UJI RESISTENSI BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIKA MENGGUNAKAN METODE DIFUSI

Maret 26, 2012

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI UJI RESISTENSI BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIKA MENGGUNAKAN METODE DIFUSI (Antibiotic Suspectibility Testing) Disusun Oleh : Kelompok B1 Riyan Haryadi ( 09613011 ) Dewi Shinta Mandela ( 09613024 ) Nike Fitri Adriaan ( 09613061 ) Dellyna Feranica Manik ( 09613076 ) LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA YOGYAKARTA 2011

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Tujuan Dapat melakukan uji aktivitas antimikrobia dengan menggunakan metode difusi cara cakram kertas (disk method). 1.2 Latar Belakang Resistensi terhadap antibiotika adalah fenomena yang alami. Bila suatu antibiotika digunakan, bakteri yang mengalami resistensi terhadap antibiotika tersebut memiliki kesempatan yang lebih besar untuk dapat terus hidup daripada bakteri lain yang lebih rentan. Bakteri yang rentan akan dapat dibasmi atau dihambat pertumbuhannya oleh suatu antibiotika, menghasilkan suatu tekanan selektif terhadap bakteri lain yang masih bertahan hidup untuk menciptakan turunan yang resisten terhadap antibiotika. Namun demikian, bakteri yang mengalami resistensi terhadap antibiotika dalam jumlah yang sangat

tinggi sekarang ini disebabkan karena adanya penyalahgunaan dan penggunaan antibiotika secara berlebihan. Di beberapa negara dan melalui internet, antibiotik dapat dibeli tanpa adanya resep dokter. Pasien kadang-kadang minum antibiotik meskipun ia tidak membutuhkannya, untuk (1) mengobati penyakit yang disebabkan oleh virus, seperti selesma . Bahaya resistensi antibiotika merupakan salah satu masalah yang dapat mengancam kesehatan masyarakat. Hampir semua jenis bakteri saat ini menjadi lebih kuat dan kurang responsif terhadap pengobatan antibiotika. Bakteri yang telah mengalami resistensi terhadap antibiotika ini dapat menyebar ke anggota keluarga, teman ataupun tetangga lain sehingga mengancam masyarakat akan hadirnya jenis penyakit infeksi baru yang lebih sulit untuk diobati dan lebih mahal juga biaya (2) pengobatannya .

1.3. Tinjauan Pustaka Antibiotika atau dikenal juga sebagai obat anti bakteri adalah obat yang digunakan untuk mengobati penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Alexander Fleming pada tahun 1927 menemukan antibiotika yang pertama yaitu penisilin. Setelah mulai digunakan secara umum pada tahun 1940, maka antibiotika bisa dibilang merubah dunia pengobatan serta mengurangi angka kesakitan & (1) kematian yang disebabkan oleh penyakit infeksi secara dramatis . Resistensi antibiotik adalah kemampuan mikroorganisme untuk mengatasi pengaruh antibiotik. Dengan kata lain, mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik, misalnya bakteri, akan kebal dan (2) tidak mati walau diberi antibiotik . Resistensi bakteri terhadap obat terdiri atas beberapa jenis, yaitu (1) resistensi primer yang merupakan resistensi alamiah terhadap kuman, contohnya bakteriStaphylococcus yang mengandung enzim penisilinase dapat mengubah penisilin menjadi asam penisilinoat yang tidak mampu membunuh kuman itu; (2) resistensi sekunder, yaitu karena adanya muatan-muatan yang berkembang biak menjadi spesies yang resisten; (3) resisten episomal atau plasmid yang dapat terjadi karena bakteri mentransfer DNA kepada bakteri lain melalui kontak antarsel bakteri sejenis dan antarbkateri yang berlainan jenis; serta (4) resistensi silang, yaitu resistensi bakteri terhadap suatu antibiotic dengan semua derivatnya. Sebagai contoh, penisilin dengan ampisilin, rifampisin dengan rifamisin, dan berbagai jenis sulfonamide. Untuk menghindari resistensi silang, digunakna dosis antibiotic yang relative lebih tinggi daripada dosis efektif minimum (3) dalam waktu singkat . Resistensi antibiotik adalah kemampuan dari bakteri atau mikroorganisme lain untuk menahan efek antibiotic. Resistensi antibiotic terjadi ketika bakteri dapat merubah diri sedemikian rupa hingga dapat mengurangi efektifitas dari suatu obat, bahan kimia ataupun zat lain yang sebelumnya dimaksudkan untuk menyembuhkan atau mencegah penyakit infeksi. Akibatnya bakteri tersebut dapat bertahan hidup dan bereproduksi sehingga makin membahayakan. Bakteri tersebut dapat membentuk ketahanan khusus terhadap suatu jenis antibiotika tertentu, sehingga membahayakan orang yang terkena penyakit tersebut. Kesalahpahaman yang sering terjadi di masyarakat adanya anggapan bahwa yang resisiten terhadap obat tertentu adalah tubuh orang, padahal sebenasrnya bakteri yanag (2) ada di dalam tubuh tersebutlah yang menjadi resisten terhadap pengobatan, bukan tubuhnya . Antibiotik menghentikan atau mengganggu sejumlah proses seluler sehari-hari yang mengandalkan bakteri untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup, seperti: melumpuhkan produksi dinding sel bakteri yang melindungi sel dari lingkungan eksternal mengganggu sintesis protein dengan mengikat mesin yang membangun protein, asam amino dengan asam amino

mendatangkan malapetaka dengan proses metabolisme, seperti sintesis asam folat, sebuah vitamin B yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang

memblokir sintesis DNA dan RNA

(1)

Pengujian mikrobiologi memanfaatkan mikroorganisme sebagai indikator pengujian. Dalam hal ini mikroorganisme digunakan sebagai penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran kompleks kimia, untuk mendiaknosis penyakit tertentu tertentu, serta untuk menguji bahan kimia guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik suatu bahan. Macam-macam uji yang dapat dilakukan adalah uji antibiotik/antimikroba, bioautografi, uji vitamin dan asam amino, uji ames, dan (4) penggunaan mikroorganisme sebagai model metabolisme obat mamalia . Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan efesien. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba seperti yang dijelaskan berikut ini: Metode difusi Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba permukaan media agar. (lihat gambar)

E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat menghabat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.(lihat gambar)

Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji ( maksimum 6 macam ) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba. Cup-plate technique

metode ini serupa dengan mitode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji. Gradient-plate technique

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dihitung diatasnya.

Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan. Bila: X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin Y = panjang pertumbuhan aktual C = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mg/mL atau /mL, Maka konsentrasi hambatan adalah: [(X.Y)]: C mg/mL atau g/mL. Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair (4) faktor difusi agen antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat .

BAB II METODE PERCOBAAN

2.1.

ALAT DAN BAHAN

Alat : Tabung reaksi Cawan petri Mikro pipet Blue & yellow tip Erlenmeyer Beaker glass Autoclave Laminar Air Flow (LAF) Lampu spiritus

Bahan : Nutrient agar

Mikroba uji (feces) Paper disk yang mengandung : Amoxicillin, Ampicillin, Gentamicin, Sulfametoksazon

2.2.

CARA KERJA Disiapkan mikroba uji yang akan digunakan (mikroba uji dari hasil persiapan pada praktikum sebelumnya) Disiapkan dan disterilisasi 50 ml media nutriet agar dalam erlenmeyer Masing-masing kelompok membuat dua media nutrient agar

Media nutrient agar, yellow & blue tip, serta cawan petri di sterilisasi dengan autoclave selama 15 0 menit dengan suhu 121 C Setelah agak dingin ditambahkan 200l mikrobia uji dalam LAF, dihomogenkan Dituang dalam petri steril, ditunggu sampai beku Pada petri pertama, dipasang paper disk yang mengandung antibiotik Sulfametoksazol dan ampicillin serta blanko sebagai control negatif Pada petri kedua, dipasang paper disk yang mengandung antibiotik Amoxicillin dan Gentamicin serta blanko sebagai control negatif Diinkubasi 37 C selama 24 jam Diinterpretasikan hasil dengan antibiogram Diukur diameter hambatannya untuk masing-masing sampel/antibiotik dengan masing-masing mikrobia uji
o

BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. HASIL PERCOBAAN Jenis / jumlah sample : Feces / 200 l

Hasil pengukuran diameter zona hambat menggunakan electric counter (Terlampir)

Hasil pengukuran diameter zona hambat menggunakan jangka sorong

Ukuran paper disk = 6mm 1. Sulfametoksazol = 2,03 cm = 20,3 mm Zona hambat = 20,3 6 = 14,3 mm 1. Ampicillin = (tidak bereaksi) 2. Amoxicillin = 0,61 cm = 6,1 mm Zona hambat = 6,1 6 = 0,1 mm 1. Gentamicin = 1,01cm = 10,1 mm Zona hambat = 10,1 6 = 4,1 mm

3.2 PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini dilakukan uji resistensi bakteri terhadap antibiotika menggunakan metode difusi yang bertujuan agar dapat melakukan uji aktivitas mikrobia dengan menggunakan metode difusi cara sumuran dan cakram kertas (disk method), dapat melakukan uji aktivitas antimikrobia dengan menggunakan metode dilusi cair maupun dilisi padat. Siapkan mikroba uji yang akan digunakan yang berasal dari paktikum sebelumnya, kemudian dibuat media nutrient agar sebanyak 50 ml yang akan di bagi ke dalam 2 erlenmeyer, lalu disterilisasi di dalam autoklaf. Setelah disterilisasi media yang masih mencair ditambahkan dengan 200 l mikroba uji, dihomogenkan. Lalu dituangkan kedalam petri steril. Penuangan dilakukan di dalam LAF yang sudah disterilisasi sebelumnya. Ditunggu sampai beku. Setelah beku pada petri pertama dipasang paper disk yang mengandung antibiotic sulfametoksazol dan ampisilin, juga paper disk blanko. Pada petri kedua dipasang paper disk yang mengandung antibiotic amoksisilin dan gentamisin, juga paper o disk blanko. Kemudian kedua petri dimasukkan dalam incubator selama 18-24 jam pada suhu 27 C. Metode ini dinamakan metode Kirby-Bauer. Pada saat pemasangan paper disk sedikit ditekan agar tidak jatuh saat dimasukkan kedalam incubator secara terbalik. Ada beberapa macam metode untuk uji resistensi bakteri, antara lain : 1. Metode dilusi. Prinsipnya yaitu antibiotic diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi. i. Dilusi cair. Masing-masing konsentrasi obat ditambahkan suspensi kuman atau bakteri didalam media. ii. Dilusi padat. Masing-masing konsentrasi obat ditambahkan media agar, lalu ditanami bakteri. iii. i. Metode difusi Kirby-Bauer. Menggunakan kertas disk yang sudah mengandung antibiotic dan diketahui konsentrasinya. ii. Sumuran. Pada media agar ditambahkan suspensi bakteri, kemudian dibuat lubang ditengah dan ditetesi antibiotic. iii. Pour plate. Suspensi bakteri diambil menggunakan ose lalu dimasukkan dalam media agar, setelah beku digunakan disk antibiotik diatasnya.

iv.

E-test. Menggunakan plastic strip yang mengandung antibiotic yang sudah diketahui konsentrasinya.

v.

Gradient test. Seperti cara sumuran hanya saja lubang yang dibuat menyerupai garis tengah, sehingga media pada petri terbelah dua.

Hari berikutnya dilakukan pengukuran diameter hambat dari masing-masing antibiotic menggunakan jangka sorong dan diperoleh data : zona hambat sulfametoksazol 14,3 mm ; amipisilin 0 mm ; amoksisilin 0,1 mm ; gentamisin 4,1 mm. Dan juga dilakukan pengukuran zona hambat dengan menggunakan electric counter dan diperoleh data : zona hambat sulfametoksazol 21,5 mm ; amipisilin 0 mm ; blanko 1 8,5 mm ; amoksisilin 10,0 mm ; gentamisin 19,3 mm ; blanko 2 8,5 mm. Pada data terdapat antibiotik yang tidak bisa menghambat pertumbuhan bakteri dikarenakan antibiotik yang digunakan tidak spesifik terhadap bakteri yang ditanam didalam media, ataupun terjadi resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut dengan berbagai mekanisme. Mekanisme kerja antibiotik antara lain : 1. Menghambat sintesis dinding sel bakteri sehingga menghambat perkembang biakan dan menimbulkan lisis. Contoh : penisilin dan sefalosforin. 2. Mengganggu keutuhan membrane sel, mempengaruhi permeabilitas sehingga menimbulkan kebocoran dan kehilangan cairan intraseluler. Contoh : nistatin. 3. Menghambat sintesis protein sel bakteri. Contoh : tetrasiklin, kloramfenikol, eritromisin. 4. Menghambat metabolisme sel bakteri. Contoh : sulfonamide. 5. Menghambat sintesis asam nukleat. Contoh : rifampisin dan golongan kuinolon.
(5)

Sifat antibiotik sebaiknya menghambat atau membunuh mikroorganisme patogen tanpa merusak inang, bersifat bakterisid, tidak menyebabkan resistensi pada kuman, tidak bersifat alergenik atau tidak menimbulkan efek samping bila digunakan dalam jangka waktu lama, larut dalam air, serta (6). stabil BAB IV KESIMPULAN zona hambat sulfametoksazol 14,3 mm ; amipisilin 0 mm ; amoksisilin 0,1 mm ; gentamisin 4,1 mm. Dan juga dilakukan pengukuran zona hambat dengan menggunakan electric counter dan diperoleh data : zona hambat sulfametoksazol 21,5 mm ; amipisilin 0 mm ; blanko 1 8,5 mm ; amoksisilin 10,0 mm ; gentamisin 19,3 mm ; blanko 2 8,5 mm.

BAB V DAFTAR PUSTAKA

1. Vorber, auf die eingeschr, Hpber- prfg, Staatl, zugel, Fernlehrgang, 2010, Bahaya Resisitensi Antibiotika, www.Impulse-Schule.de. Diakses pada tanggal 25 oktober 2011.

1. Aryulina, Diah, dkk., 2006, Biologi 3, Penerbit Erlangga, Jakarta.

1.

Syamsuni, H., Drs., 2005, Farmasetika Dasar dan Hitungan Farmasi, Penerbit EGC, Jakarta.

2. Betina, V., 1983, The chemistry and Biology of Antibiotics, Scientific Publishing Company, New York. 3. Rostinawati, Tina, 2009, Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella Terhadap E. Coli, S.Aureus Dengan Metode Difusi Agar, UNPAD, Bandung. 4. Syahrurrahman, A.,dkk.,1994, Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran UI, Jakarta.

UJI SENSITIVITAS ANTIBIOTIK

3.1 Waktu dan Tempat

1. Waktu 2. Tempat

: Senin, 17 Desember 2011 : Laboratorium Biodiversity FMIPA Universitas Tadulako

3.2 Alat dan Bahan a) Alat 1. Jarum ose 2. Sweap 3. Cawan Petri 4. Bunsen 5. Tabung reaksi 6. Rak tabung reaksi 7. Pinset b) Bahan

1. Eschercia coli 2. Medium MHA 3. Media BHIB 4. Antibiotik Ceftazidime 5. Antibiotik Kanamycin 6. Antibiotik Levofloxacin 7. Antibiotik Vancomycin 8. Antibiotik Amikacin 9. Antibiotik Meropenem 10. Antibiotik Bacitracin 11. Antibiotik Pefloxacin 12. Antibiotik Erythromycin

13. Antibiotik Amoxycillin 14. Antibiotik Ciprofloxacin 15. Antibiotik Doxycycline 16. Antibiotik Streptomycin 17. Antibiotik Gentamicin 18. Antibiotik Norfloxacin 19. Antibiotik Sulphonamides 20. Antibiotik Ceftriaxone 21. Antibiotik Oxacillin 22. Antibiotik Tetracycline 23. Antibiotik Cefadroxil 24.Antibiotik Cephalothin

3.3 Prosedur Kerja a. Mensterilkan alat-alat sebelum digunakan maupun sesudah digunakan. b. Mengambil sedikit bakteri Eschercia coli menggunakan sweap. c. Memasukkan bakteri tersebut ke dalam media BHIB. d. Mensterilkan pinggiran cawan petri yang berisikan medium MHA, kemudian mengambil sweap dari dalam media BHIB, menggoreskan sweap tersebut secara zig zag. e. Menempelkan antiobiotik pada permukaan medium MHA menggunakan pinset. f. Membungkus cawan petri tersebut, kemudian memasukkannya ke dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 0C. g. Mengukur zona bening atau zona hambat yang terdapat pada medium MHA.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Pengamatan No Jenis Antibiotik Keterangan

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Antibiotik Ceftazidime Antibiotik Streptomycin Antibiotik Kanamycin Antibiotik Gentamicin Antibiotik Levofloxacin Antibiotik Norfloxacin Antibiotik Vancomycin Antibiotik Sulphonamides Antibiotik Amikacin Antibiotik Ceftriaxone Antibiotik Meropenem Antibiotik Oxacillin Antibiotik Bacitracin Antibiotik Tetracycline Antibiotik Pefloxacin Antibiotik Cefadroxil Antibiotik Erythromycin Antibiotik Cephalothin Antibiotik Amoxycillin Antibiotik Ciprofloxacin Antibiotik Doxycycline

S I S I R R S R R S S S S R I S S S S R R

4.2 Pembahasan Uji sensitivitas bakteri merupakan cara untuk mengetahui dan mendapatkan produk alam yang berpotensi sebagai bahan anti bakteri serta mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri pada konsentrasi yang rendah.

Pada pengamatan yang dilakukan, terlebih dahulu melakukan fiksasi alat-alat yang akan digunakan pada praktikum. Fiksasi berfungsi agar tidak terdapat mikroba yang menempel. Bakteri Eschercia coli dimasukkan dalam media BHIB (Brain Heart Infusion Broth) yang berfungsi membantu pertumbuhan bakteri tersebut. Selanjutnya menggoreskan sweap secara zig zag pada cawan petri yang berisikan medium MHA (Mueller Hinton Agar) yang juga merupakan tempat hidup dan berkembangbiaknya suatu bakteri. Langkah selanjutnya, memasukkan antibiotik pada masingmasing cawan petri dengan jarak yang tidak terlalu dekat, agar nantinya dapat diketahui mana antibiotik yang resisten dan sensitif terhadap bakteri. Resistensi merupakan zona hambat antibiotik yang terjadi terhadap bakteri, sedangkan sensitifitas merupakan zona hambat yang tidak terjadi pada antibiotik terhadap bakteri. Sesuai hasil pengamatan, terdapat beberapa antibiotik yang resisten terhadap bakteri yaitu Levofloxacin dengan zona hambat 25 mm, Amikacin dengan zona hambat 17 mm, Pefloxacin dengan zona hambat 12 mm, Ciprofloxacin dengan zona hambat 20 mm, Doxycycline dengan zona hambat 13 mm, Streptomycin dengan zona hambat 12 mm, Gentamicin dengan zona hambat 12 mm, Norfloxacin dengan zona hambat 19 mm, Sulphonamides dengan zona hambat 15 mm, dan Tetracycline dengan zona hambat 15 mm. Bakteri dapat resisten terhadap golongan amino glikosida karena kegagalan penetrasi ke dalam bakteri, rendahnya afinitas obat pada ribosom atau anaktivasi obat oleh enzim bakteri. Enzim inaktivator amino glikosida yang dikenal yaitu enzim fosforilase, adenilase, asetilase, gugus hidroksil spesifik atau gugus amino.informasi genetik untuk sintesis enzim terutama di dapat melalui konjugasi, transfer DNA sebagai plasmid dan transfer faktor resisten. Sesuai hasil pengamatan, bidang zona hambat yang paling besar terjadi pada antibiotik Levoflaxacin. Resistensi terjadi akibat bakteri mensintesis enzim yang dapat mengubah zat aktif menjadi tidak aktif sehingga terjadi resisten terhadap antibiotik Levoflaxacin. Bakteri tersebut menghasilkan enzim Levoflaxacinase yang mampu memecah cincin beta laktam. Beta laktamase banyak diproduksi oleh bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Enzim ini mempunyai peranan besar dalam menyebabkan resistensi bakteri gram positif terhadap antibiotik Levoflaxacin.