terjadinya ketengikan. Ikatan rangkap akan mengadisi iodium (I2) sehingga ikatan rangkap pada minyak hilang. Bersamaan dengan itu warna iodium pun akan hilang. c. Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis Lipid merupakan sekelompok senyawa heterogen, meliputi lemak, minyak, steroid, malam (wax), dan senyawa terkait, yang berkaitan lebih karena sifat fisiknya daripada sifat kimianya. Lipid memiliki sifat umum berupa : relative tidak larut dalam air, dan larut dalam pelarut nonpolar misalnya eter dan kloroform. Peroksidasi (auto-oksidasi) lipid yang terpajan oleh oksigen

bertanggungjawab tidak saja terhadap pembusukan makanan (rancidity,tengik), tetapi juga kerusakan jaringan in vivo. Peroksidasi ini dapat menjadi penyebab kanker, penyebab peradangan, aterosklerosis, dan penuaan. Efek merugikan diperkirakan disebabkan oleh radikal bebas (ROO , RO , OH ) yang dihasilkan sewaktu terbentuknya peroksida dari asam lemak yang mengandung ikatan rangkap yang diselingi metilen, yi, radikal bebas asam lemak yang terdapat pada asam lemak tidak jenuh ganda alami. Peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai yang menghasilkan radikal bebas secara terus menerus dan peroksidasi lebih lanjut.

Proses keseluruhan dapat diperlihatkan sebagai berikut: 1. Inisiasi ROOH + logam (n)+ 2. Propagasi R + O2 ROO + RH 3. Terminasi ROO + ROO ROO + R R + R ROOR + O2 ROOR RR ROO ROOH + R , dst ROO + logam (n-1)+ + H+ X + RH R + XH

Karena precursor molecular untuk proses inisiasi umumnya adalah produk hidroperoksida ROOH, peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai yang berpotensi merugikan. Untuk mengendalikan dan mengurangi peroksidasi lipid, baik manusia dalam aktivitasnya maupun alam menggunakan antioksidan. Propel galat, hidroksianisol terbutilasi (BHA), dan hidroksitoluen terbutilasi (BHT) adalah antioksidan yang digunakan sebagai zat tambahan makanan. Antioksidan alami antara lain adalah vitamin E (tokoferol) yang larut lipid, dan urat serta vitamin C yang larut air. Betakaroten adalah suatu antioksidan pada PO2 rendah. Antioksidan terbagi menjadi dua kelas : 1) antioksidan preventif yang mengurangi laju inisiasi reaksi berantai; dan 2) antioksidan pemutus-rantai yang mengganggu propagasi reaksi berantai diatas. Antioksidan preventif mencakup katalase dan peroksidase lain misalnya glutation peroksidase yang beraksi dengan ROOH; selenium yang merupakan komponen esensial glutation peroksidase dan mengatur aktivitasnya serta chelator ion logam, seperti EDTA

(etilendiamintetraasetat) dan DTPA (dietilentriaminpentaasetat). In vivo, antioksidan pemutus rantai yang utama adalah superoksida dismutase yang bekerja dalam fase

cair untuk mengakap radikal bebas superoksida (O2); urat; dan vitamin E yang bekerja dalam fase lipid untuk menangkap radikal ROO Peroksidasi juga dikatalisis in vivo oleh senyawa heme dan oleh lipoksigenase yang terdapat di trombosit dan leukosit. Produk lain auto-oksidasi atau oksidasi enzimatik yang penting secara fisiologis adalah oksisterol (dibentuk dari kolesterol) dan isoprostan (prostanoid).

Gambar diatas merupakan reaksi terjadinya peroksidasi lipid. Reaksi dimulai oleh suatu radikal bebaas yang sudah ada (X), oleh sinar, atau oleh ion logam. Malondialdehid hanya dibentuk oleh asam lemak dengan tiga atau lebih ikatan rangkap dan digunakan sebagai ukuran peroksidasi lipid bersama dengan etana dari dua karbon terminal asam lemak 3 dan pentane dari lima karbon terminal asam lemak 6.

1.4 Materi Metode Uji oksidase dalam kentang dan pengaruh pemberian vitamin C Bahan: 1. 2. 3. 4. Ekstrak kentang Larutan fenol 1% Larutan pirogalol 1% Larutan vitamin C

Cara kerja BAHAN Ekstrak kentang Larutan vitamin C Larutan fenol 1% Larutan pirogalol 1% Kocok tabung 1 5 10 tetes Tabung 2 5 10 tetes 10 tetes 3 5 10 tetes 4 5 10 tetes 10 tetes

Uji ketengikan lemak Bahan 1. Minyak kelapa dan minyak jagung 2. Minyak kelapa yang telah dipanaskan berulang 3. Kalium iodide Cara kerja BAHAN Minyak kelapa Minyak jagung Minyak jagung yang telah digunakan / dipanaskan berulang Jumlah KI (hitung jumlah tetesan) hingga warna coklat menetap 1 0,5 ml TABUNG 2 0,5 ml -

3 0,5 ml

10

Uji peroksida lipid dalam cairan biologis Bahan 1. Hemolisat darah 2. Larutan asam trikloroasetat 3. Larutan TBA 0,67 % Cara kerja BAHAN Uji 1 Uji 2 Hemolisat darah (ml) 1 1 Aquadest (ml) Larutan TCA 10%, dingin (ml) 2 2 Aduk dan sentrifugasi (4000 rpm), ambil supernatan Larutan TBA 0,67 % (ml) 3 3 Didihkan 10 menit. Setelah dingin, baca pada 532 nm Hasil: Kadar MDA 1.5 Hasil Pengamatan dan Lampiran Foto Uji 3 1 2 3

Vitamin C Tablet Tabung Bahan

Vitamin C cair

Ekstrak kentang (5ml) 1 + larutan fenol 1% (10 tetes) Ekstrak kentang (5ml) 2 + larutan fenol 1% (10 tetes) + larutan vit. C (10 tetes) Orange Merah kecoklatan

Orange kecoklatan tua

Orange kecoklatan muda

11

Ekstrak kentang (5ml) 3 + larutan pirogalol 1% (10 tetes) Ekstrak kentang (5ml) 4 + larutan pirogalol 1% (10 tetes) + larutan vit C Coklat muda Coklat muda Coklat Tua Coklat tua

ampiran Gambar Pembuatan Larutan vitamin C

Vitamin C tablet yang digunakan

Tablet vitamin yang digerus dan dilarutkan dalam 60ml air

Vitamin C cair yang digunakan

12

Pembuatan Ekstrak Kentang

Pembuatan Ekatrak kentang. Kentang di blender lalu di saring dan diambil filtratnya lalu dimasukan tabung reaksi

Hasil dari ekstrak kentang + substrat + Larutan vitamin

Hasil penambahan dengan menggunakan vitamin c cair. Kiri-kanan : tabung 1, 2, 3, 4

Hasil penambahan dengan menggunakan vitamin C tablet. Kiri-kanan : tabung 1, 2, 3, dan 4 13

Uji Ketengikan Lemak Kelompok 5 a. Menggunakan minyak kelapa baru Percobaan 1 40 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna menjadi coklat Percobaan 2 41 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna menjadi coklat b. Menggunakan minyak kelapa bekas (setelah dipakai/dipanaskan berkalikali) Percobaan 1 35 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna menjadi coklat Percobaan 2 36 tetes KI yang ditambahkan hingga berubah warna menjadi coklat
Tabung

Bahan

Hasil

Minyak baru yang sudah ditetesi larutan iodid

minyak yang sudah digunakan /dipanaskan berulang ditambahi larutan iodida

14

Uji Peroksida Lemak a. Penentuan kadar MDA pada uji 1 Kadar MDA

b. Penentuan kadar MDA pada uji 2 Kadar MDA

c. Penentuan kadar MDA pada blanko Kadar MDA

Lampiran foto :

Hemolisat darah

Hemolisat dimasukkan ke dalam tabung

Hemolisat darah ditambah TCA

Hemolisat darah + TCA divortex

15

Hasil vortex tabung 1, tabung 2 dan blanko

Hemolisat darah + TCA setelah di sentrifugasi

Hasil sentrifugasi

Pemisahan supernatan dan endapan hemolisat darah

Supernatan yang telah diambil + TBA

Supernatan + TBA dipanaskan

1.6 Pembahasan Pembahasan Uji Oksidase dalam kentang dan pengaruh pemberian vitamin C

Tanpa disadari buah seperti apel, pisang dan kentang, jika sudah dipotong maka warna daging buahnya berubah menjadi kecoklatan. Dalam ilmu pangan gejala itu di namakan browning atau pencoklatan. Pencoklatan tersebut diakibatkan karena kerusakan jaringan. Kerusakan jaringan merupakan kerusakan pada protoplasma sel, sehingga fenolase terlepas dari organellanya dan menjadi aktif. Apabila fenolase kontak dengan udara, reaksi pencoklatan secara enzimatis akan terjadi. Substrat fenolik ini akan bereaksi dengan enzim fenol oksidase dan oksigen yang harus berhubungan dengan substrat tersebut. Ikatan yang terjadi akan

16

menghasilkan warna coklat yang jika terjadi pada buah potong, akan menurunkan kualitas buah. Dalam bahan pangan seperti kentang, kelompok enzim oksidase tersebut dan senyawa fenol tersedia secara alami. Enzim yang bertanggung jawab dalam reaksi pencoklatan enzimatis adalah oksidase yang disebut fenolase, fenoloksidase, tirosinase, polifenolase, atau katekolase. Enzim polifenol oksidase atau fenolase terdiri dari 2 tipe enzim, yaitu odifenol dan p-difenol. PPO termasuk dalam golongan enzim oksidoreduktase. Substrat untuk PPO dalam tanaman biasanya asam amino tirosin dan komponen polifenolik seperti katekin, asam kafeat, dan asam klorogenat. Asam klorogenat inilah yang banyak terdapat pada kentang. Oksidasi dari asam klorogenat yang diikuti oleh polimerisasi (gabungan dari monomer-monomer)

menyebabkan pembentukan quinon yang menyebabkan warna coklat pada umbi yang baru terpotong Terjadinya reaksi pencoklatan yang dikatalis oleh enzim tersebut, selain ada subtrat juga harus ada tersedia gugus prostestik Cu++ dan oksigen sebagai asektor hydrogen. Kebanyakan reaksi pencoklatan dasar reaksi pembentukan melalim berwarna coklat reaksi pertama diduga sebagi hidrolisasi sekunder O-kuinon atau karena kelebihan Odifenol. Gugus o-kuinon inilah yang membentuk warna coklat. Proses penghambatan browning dapat dilakukan dengan menambahkan suatu antioksidan sehingga enzim yang mengoksidasi akan menggalami kerusakan. Antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan satu atau lebih elektron kepada radikal bebas, sehingga radikal bebas tersebut dapat diredam (Suhartono, 2002). Berdasarkan sumber perolehannya ada 2 macam antioksidan, yaitu antioksidan alami dan antioksidan buatan (sintetik) (Dalimartha dan Soedibyo, 1999). Ada banyak tanaman yang dapat dijadikan sumber antioksidan alami, seperti rempah-rempah, dedaunan, teh, biji-bijian, serealia, buah-buahan, sayur-sayuran dan tumbuhan laga laut. Bahan pangan tersebut mengandung jenis senyawa yang memiliki antioksidan, seperti asam-asam amino asam askorbat, golongan flavonoid tokoferol, karotenoid, tannin, peptide, malanoidin, produkproduk reduksi, dan asam-asam organic lain (Pratt, 1992). Tujuan praktikum kali ini adalah mengamati efek penambahan vitamin C (asam askorbat) terhadap oksidasi yang dilakukan oleh PPO dan fenol pada kentang. Selain fenol 17

dilihat juga pengaruhnya pada purpurogalin. Penambahan vitamin C dapat menghambat proses pencoklatan pada ekstrak kentang. Hal itu dibuktikan pada praktikum ini, dimana tabung 2 yang berisi ekstrak kentang yang ditambahkan vitamin c lalu diberi larutan fenol dan kocok sebentar, mempunyai warna yang lebih orange dibanding dengan tabung 1 yang berisi ekstrak kentang dan fenol yang berwarna coklat. Selain itu tabung 3 yang berisi ekstra kentang dan larutan pirogalol 1% juga dibandingkan dengan tabung 4 yang berisi ekstrak kentang, larutan pirogalol 1% serta vitamin C. perbedaan warnaya pun terlihat, namun tidak sejelas perbedaan tabung 1 dan 2. Secara umum, mekanisme antioksidasi yang dilakukan vitamin C adalah memperlambat laju autooksidasi dengan berbagai mekanisme di luar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi dengan pengubahan radikal ke bentuk lebih stabil (Gordon, 1990). Mekanisme yang dilakukan adalah Asam askorbat akan bereaksi dengan oksigen dan akan menghambat kerja enzim PPO sehingga reaksi oksidasifenol tidak terjadi. Praktikum kali ini juga membandingkan keefektifan dari vitamin c yang digunakan. Kelompok 2 menggunakan vitamin c tablet yang dilarutkan terlebih dahulu dan kelompok 3 menggunakan vitamin c berbentu larutan. Dari hasil yang diperoleh, perbedaan warna yang terjadi lebih jelas terlihat pada kelompok yang menggunakan vitamin dari tablet yang dilarutkan. Kejadiaan tersebut dimungkinkan karena vitamin C mudah teroksidasi oleh oksigen bebas, sehingga sebelum vitamin c bekerja menghambat PPO sudah bereaksi terlebih dahulu dengan oksigen bebas. Selain itu, konsentrasi vitamin C tablet lebih besar dari vitamin C larutan dimana dalam vitamin c tablet konsentrasinya 1000mg/60ml dan konsentrasi vitamin C cair 1000mg/140ml . Besarnya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan. Pengaruh jumlah konsentrasi terhadap laju oksidasi tergantung pada struktur antioksidan, kondisi sampel yang akan diuji. Antioksidan skunder, asam sitrat, asam askorbat, dan esternya, sering ditambahkan pada lemak dan minyak sebagai kombinasi dengan antioksidan primer. Kombinasi tersebut dapat member efek sinergis sehingga menambah keefektifan kerja antioksidan primer. Antioksidan skunder

18

ini bekerja antioksidan primer. Antioksidan skunder ini bekerja pada satu atau lebih mekanisme berikut (a) memberikan suasana asam pada medium (sistem makanan), (b) meregenerasi antioksidan utama, (c) mengkelat atau mendeaktifkan kontaminan logan prooksidan, (d) menangkap oksigen, (e) mengikat singlet oksigen dan mengubahnya ke bentuk triplet oksigen. Selain penambahan vitamin C sebagai penghambat proses browning ada hal-hal lain yang bisa dilakukan seperti : 1. Mengeluarkan senyawa fenol, yaitu dengan jalan membilas terus menerus

dengan air atau dengan aquadest., melakukan subkult berulang ulang, mengabsorsi dengan arang aktif, mengabsorsi dengan polyvinylpirolidone (PVP).
2. Memodifikasi potensial redok media 3. Mengurangi agen yang menyebabkan terjadinya pencoklatan, yang paling umum biasanya yaitu dengan cara mengurangi jumlah karbohidrat mediu, mengurangi atau memindahkan kontak dengan oksigen. 4. Menghambat dengan enzim phenol oksidase, untuk ini dapat digunakan chelating agents. EDTA telah terbukti dapat menghambat kerja enzim polyphenol oksidase. 5. Pengatur pH rendah, ini dapat dilakukan karena enzim polyphenol oksidase optimalnya pada pH 6.5 dan menurun seirama dengan turunya pH. 6. Penggunaan ruanggelap, karena kerja enzim polyphenol oksidase. 7. Efektifnya dipengaruhi oleh cahaya. Disarankan penggunaan ruanggelap minimal 14 hari setelah penanaman eksplan (Untung Santoso, 2001) .

Uji Ketengikan Lemak

Pada praktikum kali ini kita mencoba untuk menguji ketengikan lemak. Lemak adalah suatu asam lemak merupakan suatu rantai hodrokarbon dengan suatu gugusan karboksil terminal, telah diidentifikasi lebih dari 70 asam lemak yang tersedia di alam. Asam lemak jenuh tidak mengandung ikatan ganda C=C dalam strukturnya, sementara asam lemak tidak jenuh memiliki satu atau lebih ikatan
19

ganda, yang kadang-kadang berada dalam konfigurasi geometris cis. Asam lemak tidak jenuh paling melimpah memiliki satu atau dua ikatan ganda (masing-masing, asam lemak monoenoat dan dienoat); namun, asam lemak olefinik dengan tiga (trienoat) dan empat (tetraenoat) ikatan ganda juga ditemukan secara alamiah. Mula-mula minyak kelapa baru (I) dan minyak kelapa yang sudah dipanaskan (II) masing-masing disiapkan dalam gelas kimia sebanyak 0,5 ml. Kemudian ditambahkan tetesan KI (Kalium Iodida) ke dalamnya. Lalu hitung berapa tetes KI yang ditambahkan sampai kedua minyak tersebut berubah warna menjadi coklat menetap. Pada minyak kelapa baru (I) membutuhkan 40 tetes KI untuk membuat warna minyak menjadi coklat menetap. Minyak kelapa termasuk ke dalam asam lemak tak jenuh yang mengandung ikatan ganda. Ketika ditambahkan tetesan KI (Kalium Iodida) maka ikatan rangkap akan mengadisi Iodium (I2) sehingga ikatan rangkapnya menjadi putus atau hilang. Bilangan iodium adalah suatu ukuran dari derajat ketidakjenuhan. Lemak tidak jenuh dengan mudah dapat bergabung dengan iodium (tiap ikatan rangkap dalam lemak dapat mengambil dua atom iodium). Bilangan iodium ditetapkan sebagai jumlah gram iodium yang diserap oleh 100 gram lemak.

Lain halnya dengan minyak yang sudah dipanaskan (II) membutuhkan hanya 35 tetes KI untuk membuat warna minyak menjadi coklat menetap. Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan pemanasan berulang mengakibatkan meningkatnya

20

kadar asam lemak bebas. Proses pemanasan pada suhu tinggi dapat mempercepat proses oksidasi. Bilangan asam lemak bebas yang semakin tinggi mengindikasikan kerusakan lemak akibat pemanasan. Ketengikan ini terjadi karena proses oksidasi oleh oksigen terhadap asam lemak tak jenuh dalam minyak atau lemak. Proses oksidasi dapat terjadi pada suhu kamar dan selama proses pengolahan menggunakan suhu tinggi. Kerusakan lemak yang utama adalah timbulnya bau dan rasa tengik yang disebut proses ketengikan. Hal ini disebabkan oleh oksidasi radikal asam lemak tidak jenuh dalam lemak. Oksidasi dimulai dengan pembentukan radikal-radikal bebas yang disebabkan oleh faktor-faktor yang dapat mempercepat reaksi seperti cahaya, panas, peroksida; lemak atau hidroperoksida;

Asam lemak tidak jenuh mengalami oksidasi dan menjadi tengik. Bau tengik yang tidak sedap tersebut disebabkan oleh pembentukan senyawa-senyawa hasil pemecahan hidroperoksida yang bersifat sangat tidak stabil dan mudah pecah menjadi senyawa dengan rantai karbon yang lebih pendek oleh radiasi energi tinggi, energi panas, katalis logam, atau enzim. Senyawa-senyawa dengan rantai C lebih pendek ini adalah asam-asam lemak, aldehida-aldehida dan keton yang bersifat volatil dan menimbulkan bau tengik pada lemak. Uji Peroksida Lipid dalam cairan biologis

Pada praktikum ini dilakukan Uji Peroksida Lipid dalam Cairan Biologis, dimana cairan biologis yang digunakan pada praktikum ini berupa darah yang diambil dari seorang probandus. Untuk menggambarkan proses peroksidasi lipid perlu dilakukan

21

analisis kadar MDA. Dimana jumlah MDA yang terbentuk dapat diketahui berdasarkan kemampuan penyerapan cahaya pada panjang gelombang 532 nm. Asam lemak jenuh jamak (PUFA) dapat mengalami proses peroksidasi menjadi peroksida lipid yang kemudian mengalami dekomposisi menjadi Malondialdehida (MDA) yang merupakan produk hasil peroksidasi lipid dalam tubuh dan terdapat dalam bentuk bebas atau terkompleks dengan jaringan di dalam tubuh. Reaksi ionisasi senyawa senyawa radikal bebas juga dapat membentuk MDA dan MDA juga merupakan produk samping biosintesis prostaglandin (Bird dan Drapper, 1984). Konsentrasi MDA dalam material biologi telah digunakan secara luas sebagai indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan indikator keberadaan radikal bebas (Zakaria, 1996). Pengukuran MDA dapat dilakukan dengan pereaksi thiobarbituric acid (TBA) dengan mekanisme reaksi penambahan nukleofilik membentuk senyawa MDA-TBA (Contiet.a l., 1991). Senyawa ini berwarna merah jambu yang dapat diukur intensitasnya dengan menggunakan spektrofotometer. Uji peroksida lipid dalam cairan biologis dalam praktikum ini dilakukan dengan mengukur kadar MDA dari darah probandus dengan metode spektrofotometri menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Metode ini merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk mengukur peroksidasi lipid, dikarenakan mempunyai kepekaan yang cukup tinggi, mudah diaplikasikan untuk berbagai sampel pada berbagai tahap oksidasi lipid dan biayanya murah serta tidak membutuhkan waktu yang lama (Nawar, 1985). Hemolisat darah probandus sebanyak masing masing 1ml dimasukkan ke dalam tabung 1 dan tabung ke 2. Sedangkan sebagai perbandingan, digunakan aquadest sebagai blanko. Masing masing tabung kemudian dicampurkan dengan larutan TCA 10% sebanyak 2ml agar terjadi presipitasi protein sehingga tidak
22

terdapat protein dalam darah yang dapat mengganggu proses selanjutnya, dan kemudian didinginkan. Disentrifugasi (4000 rpm) dan diambil supernatant dari masing masing tabung. Kemudian masing masing tabung ditambahkan 3ml larutan asam tiobarbiturat (TBA) yang selanjutnya didihkan selama 10 menit, dan didinginkan. Lalu dibaca serapan masing masing pada spektrofotometer dengan = 532 nm. Metode ini didasarkan pada reaksi antara kompleks MDA dengan TBA dalam suasana asam yang membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah jambu yang kemudian diukur intensitasnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Senyawa 1,1,3,3-tetraetoksipropana (TEP) digunakan dalam pembuatan kurva standar karena TEP dapat dioksidasi dalam suasana asam menjadi senyawa aldehid yang dapat bereaksi dengan TBA (Contiet.a l., 1991). Berdasarkan hasil percobaan didapatkan bahwa tabung 1 (berisi hemolisat darah+TCA 10%+TBA), tabung 2 (berisi hemolisat darah+TCA 10%+TBA), dan blanko (berisi aquadest) setelah diamati masing masing tabung berwarna keruh kekuningan. Dan kemudian dibaca serapannya pada spektrofotometer dengan = 532 nm nilai absorbansinya adalah 0,044; 0,025; 0,032. Sehingga didapatkan kadar MDA pada masing masing tabung adalah 2,9 X 10-7; 1,6 X 10-7; dan 2,1 X 10-7. Nilai absorbansi dari aquadest (blanko) seharusnya lebih kecil dari nilai absorbansi sample cairan biologis yang diuji. Hal ini terjadi mungkin disebabkan karena kelemahan dari metode ini yaitu banyak senyawa yang terdapat pada sampel biologis seperti karbohidrat, pirimidin, hemoglobin dan bilirubin dapat bereaksi dengan TBA membentuk senyawa yang dapat menghasilkan warna dan juga diabsorbsi pada 530 nm (Wade dan Van Ru, 1989 dalam Contiet.al.1991). Beberapa senyawa tersebut larut dalam asam dan akhirnya tereliminasi oleh pencucian selama proses presipitasi tetapi beberapa tidak, sehingga menyebabkan interferensi.

23

Kemudian, selama dekomposisi termal lipoperoksida plasma menjadi MDA, asam lemak yang tidak terperoksidasi akan terperoksidasi. Inilah yang menjelaskan mengapa hasil penetapan MDA plasma tidak pernah maksimum bahkan setelah perlakuan pemanasan selama beberapa jam (Hackettet.al., 1988 dalam Contiet.al., 1991). Serta, dekatnya panjang gelombang eksitasi dan emisi (536 dan 549 nm) menghasilkan interferensi pada pengukuran florometri akibat difusi Rayleigh (Caraway, 1986 dalam Contiet.al., 1991). Untuk mencegahnya, bisa mengeksitasi senyawa florosens pada 515 nm tetapi akan menurunkan sensitifitas dan spesifitasnya. Selain itu, hal ini juga mungkin disebabkan karena jumlah supernatant yang diperoleh dari masing masing tabung berbeda (tabung 2 jumlah supernatant yang diperoleh lebih sedikit daripada tabung 1), kurang cepat dan kekurang telitian dalam melaksanakan prosedur percobaan, kekurang telitian dalam pengunaan alat - alat dan dalam pengambilan supernatant ada endapan yang ikut terambil serta pemanasan yang tidak sesuai dengan seharusnya sehingga reaksi yang terjadi kurang sempurna sehingga hasil yang diperoleh kurang optimal. Contiet.al. (1991) telah mengembangkan suatu teknik analisa kadar MDA yang lebih baik daripada teknik sebelumnya. Teknik ini analog dengan teknik HPLC yang dikembangkan oleh Therasse dan Lemonnier, tetapi dikembangkan metode yang lebih cepat dan sederhana sehingga bisa digunakan untuk sampel yang berjumlah banyak. Malondialdehid (MDA) direaksikan dengan diethylthiobarbituric acid (DETBA) dalam suasana asam, kemudian senyawa yang berwarna diekstrak dengan butanol dan diukur menggunakan spektroskopi florosens sinkronos yang akan meningkatkan sensi- tifitas dan spesifitas. Tahapan presipitasi dan pencucian tidak dilakukan karena rumit dan hanya sedikit meningkatkan spesifitas. Penetapan dengan florosens sinkronous lebih cepat dari HPLC. Sehingga teknik ini sangat cepat

24

dan sensitif daripada metode Yagi tetapi hasilnya benar-benar berkorelasi dengan HPLC. 1.7 Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan yang diperoleh maka dapat disimpulkan bahwa, 1. Penambahan vitamin C menghambat proses browning menyebabkan warna larutan tidak berwarna coklat. 2. Konsentrasi vitamin C mempengaruhi efek antioksidan. Pada konsentrasi tinggi, aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan antioksidan tersebut menjadi prooksidan. 3. Proses oksidasi yang terjadi pada kentang akibat PPO yang berikatan dengan oksigen dan substrat yang berupa fenol menyebabkan browning pada permukaan kentang yang terpotong. 4. Minyak kelapa baru (I) membutuhkan KI lebih banyak yaitu 40 tetes dibandingkan dengan minyak kelapayang sudah dipanaskan berkali-kali yaitu hanya 35 tetes. 5. Proses pemanasan pada suhu tinggi dapat mempercepat proses oksidasi. 6. Ketengikan ini terjadi karena proses oksidasi oleh oksigen terhadap asam lemak tak jenuh dalam minyak atau lemak. 7. Bau tengik yang tidak sedap tersebut disebabkan oleh pembentukan senyawa-senyawa hasil pemecahan hidroperoksida yang bersifat sangat tidak stabil dan mudah pecah menjadi senyawa dengan rantai karbon yang lebih pendek oleh radiasi energi tinggi, energi panas, katalis logam, atau enzim. 8. Jumlah MDA yang terbentuk dapat menggambarkan proses peroksidasi lipid. 9. Metode ini didasarkan pada reaksi antara kompleks MDA dengan TBA dalam suasana asam yang membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah jambu yang kemudian diukur intensitasnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.

25

10. Kadar MDA pada tabung 1, tabung 2, dan blanko adalah 2,9 X 10-7; 1,6 X 10-7; dan 2,1 X 10-7. 11. Konsentrasi MDA dalam material biologi telah digunakan secara luas sebagai indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan indikator keberadaan radikal bebas (Zakaria, 1996).

26