Anda di halaman 1dari 4

Host Cell yang Digunakan dalam Kloning, Khususnya E-coli yang Digunakan dalam Kloning Gen Apoptin Oleh:

Muslimah / 1106017622 / Teknologi Bioproses

Host cell merupakan tempat dimana gen atau plasmid rekombinan yang akan diperbanyak dalam kloning ditempatkan. Sel ini juga menjadi agen yang akan memperbanyak hasil kloning melalui proses perkembangbiakannya. Terdapat bermacam-macam sel yang dapat dijadikan sebagai host cell dalam kloning, diantaranya adalah sel bakteri, yeast, sel mamalia, tumbuhan, dan serangga. Namun kali ini akan lebih banyak dibahas host cell dari E-coli terutama untuk kloning gen apoptin. Terdapat beberapa karakteristik host cell yang diinginkan dalam kloning, diantaranya berdasarkan: 1. Efficient Transformation Host yang digunakan diharapkan memiliki kemampuan memasukkan plasmid atau DNA ke dalam selnya dengan cepat dan tidak mudah terdegradasi. Oleh karena itu host yang digunakan biasanya telah mengalami mutasi deoR untuk mempercepat penyerapan DNA dari luar serta memiliki gen hsdM yang berfungsi mensintesis Metilase untuk mencegah degradasi DNA. 2. Stable maintenance of plasmid Plasmid yang telah berhasil masuk ke dalam sel dan tidak dipotong oleh enzim restriksi masih dapat mengalami masalah dalam proses replikasi. Plasmid ini dapat mengalami delesi maupun inversi. Untuk menjaga kestabilan dari plasmid biasanya digunakan 3 sistem rekombinan, menggunakan produk dari gen recBCD, recE, dan recF. 3. Disablement Sel yang dijadikan sebagai host diharapkan dapat ditekan kemampuan hidupnya di alam luar sehingga dapat meminimalisir pencemaran akibat sel yang terlepas dari laboratorium. oleh karena itu, host yang digunakan harus membawa sifat mutasi yang menurunkan kemampuan hidupnya di alam liar. 4. Features allowing use of the LacZminigene Seperti marker yang menandakan bahwa host yang tumbuh hanyalah host yang membawa plasmid F. Plasmid F ini merupakan plasmid pengkode lacZ. 5. Other markers Selain itu, masih banyak jenis penanda yang dapat digunakan. Penanda ini penting untuk memisahkan target yang diinginkan dengan host lain yang gagal dalam proses kloning.

Penanda ini dapat berupa genotip yang menunjukkan sifat tertentu, misal resisten terhadap antibiotik, dan lain-lain. Diantara jenis-jenis genotip tersebuat adalah endA1, hsdR17, supE44, thi-1, recA1 gyrA (nalR), relA1, (lacZYA-argF), U169, 80lacZDM15. Jenis sel yang dapat digunakan sebagai host dalam kloning juga bermacam-macam, ada bakteri, yeast, sel mamalia, tumbuhan, dan serangga. Namun kali ini hanya akan diulas satu jenis host yaitu E-coli. Escherichia coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 micrometer dan diameter 0.5 micrometer. Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20- 400C, optimum pada 370. E. coli ditemukan pertama kali oleh Theodore Eschetrch pada tahun 1885, dan hingga kini bakteri ini menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. Hapir semua rekayasa genetika di dunia bioteknologi selalu melibatkan E.coli, termasuk dalam proses kloning. Pemilihan penggunaan E-coli sebagai host dalam kloning diantaranya didasarkan pada beberapa alasan, yaitu: 1. Genetik yang sederhana Bakteri memiliki materi genetic yang lebih sederhana dibandingkan eukariotik. Misalnya pada E. coli terdapat sekitar 4.400 gen sedangkan pada manusia sekitar 30.000 gen. Selain itu, bakteri, termasuk E.coli, tinggal seumur hidup mereka dalam keadaan haploid, tanpa alel kedua untuk menutupi efek mutasi pada rekayasa protein percobaan. 2. Laju Pertumbuhan Bakteri biasanya tumbuh lebih cepat dibandingkan organisme yang lebih

kompleks. Misalnya E. coli yang dapat tumbuh pesat pada tingkat satu generasi per dua puluh menit. Dengan kemampuan pertumbuhan dan replikasi yang cepat

memungkinkan dihasilkan produk dengan lebih cepat. 3. Keselamatan E. coli secara alami ditemukan di saluran usus manusia dan hewan di mana ia membantu memberikan nutrisi (vitamin K dan B12) ke host-nya. Dengan demikian penggunaan E-coli sebagai host dalam kloning untuk memproduksi suatu jenis protein yang akan digunakan oleh manusia atau makhluk hidup lain menjadi relatif aman. 4. Kemampuan untuk host DNA asing E-coli juga memiliki kemampuan mutasi yang relatif lebih cepat, sehingga lebih mudah dibuat menjadi sel kompeten dalam kloning. Selain itu E-coli mudah mengalami

transduksi serta perubahan plasmid dan vektor, sehingga mudah dimanipulasi untuk dapat menerima gen asing dari luar. 5. Mudah dikultivasi dalam berbagai medium E-coli relatif mudah untuk dikultivasi pada berbagai jenis medium, sehingga pemilihan dan penggunaan medium relatif tidak mempersulit kegiatan kloning. Namun penggunaan E.coli sebagai host cell juga memiliki kelemahan, diantaranya: 1. Sinyal transkripsi dan translasi spesies lain tidak dikenali dengan baik oleh inang E.coli, sehingga ekspresi gen-gen heterolog di E.coli lemah. 2. Masalah serius pada ekspresi protein rekombinan pada E.coli, yaitu degradasi protein produk secara cepat dan seringkali protein rekombinan justru terakumulasi dan membentuk agregat kompak, yang bersifat inaktif tidak larut (sehingga menghambat proses purifikasi), yang disebut dengan badan inklusi (inclusion bodies). 3. Efek dari penggumpalan menyebabkan protein menjadi tidak aktif. Hal ini terjadi karena keterbatasan E.coli dalam membentuk struktur tiga dimensi protein secara benar dalam proses pelipatan pasca translasi. E.coli memiliki banyak strain yang dapat digunakan dalam tahapan rekayasa genetika. Setiap strain memiliki tingkat efisiensi transformasi yang berbeda-beda dan kemampuan untuk mengekspresikan gen pengkode yang terdapat pada pUC19.
Tabel 1. Protein Expression Strain Properties

(Sumber. Anonim. 2000. Competent Cell Clining and Protein Expression. New England Biolabs Inc. http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/pdf/brochures/CompetentCell.pdf/. Diakses pada 03 Oktober 2013 pukul 21:17)

Untuk kloning gen apoptin, hots cell yang dapat digunakan salah satunya adalah E.coli BL21(DE3). Selain memiliki tingkat efisiensi transformasi yang cenderung lebih tinggi, Strain BL21(DE3) memiliki gen DE3 pengkode T7 RNA polimerase yang dapat mengekspresikan gen target pada vektor ekspresi dengan induksi IPTG (Isopropil

thiogalaktosida). Induksi dari T7 RNA polimerase pada E.coli BL21 (DE3) akan mensintesis mRNA dalam jumlah yang tinggi. Dan pada sebagian besar penelitian, akumulasi protein heterologus dalam jumlah tinggi juga dapat diperoleh. Strain tersebut juga memiliki mutasi Ion dan OmpT protease sehingga dapat meminimalisir degradasi protein rekombinan yang terekspresi. Selain itu, sel inang yang digunakan dalam hal ini E.coli BL21(DE3), adalah bakteri yang diperoleh pada tahap logaritmik (log phase) karena pada tahap ini masih ada kesempatan bagi sel inang untuk membelah dan memperbanyak diri sehingga ada peluang bagi plasmid yang diperoleh menjadi lebih banyak sebelum disebar pada media.

Pembuatan bakteri kompeten Sebelum dilakukan proses transformasi, terlebih dahulu E.coli BL21(DE3) harus dibuat kompeten. Keadaan kompeten adalah keadaan dimana bakteri (host cell) siap untuk dimasukin oleh materi genetik asing. Pembuatan bakteri kompeten dilakukan dengan penambahan larutan CaCl2, sehingga mengingkatkan kemapuannya untuk mengambil DNA. Larutan CaCl2 dalam keadaan dingin efektif untuk memperlemah dindig sel dan meningkatkan permeabilitasnya sehingga mudah mengikat DNA. Dinding sel yang dilindungi oleh lipoprotein dengan plasmid yang sama-sama bermuatan negatif akan sulit untuk menempel. Penambahan larutan CaCl2 membantu mengubah sifat permeabilitas sel. Bakteri yang tadinya terdapat pada bagian pelet kemudian diresuspensi kembali dengan larutan MgCl2. Mg2+ dapat menurunkan kerapatan membran. Hal ini dikarenakan adanya interaksi antara mineral tersebut dengan bagian hidrofilik membran. Melalui hasil ini dapat diketahui bahwa penamabahan MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan membran sel E.coli BL21(DE3).

Daftar Sumber Anonim. 2000. Competent Cell Clining and Protein Expression. New England Biolabs Inc. http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/pdf/brochures/CompetentCell.pdf/ Casali, Nicola. 2011. Escherichia coli Host Strains. http://www.mfa.od.ua/page34.htm. diakses pada 04 Oktober 2013 pukul 04.35 Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge University Press.