Praktikum Analisis Klinik 2011

KATA PENGANTAR Puji syukur dipanjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas tersusunnya Petunjuk Praktikum Analisis Klinik yang ditujukan untuk membantu mahasiswa semester IV Program Studi Farmasi Klinik dan Komunitas, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Mata praktikum Analisis Klinik B ini bertujuan untuk mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana memilih dan menggunakan/menerapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawaseyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu). Petunjuk ini hanya memuat cara singkat bagaimana melakukan analisis beberapa parameter klinik, sedangkan untuk melengkapi pemahaman metode analisis tersebut mahasiswa diwajibkan membaca literatur aslinya yang tertera pada daftar pustaka buku ini. Aplikasi secara klinik dapat diperkaya melalui referensi lain yang terkait. Buku petunjuk ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, kritik dan saran demi menyempurnakan buku ini di masa mendatang sangat diharapkan. Semoga buku petunjuk yang sangat sederhana ini dapat berguna bagi yang memerlukannya.

Yogyakarta, 2011

Pengampu Praktikum Analisis Klinik : Prof. Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt. (koordinator) Prof. Dr. Sudibyo Martono, MS., Apt Dr. Ediati, SE, Apt. Dr. Arif Nurrochmad, M.Sc., Apt Dr. Tatang Irianti, M.Sc., Apt Arief Rahman Hakim, M.Si., Apt. Muthi' Ikawati, MSc., Apt. Adam Hermawan, M.Sc., Apt

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ... DAFTAR ISI . PENDAHULUAN . I. PREPARASI SAMPEL DAN PENGAMATAN SEL DARAH .. II. III. IV. V. VI. PENETAPAN KADAR KREATININ ............................ PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL ........................................................ PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN ......................................................... PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL......

Hlmn 1 2 3 5 10 12 15 18 23

DAFTAR PUSTAKA

PENDAHULUAN

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

A. DESKRIPSI DAN TUJUAN P raktikum Analisis Klinik mengajarkan kepada mahasiswa bagaimana memilih dan menggunakan/merapkan metode yang tepat untuk menetapkan kadar senyawaseyawa endogen dalam tubuh yang memiliki makna klinik (berkaitan dengan penyakit tertentu). Praktikum ini bertujuan memperkenalkan berbagai metode penetapan kadar senyawa endogen dalam tubuh dengan metode enzimatik dan kimiawi untuk penetapan karbohidrat, lipid, protein, urea dan kreatinin. Setelah mengikuti praktikum Analisis Klinik diharapkan mahasiswa dapat memahami dan mempraktikkan cara-cara penetapan senyawa-senyawa endogen dan mampu mengkaitkan arti senyawa-senyawa tersebut dengan berbagai penyakit. Adapun tujuan pembelajaran khusus setelah mengikuti praktikum ini mahasiswa diharapkan mampu : 1. menjelaskan cara-cara menetapkankadar senyawa endogen dalam tubuh 2. menjelaskan reaksi-reaksi kimia yang terjadi selama praktikum mata acara yang bersangkutan 3. memilih metode yang tepat untuk meneapkan senyawa endogen tertentu 4. menjelaskan arti pentingnya praktikum Analisis Klinik 5. membekali diri untuk pada waktunya bekerja di laboratorium klinik. B. PELAKSANAAN PEMBELAJARAN 1. Jadwal Kegiatan Dua Mingguan (praktikum 2 minggu sekali) Prakt. keI II III IV V VI Topik Prakt. Substansi senyawa dalam Plasma darah Urin Plasma darah Plasma darah Urin serum Urin Metode penetapan Spektrofotometri Spektrofotometri Spektrofotometri Spektrofotometri Spektrofotometri Fasilitas

Preparasi sampel Penetapan kadar kreatinin Penetapan kadar karbohidrat Penetapan kadar kolesterol Penetapan kadar urea nitrogen Penetapan kadar protein Responsi

Semua materi Ujian tertulis praktikum

Buku Petunjuk, Pustaka Buku Petunjuk, Pustaka Buku Petunjuk, Pustaka Buku Petunjuk, Pustaka Buku Petunjuk, Pustaka Soal-soal ujian praktikum

2. Metode Pembelajaran dan Bentuk Kegiatan Kegiatan setiap acara praktikum di laboratorium dimulai dengan test singkat materi yang akan dipraktikkan (pretest), kemudian mahasiswa melaksanakan acara praktikum dengan dibimbing asisten dan dosen. Setelah selesai melaksanakan praktikum,

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

mahasiswa diwajibkan membuat laporan praktikum (laporan sementara perkelompok) yang memuat data-data praktikum dan perhitungan kadar. Setelah didiskusikan dalam satu golongan, laporan akhir pergolongan dikumpulkan pada akhir praktikum dalam bentuk softcopy. Diskusi lebih lanjut dilakukan secara on-line melalui situs http://analisisklinikfarmasiugm.wordpress.com/ dan terbuka untuk mahasiswa golongan yang bersangkutan dalam rentang waktu 2 x 24 jam setelah praktikum. Mahasiswa diwajibkan aktif dalam forum diskusi tersebut yang akan selalu dipantau dan dibimbing oleh asisten dan dosen pengampu. Catatan : selama pelaksanaan praktikum, mahasiswa wajib mentaati segala peraturan dan menjaga ketertiban. Mahasiswa yang terlambat > 15 menit dan atau pretest telah selesai dilaksanakan tidak diperkenankan mengikuti praktikum dan wajib melapor pada koordinator praktikum. C. EVALUASI PEMBELAJARAN Aspek penilaian meliputi : 1. Tes pendahuluan 15% 2. Kinerja praktikum 50%(termasuk 3. Responsi A jika nilai 75 60 B < 75 50 C < 60 40 D < 50 E 40 35% Nilai akhir ditentukan sebagai berikut: kinerja di laboratorium (15), laporan (10), serta keaktifan diskusi di laboratorium maupun on-line (25))

PREPARASI SAMPEL DAN PENGAMATAN SEL DARAH

Laboratorium Analisis Klinik
4

Praktikum Analisis Klinik 2011

(Sampel darah)
Preparasi sampel merupakan hal paling penting dalam suatu analisis klinik karena membutuhkan waktu paling lama diantara langkah yang lain. Lebih jauh lagi tidak jarang banyak kesalahan terjadi dalam proses preparasi sampel. Preparasi sampel yang salah dapat menyebabkan kesalahan dalam interpretasi data klinik yang diperoleh. Maka dari itu setiap langkah dalam preparasi urin harus benar-benar diperhatikan. Sampel yang digunakan dalam analisis klinik dapat berasal dari darah maupun urin. Untuk darah dapat dipilih whole blood, serum, ataupun plasma, tergantung dari data yang diinginkan. Secara umum langkah-langkah dalam preparasi sampel terdiri dari : A. PREPARASI PASIEN DAN KOLEKSI SAMPEL (PHLEBOTOMY) Sebelum dilakukan koleksi sampel tentunya dilakukan identifikasi pasien. Dalam proses identifikasi ini pasien dicatat nama lengkap, tanggal pengambilan sampel, serta volume sampel yang diperoleh. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kesalahan pelabelan yang dapat berakibat pada kesalahan data. Kemudian data ini ditempelkan pada tabung (tube) untuk koleksi sampel. Setelah itu pasien diberitahukan tentang prosedur pengambilan sampel dan sebaiknya pasien berada dalam keadaan yang nyaman, terutama untuk koleksi sampel darah. Koleksi sampel darah dapat berasal dari kapiler maupun vena. Untuk koleksi darah arteri sangat jarang digunakan kecuali pada kasus khusus seperti pada analisis gas yang terkandung dalam darah. Darah kapiler biasanya diperoleh dari ujung jari dan volumenya sangat kecil sehingga jarang digunakan untuk analisis rutin. Sebelum dilakukan pengambilan ujung jari dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan air hangat. Kemudian oleskan krim hidrofobik untuk menjaga sterilitas daerah yang akan diambil darahnya. Ambil darah dengan menggunakan lancet. Darah akan keluar dengan spontan, kumpulkan dalam tube dan tutup tempat keluarnya darah dengan plester steril. Koleksi sampel darah vena tidak jauh berbeda dengan koleksi darah kapiler. Darah vena biasanya diambil dari lengan karena vena di sini mudah untuk dideteksi. Dalam koleksi sampel darah dari vena, biasanya digunakan tube tertentu tergantung dari kebutuhan analisis. Urin merupakan sampel yang paling mudah didapatkan dalam proses klinik. Sampel urin dapat digunakan untuk mengetahui status fungsi ginjal, kelainan pada saluran kemih, dan kemungkinan dapat memberikan petanda adanya keabnormalan sistemik. Urin dikoleksi dalam wadah bersih bebas bahan kimia, tidak steril, dan segera dibawa ke laboratorium dalam waktu

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

tak kurang dari 30 menit. Bila tidak segera dianalisis, dapat disimpan dalam refregerator, dan dianalisis dalam waktu tidak lebih 8 jam kemudian. Biasanya sampel urin perlu diberi preservasi untuk menjaga integritas kandungan analit. Dalam proses koleksi sampel ini biasanya terdapat kesalahan kesalahan seperti : Pelabelan salah atau tidak lengkap Jumlah tidak mencukupi untuk analisis Kesalahan dalam memilih tabung Instruksi pada pasien tidak tepat atau kurang lenkap Tutup tidak rapat sehingga menyebabkan tumpah atau terkontaminasi Gagal dalam memisahkan serum dari sel darah merah dalam waktu 60 menit Penjendalan darah tidak berhasil dengan baik Terjadi hemolisis Terjadi lipemia : kekeruhan pada serum yang disebabkan oleh diet. B. PEMROSESAN SAMPEL Setelah dilakukan pengumpulan sampel maka sampel dapat diproses lebih lanjut. Sampel darah biasanya digunakan serum atau plasma, meskipun sebenarnya tidak ada perbedaan yang signifikan pada interpretasi data klinik dalam penggunaan serum maupun plasma. Serum sering digunakan dalam analisis kimia, sedangkan plasma biasa digunakan untuk analisis amonia, studi koagulasi, dan analisis beberapa trace elements. Sampel plasma sering digunakan sebagai ganti serum bila proses penjendalan dirasa lama, namun penggunaan sampel plasma memiliki kelemahan yaitu bila terjadi interaksi antara antikoagulan dengan analit yang akan diperiksa atau reagen pada proses analisis. 1. Preparasi Plasma dari Whole Blood Langkah langkah yang dilakukan adalah : a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet. Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol, tutup dengan plester. b. Koleksi darah ke dalam tabung (tube) yang mengandung antikoagulan (EDTA, heparin) sebanyak 3 ml. c. Tube dibolak-balik 3-5 kali d. Ambil 1 ml darah pindahkan ke Eppendorf e. Sentrifuge pada suhu 25o C pada 1300 rpm selama 3 menit f. Ambil supernatan 250 l

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

g. Simpan pada suhu -800 C sampai akan digunakan. 2. Preparasi Serum dari Whole Blood Langkah langkah yang dilakukan adalah : a. Darah diambil dari vena lengan menggunakan spuit steril dan bantuan tourniquet. Bersihkan bagian yang disampling dengan menggunakan kapas beralkohol, tutup dengan plester. b. Koleksi darah dalam tabung yang tidak mengandung antikoagulan sebanyak 3 ml c. Disarankan dalam koleksi darah menggunakan tabung serum separator d. Tabung digoyang balik 5 kali e. Diamkan selama 30-60 menit sampai terjadi penjendalan di bagian atas atau dibiarkan semalaman pada suhu 4o C f. Sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit g. Serum ditempatkan dalam wadah plastik bebas antikoagulan maupun preservatif. Sampel yang diperoleh dapat segera dianalisis untuk berbagai keperluan klinik. C. PENGAMATAN SEL DARAH Pengamatan sel darah dilakukan dengan menggunakan alat hemocytometer (bilik hitung). Skema hemocytometer :

T/E T

T T T/E T T

T/E

T/E

T/E

Keterangan : Leu = Leukosit; T = Trombosit; E = Eritrosit 1. Perhitungan Leukosit a. 20 L sampel darah tambahkan pereaksi Turk 0,5 mL b. Tunggu 15-20 menit c. Hitung jumlah leukosit menggunakan hemositometer di mikroskop

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

Cara menghitung leukosit 1) Pakailah lensa objektif kecil (pembesaran 10x). turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma mikroskop. meja mikroskop harus datar, 2) Kamar hitung dengan bidang bergaris diletakkan di bawah objektif dan fokus mikroskop diarahkan pada garis-garis bagi tersebut. Dengan sendirinya leukositleukosit akan jelas terlihat. 3) Hitunglah semua leukosit yang terdapat dalam keempat "bidang besar" pada sudut-sudut "seluruh permukaan yang dibagi". 4) Mulailah menghitung dari sudut kiri atas, terus ke kanan, kemudian turun ke bawah dan dari kanan ke kiri dan seterusnya. Kadang ada sel yang menyinggung garis suatu bidang, sel-sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri atau garis atas haruslah di hitung. Sebaliknya sel-sel yang menyinggung garis sebelah kanan dan bawah tidak boleh dihitung. Jumlah leukosit = 1 terhitung Vol.kotak 2. Perhitungan Eritrosit a. 20 L sampel darah tambahkan pereaksi Hayem 4 ml b. Tunggu 2-3 menit c. Hitung jumlah eritrosit menggunakan hemositometer di mikroskop Cara menghitung eritrosit 1) Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus dalam posisi rata air. 2) Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10 x), kemudian lensa tersebut diganti dengan lensa objektif besar (40x), sampai garis-garis bagi dalam bidang besar tengah jelas terlihat. 3) Hitung semua eritrosit yang terdapat dalam 5 bidang yang tersusun dari 16 bidang kecil (misalnya: pada keempat sudut bidang besar di tambah dengan satu bidang di bagian tengah). Cara dan ketentuan menghitung sel sama dengan cara menghitung leukosit. x faktor pengenceran x jumlah sel

Laboratorium Analisis Klinik

Praktikum Analisis Klinik 2011

Jumlah eritrosit jumlah sel terhitung

= Vol.kotak

x faktor pengenceran x

3. Perhitungan Trombosit a. 20 L sampel darah tambahkan Amonium Oksalat 1% 2 ml b. Tunggu 3-5 menit c. Hitung jumlah trombosit menggunakan hemositometer di mikroskop Cara menghitung trombosit 1) 2) Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus dalam posisi rata air. Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10 x), kemudian lensa tersebut diganti dengan lensa objektif besar (40x), sampai garis-garis bagi dalam bidang besar tengah jelas terlihat. 3) Hitung semua trombosit yang terdapat dalam 10 bidang yang tersusun dari 16 bidang kecil (sesuai dengan skema hemositometer untuk menghitung trombosit). Cara dan ketentuan menghitung sel sama dengan cara menghitung leukosit. Jumlah trombosit jumlah sel terhitung Vol.kotak Daftar Pustaka Rai et al., 2005, Plasma Preparation From Whole Blood, Proteomics, 5:3262-3277. Richterich, R and Colombo, J. P., 1981, Clinical Chemistry, John Wiley & Sons, USA. = 1 x faktor pengenceran x

PENETAPAN KADAR KREATININ

Laboratorium Analisis Klinik
9

Praktikum Analisis Klinik 2011

(Sampel: plasma dan urin) (Metode: Jaffe/modifikasi, tanpa deproteinisasi) Prinsip: Metode ini sederhana, untuk penentuan kreatinin dengan bantuan larutan pikrat-basa, tanpa deproteinisasi. Pereaksi: a. Larutan bufer = 6,26 g NaOH dan 0,89 g Na 2 HPO4 dalam akuades ad 1000.0 mL. b. Asam pikrat = 2,0 g dalam akuades ad 1000,0 mL. c. Larutan kreatinin baku = 1 mg dalam akuades ad 100,0 mL d. Asam klorida = 0,83 mL HCL pekat dalam akuades ad 1000,0 mL. (HCl pekat : 36,5 %; bj = 1,18) Kondisi pengukuran Larutan bufer dan asam pikrat direaksikan pada suhu 20-37 C (bufer dan larutan asam pikrat sebelumnya dibiarkan hingga mencapai suhu kamar). Suhu analisis untuk sampel dan baku harus mirip. Panjang gelombang () = 492 nm, tebal kurvet 1 cm. Konsentrasi dalam campuran reaksi akhir adalah sebagai berikut : Larutan bufer NaOH = 125,2 mmol/L dan Na 2 HPO4 = 5 mmol/L; As. Pikrat = 3,5 mmol/L Prosedur : Plasma atau Sampel (L) 50 Baku/Blanko (L) 50 1000 250

Urin (diencerkan 1 : 50) Baku/Blanko Larutan buffer 1000 Campurkan dan inkubasi selama 5 menit pada suhu kamar Asam pikrat 250

Campurkan dan ukur absorban pertama (tidak lebih dari 1 menit) pada = 492 nm, tebal kurvet 1 cm A1 . Selanjutnya, ukur kembali absorban larutan tersebut 2 menit sesudah

A2 ). Pada suhu > 30C, A1 harus diukur tidak lebih dari 30 detik. pengukuran pertama (

Laboratorium Analisis Klinik 10

Praktikum Analisis Klinik 2011

Metode tersebut menunjukkan linieritas hingga konsentrasi : 5 mg/100mL(422 mol/L) Untuk konsentrasi > 5 mg/100 mL, plasma dan urin yang telah diencerkan tadi, harus diencerkan dalam 1 : 6 larutan NaCl, dan sesudah pengulangan penentuan, hasil dikalikan dengan 6. Perhitungan :

KonsentrasiKreatinin =

A2 ( sampel ) A1 ( sampel ) x88,4 mol L A2 (baku ) A1 ( Baku ) A2 ( sampel ) A1 ( sampel ) xkonsentrasiBaku mg 100mL A2 (baku ) A1 ( Baku )

KonsentrasiKreatinin =

Soal Latihan: 1. Apakah kepentingan penetapan kadar kreatinin dalam analisis klinik ? 2. Bagaimanakah metobolisme kreatinin, dan dimana terdapat ? 3. Tuliskan pembentukan kreatinin pikrat ? 4. Gangguan apa saja yang dapat timbul pada penetapan kadar kreatini dalam plasma dengan metode pikrat-alkali ? 5. Apakah kelebihan metode Jaffe yang dimodifikasi tersebut ? 6. Bagaimana cara mengatasi problema yang ada pada nomer 4 tersebut ? 7. Pelajarilah metode metode lain untuk penetapan kadar kreatinin !

PENETAPAN KADAR KOLESTEROL TOTAL

Laboratorium Analisis Klinik 11

Praktikum Analisis Klinik 2011

(Sampel: plasma) A. METODE : LIEBERMANN BURCHARD Prinsip : Bila kolesterol direaksikan dengan asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat dalam lingkungan bebas air, maka akan terbentuk warna hijau-biru yang intens akibat pembentukan polimer hidrokarbon tan jenuh. Pereaksi : a. Pereaksi kolesterol. Mula-mula pereaksi cair didinginkan hingga 4C, kemudian ditambahkan dalam wadah ( yang didinginkan dalam ice-bath) sambil diaduk (magnetik) dengan urutan penambahan sebagai berikut : Asam asetat glasial (30mL), asam asetat anhidrid (60 mL), dan terakhir asam sulfat pekat (10 mL). Ke dalam campuran tersebut, tambahkan natrium sulfat anhidrat (2 g) dan asam 2,5dimetilbenzensulfonat. (Catatan : Larutan tersebut dalam botol gelap pada 4C stabil hingga 2 bulan. Perubahan warna menjadi sedikit kuning tidak mengganggu reaksi). b. Baku kolesterol. Timbang 250 mg kolesterol, masukkan ke dalam labu takar 100 mL. Larutkan dengan asam asetat glasial (10 mL), selanjutnya tambahkan asam asetat glasial hingga 100 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. Prosedur : Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml : Water-bath 37 C Plasma atau serum Air demineral Larutan baku Pereaksi kolesterol Sampel (ml) 0,04 2,0 Blanko pereaksi (ml) 0,04 2,0 Baku (ml) 0,04 2,0

Campurkan segera dan biarkan dalam water-bath pada 37C selama tepat 10 menit. Kemudian campurkan dan baca absorban pada = 570 nm terhadap blangko pereaksi dalam waktu tidak lebih dari 5 menit.

Laboratorium Analisis Klinik 12

Praktikum Analisis Klinik 2011

Perhitungan :

KonsentrasiKolesterol =

Absorban( sampel ) Absorban(blangko) x 250 mg 100mL Absorban(baku ) Absorban(blangko)

Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali. B. METODE ENZIMATIK Prinsip : Sampel direaksikan dengan reagen/KIT kemudian diinkubasi dalam water-bath pada 37 o C dan dibaca absorbansinya pada 560 nm Reaksi : Kolesterol ester + H2O kolesterol esterase kolesterol + as.lemak Kolesterol + O2 kolesterol oksidase kolesterol-3-one + H2O2 2H2O2+4-aminoantipyrine+phenol peroxidase quinoneimine + 4H2O Prosedur : Kerjakan dalam tabung reaksi volume 10 ml : Sampel (l) Blanko pereaksi (l) Baku (l) Plasma atau serum 10 Air demineral 10 Larutan baku 10 Pereaksi kolesterol 1000 1000 1000 Campurkan segera sampel/blanko/baku dengan reagen dan biarkan dalam water-bath pada suhu 37C selama tepat 10 menit. Kemudian baca absorban pada = 560 nm terhadap blangko pereaksi pada menit ke 0 Perhitungan :
KonsentrasiKolesterol = Absorban( sampel ) Absorban(blangko) x kadar Absorban(baku ) Absorban(blangko)

baku Lakukan replikasi sebanyak : 3 kali. LDL kolesterol (mg/dl) = kolesterol total HDL kolesterol (Trigliserida / 5)

Laboratorium Analisis Klinik 13

Praktikum Analisis Klinik 2011

Soal Latihan: 1. Apakah kepentingan penetapan kadar kolesterol pada analisis klinik ? 2. Bagaimana struktur kolesterol ? Apa yang dimaksud dengan kolesterol total? 3. Apa kelebihan metode Liebermann-Burchard pada penetapan kolesterol ? 4. Tuliskan reaksi yang terjadi pada nomer 3 ! 5. Mengapa absorban dibaca pada 560 nm ? 6. Apa fungsi masing-masing pereaksi pada metode Liebermann-Burchard ? 7. Apa kelemahan metode Liebermann-Burchard? 8. Jelaskan prinsip metode enzimatik! 9. Sebutkan kelebihan dan kekurangan metode enzimatik! 10. Apakah yang dimaksud dengan HDL, LDL dan TG? Berapa range normalnya?

PENETAPAN KADAR KARBOHIDRAT TOTAL

(Sampel: plasma)

Laboratorium Analisis Klinik 14

Praktikum Analisis Klinik 2011

A.

METODE ANILIN Bila aldose dan ketose dipanaskan dengan anilin dalam asam asetat glasial, akan terjadi reaksi dan menghasilkan senyawa berwarna dengan panjang gelombang maks. 340 nm.

Prinsip:

Pereaksi: a. Pereaksi asam triklorasetat (10%). Larutan 10 g asam triklorasetat dalam air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil pada suhu kamar. b. Pereaksi anilin Larutan 6,0 g anilin (pro analisis) dalam asam asetat glasial hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil untuk beberapa bulan. Perubahan menjadi sedikit kuning tidak menimbulkan gangguan. c. Baku glukose Larutan 110 mg glukose monohidrat dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. Prosedur : Kerjakan dalam tabung reaksi 10 mL: Water-bath 37C Sampel (mL) Blangko pereaksi(mL) Baku (mL) Asam triklor asetat 1,0 1,0 1,0 Darah, plasma, serum 0,1 Air demineral 0,1 Baku glucose 0,1 Biarkan beberapa saat, kemudian lakukan sentrifugasi dengan kuat. Pereaksi aniline Supernatan Pisahkan supernatant 5,0 5,0 0,5 0,5 5,0 0,5

Panaskan masing-masing tabung reaksi tepat 10 menit dalam water-bath mendidih. Angkat tabung reaksi, dinginkan dengan air mengalir (air kran) dan baca absorban pada panjang gelombang 340 - 440 nm, dengan blangko air demineral. Warna tersebut stabil selama 3 jam. Perhitungan :

KonsentrasiKarbohidratTotal =

Absorban( sampel ) Absorban(blangkoPereaksi) x100 mg 100m Absorban(baku ) Absorban( BlangkoPereaksi)

Laboratorium Analisis Klinik 15

Praktikum Analisis Klinik 2011

Kadar glukose normal dalam plasma = 80 120 mg/100 mL. B. METODE ENZIMATIK Prinsip: Prinsip dari metode enzimatik ini adalah enzim GOD akan mengoksidasi glukosa yang nantinya akan menghasilkan asam glukonat dan H 2O2. H2O2 yang dihasilkan setara dengan glukosa yang bereaksi. H2O2 yang terbentuk akan direaksikan oleh peroksidase dan odianisidin dan kemudian dihasilkan senyawa kunonimin (reaksi Trinder) yang berwarna merah, yang bisa dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500nm. Reaksi: Glukosa + O2 O-dianisidin Prosedur : A. Penetapan Kadar Karbohidrat Total Plasma atau serum Air demineral Larutan baku Pereaksi kolesterol Sampel (l) 10 1000 Blanko pereaksi (l) 10 1000 Baku (l) 10 1000
GOD H2O2, peroksidase

asam glukonat + H2O2 ion semiquinon + 4H2O

Inkubasi selama 10 menit di waterbath pada suhu 37C kemudian baca absorbansi pada = 500 nm dalam rentang waktu 1 jam.

B. Penetapan Kadar GPT Ambil plasma sebanyak 100 l lalu tambahkan dengan reagen I sebanyak 1 ml setelah itu inkubasi di waterbath selama 5 menit pada suhu 37C. Tambahkan reagen II sebanyak 250 l kemudian segera baca absorbansi pada menit ke 0, 1, 2, dan 3 dengan =340 nm. Lakukan replikasi 2 kali. Perhitungan :

KonsentrasiKarbohidratTotal =

Absorban( sampel ) Absorban(blangkoPereaksi ) x100 mg 100m Absorban(baku ) Absorban( BlangkoPereaksi)

Kadar glukose normal dalam plasma = 80 120 mg/100 mL.

Laboratorium Analisis Klinik 16

Praktikum Analisis Klinik 2011

Soal Latihan : 1. Apakah kepentingan penetapan kadar karbohidrat total pada analisis klinik? 2. Jelaskan metabolisme karbohidrat/glukose dan penyakit yang terkait ? 3. Apakah dasar penetapan kadar karbohidrat total dengan metade Anilin? Tuliskan reaksinya ! 4. Apakah guna asam triklorasetat tersebut ? Tuliskan reaksinya ! Bahan lain apakah yang dapat menggantikan fungsi asam triklorasetat tersebut ? 5. Apakah kerugian/ kelemahan metode Anilin untuk penetapan kadar karbohidrat total ? 6. Sebut dan jelaskan metode lain untuk penetapan karbohidrat total ! 7. Apakah makna hasil penetapan kadar karbohidrat total, terkait dengan penyakit/kepentingan diagnose ?

PENETAPAN KADAR UREA NITROGEN

(Sampel: urin dan serum)

Urea merupakan senyawa hasil metabolisme nitrogen. Pengukuran kadar urea nitrogen dapat dilakukan di dalam cairan tubuh, yaitu serum/plasma dan urin, dimana prinsip pengukurannya didasarkan pada salah satu dari metode-metode berikut : 1. Reaksi urea dengan -diketon dan senyawa -oksim

Laboratorium Analisis Klinik 17

Praktikum Analisis Klinik 2011

Metode ini dapat menggunakan reagen diacetil, diasetil monoksim, diasetil dioksim, fenilpropanadion, fenilpropanadion monoksim, -isonitrosopropiofenon, heptoksim, nioksim, dan diasetil monoksim glukuronolakton. Akan tetapi metode ini kurang spesifik karena digunakan juga dalam penetapan kadar sitrulin, alantoin, kreatinin, arginin, protein, dan lainlain. Kelemahan lain yang dimiliki metode ini adalah produk warna yang dihasilkan kurang stabil, tidak memenuhi hukum Lambert-Beer, serta memerlukan deproteinasi dan pemanasan sampai 100o C. 2. Pengukuran kadar amonia yang dihasilkan dari reaksi urea dengan urease Pada metode ini, urea dipecah dengan enzim urease enghasilkan CO2 dan amonia. Selanjutnya amonia yang dibebaskan ditetapkan kadarnya dengan reagen Berthelot. Belum diketahui adanya senyawa lain dalam tubuh yang mengalami pemecahan yang sama dengan urea, oleh karena itu metode ini mempunyai spesifitas yang tinggi terhadap urea. 3. Pengukuran dengan elektroda ion selektif Metode ini memanfaatkan urease yang dilekatkan pada membran dan pengukuran amonia yang dihasilkan dengan elektrode ion spesifik, tetapi metode ini masih dalam tahap pengembangan. 4. Pengukuran urea dengan optical test, menggunakan urease dan glutamat dehidrogenase Metode ini paling memuaskan karena penggunaan urease dikombinasikan dengan glutamat dehidrogenase. Metode fotometri lain, yaitu menggunakan p-dimetilaminobenzaldehid atau xantidrol, akan tetapi tidak spesifik dan belum banyak diketahui. Selain metode tersebut, urea dapat diukur dengan mikrodifusi, gasometri atau metode elektrokimia, tetapi sulit diterapkan untuk pekerjaan rutin Diantara metode tersebut, metode pemecahan dengan urease dilanjutkan dengan pengukuran amonia dengan metode Berthelot paling sering digunakan A. METODE BERTHELOT Urea dipecah menjadi amonia dan karbon dioksida dengan pemberian urease. Amonia yang dibebaskan ditentukan dengan metode Bethelot. Prinsip dari metode ini sebagai berikut : NH2 C NH3 + CO2 NH2 O + H2O Prinsip:

urease

Laboratorium Analisis Klinik 18

Praktikum Analisis Klinik 2011

Amonia yang dihasilkan ditetapkan kadarnya dengan metode Berthelot. Reaksi yang terjadi sebagai berikut :

I. NH3 +

HOCl

H2NCl + H2O (pH > 7,5) Kloramin [Fe(CN)5NO2]4- + H2O [Fe(CN)5H2O]3- +

As. hipoklorit [Fe(CN)5NO]2- + 2 OHNO2Nitroprusid aquapentasianoferat II. [Fe(CN)5H2O]3- + H2NCl

nitritopentasianoferat

kompleks + fenol
R
O N

R
O

(dalam medium basa)

*pembentukan monokloramin berlangsung paling cepat pada pH 10.5, sedangkan pada pH > 11.5 berjalan sangat lambat dan pada pH < 10.5 produk monokloramin yang terbentuk cepat terdekomposisi. Oleh karena itureaksi hendaknya dilakukan pada pH 10.5 11.5 *sensitifitas reaksi dapat ditingkatkan mensubstitusi posisi 2 dari cincin fenol dengan donor elektron. Senyawa yang direkomendasikan adalah 2-klorofenol. Untuk tujuan klinik, salisilat terbukti cukup sensitif.

Pengukuran kadar amonia dengan metode Berthelot sangat sensitif dan mempunyai koefisien ekstingsi molar () sebesar 20000. Selain itu metode ini memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap ion amonium. Reaksi berjalan lambat tapi dapat ditingkatkan dengan penambahan agen pengkopling, seperti Na-nitroprusid. Pereaksi : a. Larutan nitroprusid-salisilat.

Laboratorium Analisis Klinik 19

Praktikum Analisis Klinik 2011

Larutan 3 g natrium salisilat dan 60 mg natrium nitroprusid dalam air demineral hingga 100,0 mL. (Larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4 C dalam ruang gelap atau 1 bulan pada suhu kamar). b. c. d. Larutan stok hipoklorit (NaOCl dalam akuades hingga 100,0 mL. Larutan tersebut dapat disimpan selama 1 bulan pada suhu kamar. Larutan natrium hidroksida (12,5 mol/L). Larutan 50 g NaOH dalam akuades hingga 100,0 mL. Larutan NaOH-hipoklorit (NaOC1 550 mmol/L; NaOH 6,25 mol/L). Campurkan dengan jumlah yang sama larutan stok hipoklorit (1,1 mol/L) dengan larutan NaOH (12,5 mol/L). (larutan ini dapat disimpan selama 6 bulan pada 4C dalam ruang gelap atau 1 bulan pada suhu kamar). e. Larutan urea-nitrogen baku (20 mg/100 mL atau 7,13 mmol/L). Larutan 42,8 mg urea dalam larutan jenuh, dingin asam benzoat dalam air demineral dan encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan asam benzoat yang sama. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. f. Bufer EDTA (27 mmol/L, pH 6,5). Larutan 1 g Na 2 EDTA.2 H 2 O .2H20 dalam 99 mL air demineral, atur pH larutan hingga tepat 6,5 menggunakan larutan NaOH, encerkan dengan air demineral hingga 100,0 mL. Larutan ini stabil dalam jangka waktu tak terbatas. g. Larutan 25 mg urease dalam buffer EDTA dan encerkan hingga 50,0 mL denngan buffer tersebut. Larutan stabil selama beberapa minggu pada 4 C Prosedur : Sampel Blangko sample Baku Blangko baku (mL) (mL) (mL) (mL) Larutan urease 0,1 0,1 Serum, plasma 0,02 0,02 Larutan baku 0,02 0,02 Inkubasi pada 37C selama 20 menit atau pada suhu kamar selama 30 menit Larutan salisilas 2,5 2,5 2,5 2,5 Larutan urease 0,1 0,1 Larutan hipoklorit 2,5 2,5 2,5 2,5 Biarkan masing-masing larutan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian baca absorban terhadap blangko air demineral pada = 546 nm ( 540 590 nm). Perhitungan :

Laboratorium Analisis Klinik 20

Praktikum Analisis Klinik 2011

KonsentrasiUreaNitrogen =

Absorban( sampel ) Absorban(blangkoSampel ) x 20 mg 100mL Absorban(baku ) Absorban( BlangkoBaku )

KonsentrasiUrea =

Absorban( sampel ) Absorban(blangkoSampel ) x 42,8 mg 100mL Absorban(baku ) Absorban( BlangkoBaku )

Kondisi normal : 347

Dewasa, n Urea nitrogen Urea = 7,8 21,4 mg/100 mL.

= 16,7 45,9 mg/100 mL.

B.

METODE ENZIMATIK Prinsip dari metode enzimatik ini adalah urea dalam sampel serum atau urin dengan bantuan enzyme urease akan menghasilkan amoniak dan CO2. Kemudian amoniak bersama dengan -ketoglutarat, NADH dan dibantu oleh enzyme GLDH akan menghasilkan L-glutamat, NAD dan H2O. Penurunan absorbansi pada panjang gelombang 340 nm menunjukkan adanya peningkatan NADH yang digunakan atau peningkatan kadar urea dalam sampel.

Prinsip:

Reaksi: Urea + H2O amoniak + Prosedur : Baku Serum atau Baku (L) 10 Sampel (L) 10
urease

amoniak + CO2
GLDH

-ketoglutarat + NADH + H+

L-glutamat + NAD + H2O

Urin (pengenceran 101x) Reagen 1 10 10 Campurkan dan inkubasi selama 5 menit pada suhu 370 C Reagen 2 250 250 Campurkan dan inkubasi selama 30-40 detik pada suhu 370 C ukur absorban pertama (menit ke 0) pada = 365 nm, tebal kurvet 1 cm A1 . Kemudian, ukur kembali absorban larutan tersebut 1 menit sesudah pengukuran pertama ( A2 ). Perhitungan : Absorbansi sampel atau baku = [(A1 + A2)sampel/baku ] [(A1 + A2) blanko] 2 2

Laboratorium Analisis Klinik 21

Praktikum Analisis Klinik 2011

Kadar urea = Absorbansi sampel Absorbansi baku Soal Latihan :

x Konsentrasi Baku x faktor pengenceran (untuk urin)

1. Apakah kepentingan penetapan kadar urea-nitrogen dalam analisis klinik ? 2. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar urea-nitrogen dengan metode Betherlot ! 3. Apakah kelebihan metode Berthelot pada penetapan kadar urea-nitrogen? 4. Mengapa digunakan air demineral ? Bagaimana cara membuat air demineral? 5. Apakah fungsi EDTA pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut ? 6. Apakah manfaat pada penetapan kadar urea-nitrogen tersebut, terkait dengan kepentingan diagnose ? 7. Pelajarilah metode lain untuk penetapan kadar urea-nitrogen ! 8. Jelaskan prinsip metode enzimatik! 9. Sebutkan keuntungan dan kelebihan metode enzymatik ! 10. Jelaskan fungsi masing-masing reagen yang digunakan dalam metode enzymatik !

PENETAPAN KADAR PROTEIN TOTAL

(Sampel: urin) A. METODE SPEKTROFOTOMETRI Prinsip :

Laboratorium Analisis Klinik 22

Praktikum Analisis Klinik 2011

Warburg dan Cristian adalah orang yang pertama kali memperkenalkan bahwa dengan menggunakan persamaan sederhana atau nomogram, dapat dievaluasi konsentrasi protein dan asam nukleat dari absorban larutan sample pada = 280 dan 260 nm. Penentuan tersebut menggunakan prinsip pengukuran absolut. Pereaksi : Larutan natrium klorida 0,9 %. Larutan 0,9 g NaCl dalam akuades hingga 100,0 mL. Prosedur : Blanko (L) Urin (L) Sampel 20 20 NaCl 1000 1000 Absorban larutan sampel yang ditentukan konsentrasi proteinnya diukur pada 260 dan 280 nm terhadap blangko larutan NaCl. Replikasi 2x Perhitungan : Konsentrasi protein = [1,55 x Abs. pada 280 nm] [0,76 x Abs.pada 260 nm] mg/mL. Selanjutnya hasil tersebut dibaca pada Nomogram. Soal Latihan : 1. Apakah kepentingan penetapan kadar protein dalam analisis klinik ? 2. Apakah dasar penetapan kadar protein secara spektrofotometri UV ? 3. Apakah syarat metode tersebut dapat digunakan ? 4. Gangguan apakah yang ada pada metode spektrofotometri UV tersebut ? 5. Pakah kelemahan spektrofotometri UV penetapan kadar protein ? 6. Pelajarilah cara lain untuk penetapan kadar protein ! Calculation According to Layne. 8 Concentration = [ 1.55 E(280)] [0.76E(260)] mg ml 1 Reading the result straight from the monogram (Fig.105).

Laboratorium Analisis Klinik 23

Praktikum Analisis Klinik 2011

B. METODE BIURET Prinsip : Senyawa dengan dua atau lebih ikatan peptida apabila direaksikan dengan garam kupri dalam suasana basa akan membentuk warna violet. Pereaksi :

Laboratorium Analisis Klinik 24

Praktikum Analisis Klinik 2011

a. Pereaksi basa. Larutan 36 g urea dalam larutan NaOH ( 20 g/250mL akuades) dan encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan NaOH yang sama. b. Pereaksi Biuret. Larutkan 4,25 g CuSO 4 dalam lebih kurang 25 mL air demineral. Larutkan 1,8 g KI dalam lebih kurang 25 mL air demineral. Larutkan 43,5 g natrium sitrat dan 25 g Na 2 CO3 dalam lebih kurang 250 mL air demineral. Sambil diaduk/digoyang, tambahkan larutan CuSO 4 tersebut di atas, dan terakhir tambahkan larutan KI. Masukkan 180 g urea ke dalam larutan terakhir tersebut dengan pengadukan tetap, selanjutnya encerkan dengan air demineral hingga 500,0 mL. c. Larutan Biuret. Untuk penggunaan dalam analisis, campurkan sama banyak volume (1 bagian pereaksi basa dan 1 bagian pereaksi Biuret).

d. Larutan albumin baku (tahan selama beberapa bulan pada suhu 4C). Larutkan 7 g albumin baku dalam larutan KCl (373 mg/250 mL dalam akuades) yang telah diatur pHnya hingga 6,5 6,8 menggunakan larutan natrium karbonat, selanjutnya encerkan hingga 100,0 mL dengan larutan KCl tersebut. Prosedur : Baku (L) Sampel Pereaksi Biuret Pereaksi Basa 20 1000 1000 Urin (L) 20 1000 1000

Baca absorban terhadap blanko aquadest antara menit ke 30 dan 40 sesudah pencampuran pada 546 nm.

Konsentrasi Pr otein =

Absorban( sampel ) Absorban(blangkoPereaksi) xKons. Pr otein g 100mL Absorban(baku ) Absorban( BlangkoPereaksi)

C. METODE FOTOMETRI DENGAN BROMOKRESOL-GREEN

Laboratorium Analisis Klinik 25

Praktikum Analisis Klinik 2011

Prinsip : Dengan adanya bromokresol hijau dalam suasana asam, albumin yang berwarna kuning hijau akan diubah menjadi hijau biru dan akan dibaca serapannya pada 546 nm. Prosedur : Baku Albumin (L) Sampel Reagen 10 1000 Urin (L) 10 1000

Campurkan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 370 C Baca absorban terhadap blanko aquadest dalam rentang waktu 60 menit sesudah pencampuran pada 546 nm. Replikasi 2 kali.
KonsentrasiAlbu min = Absorban( sampel ) xKons.bakuAlbu min Absorban(baku )

Soal Latihan ; 1. Apakah kelebihan penetapan kadar protein cara Biuret dibanding metode spektrofotometri UV ? 2. Apakah dasar penetapan kadar protein cara Biuret ? 3. Tuliskan reaksi yang terjadi pada penetapan kadar protein cara Biuret ? Jelaskan mengapa terbentuk warna? 4. Apakah kelebihan penggunaan albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ? 5. Apakah gangguan yang ada pada penetapan kadar protein cara Biuret ? 6. Apakah senyawa pengganti albumin sebagai standar pada penetapan kadar protein ? 7. Jelaskan prinsip penetapan kadar protein dengan metode fotometri dengan bromokresol green ! 8. Sebut dan jelaskan komponen dan fungsi reagen pada metode no. 7 ! DAFTAR PUSTAKA

Christian, G.D., 1994, Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Laboratorium Analisis Klinik 26

Praktikum Analisis Klinik 2011

Lewandrowski, K., (Editor) 2002, Clinical Chemistry, Laboratory management and clinical correlations, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, A Wolters Kluwer Company, Philadelphia. Richterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry, Theory, Practice, and Interpretation, John Wiley & Sons, Chichester. Smith, R.V. and Stewart, J.T., 1981, Textbook of Biopharmaceutic Analysis, A description of methods for the determination of drug in biological fluids, Lea & Febiger, Philadelphia. Stryer, L., 1995, Biochemistry, Fourth Edition, W.H. Freeman and Company, New York.

Laboratorium Analisis Klinik 27