PROPOSAL PENELITIAN TESIS PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK FKUI UNTUK KEPERLUAN SEKRETARIAT

1 Penelitian Nama: Arfi Kurniawan, S.Pd. NPM: 1206178483

Pembimbing Tim pembimbing tesis tidak boleh melebihi dua orang termasuk Penasehat Akademik.

Nama: Andriansjah Nama:

Gelar: S.Si, MS.Biomed., Ph.D Gelar:

Judul Riset

Pengklonan dan Ekspresi Protein MPT 64 Mycobacterium tuberculosis H37Rv pada Escherichia coli non patogen

Kekhususan

Mikrobiologi

Kata Kunci

Ekspresi protein MPT 64 6 Persetujuan Pembimbing

Mycobacterium tuberculosis E. coli non patogen

Nama: Andriansjah, S.Si, MS. Biomed., Ph.D Tanggal

Tanda Tangan

Persetujuan Ketua Kekhususan

Nama: Dra. Beti Ernawati Dewi, Ph.D

Tanda Tangan

Tanggal

Persetujuan Penilai Proposal

Nama Penilai & Gelar

Institusi Contoh Dept. Biokimia Molekuler FKUI & Biologi

Tanggal dan Tanda tangan

Penilaian (mohon diberi tanda ) Diterima tanpa perbaikan Diterima dengan perbaikan ( mohon diberikan komentar) Tidak diterima (mohon diberikan komentar)

Komentar Penilai (apabila tidak mencukupi dapat dituliskan di lembar tambahan)

10

Latar Belakang

Penyakit tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. Secara global, pada tahun 2011 terdapat 8.7 juta kasus baru serta 1.4 juta kematian akibat infeksi TB[1]. Infeksi TB telah menjadi masalah kesehatan utama di seluruh dunia khususnya di negara berkembang. Indonesia menjadi negara ke-4 dengan jumlah penderita TB terbanyak. Angka kematian akibat TB tahun 2011 adalah 27 per 100.000 penduduk dan terdapat 450.000 kasus TB baru setiap tahunnya[2]. Lebih lanjut lagi, TB menjadi salah satu penyebab terhambatnya pertumbuhan ekonomi di negara berkembang, termasuk Indonesia. Hal ini disebabkan karena 75% pasien TB adalah kelompok usia yang paling produktif secara ekonomis (15-50 tahun)[3]. Saat ini Bacillus Calmette-Guerin (BCG) merupakan satu-satunya vaksin yang tersedia untuk tuberculosis. Kelebihan vaksin ini adalah relatif aman untuk mencegah TB berat pada anak [6]. Namun, efektifitas BCG untuk mencegah TB aktif pada usia dewasa ternyata sangat rendah dan proteksi terendah justru terjadi pada negara dengan insiden TB yang tinggi. Lebih jauh lagi kekurangan BCG adalah dapat menyebabkan terjadinya infeksi bila diberikan pada individu yang memiliki kelainan sistem imun. Dengan demikian, pengembangan vaksin yang lebih efektif diyakini dapat menghentikan atau mengurangi epidemi TB[4]. Beberapa kriteria vaksin yang dibutuhkan untuk TB adalah dapat memberikan kekebalan yang lebih baik dari BCG, cepat memberikan respon perlindungan terhadap TB, dapat mengurangi kesakitan pada penderita TB dan dapat mencegah terjadinya reaktivasi TB[5].

Lanjutan Latar Belakang

11

Permasalahan a. Identifikasi Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah di atas, maka timbul berbagai permasalahan, antara lain : 1. Apakah antigen PPE28 dapat diekspresikan pada bakteri E.coli? 2. Apakah antigen PPE28 yang diekspresikan pada bakteri E.coli dapat menghasilkan protein PPE28? 3. Apakah Protein PPE28 dapat menjadi kandidat vaksin tuberculosis? b. Perumusan Masalah Berdasarkan uraian latar belakang dan identifikasi permasalahan di atas, maka penelitian ini dapat dirumuskan sebagai berikut : Apakah antigen PPE28 yang diekspresikan pada bakteri E.coli dapat menghasilkan protein PPE28?

12

Tujuan Riset

Tujuan Umum : Tujuan umum dari penelitian adalah untuk memperoleh protein PPE28 M. tuberculosis H37RV yang diekspresikan pada E.coli. Tujuan Khusus : 1. Dapat mengamplifikasi gen PPE 28 M. tuberculosis. 2. Memperoleh klon gen PPE 28 dari genom M. tuberculosis. 3. Memperoleh ekspresi gen PPE28 yang diklon pada plasmid PET 28b yang diekspresikan pada bakteri E.coli. Manfaat Penelitian : 1. Mengetahui cara pembuatan protein rekombinan pada vector PET 28b yang diekspresikan pada bakteri E.coli, sehingga dapat diterapkan pada penelitian lainnya. 2. Protein PPE28 yang dihasilkan dapat digunakan sebagai kandidat vaksin tuberculosis.

13

Rencana Riset

SKEMA PENELITIAN Ekstraksi DNA Genom M. tuberculosis

PCR gen target dan Sekuensing

Pengklonan Gen Target ke Plasmid

Perbanyakan Plasmid Rekombinan pada Bakteri E.coli DH5

Transformasi Plasmid Rekombinan pada Bakteri E.coli BL21

Ekspresi Protein Rekombinan

BAHAN DAN METODE Disain Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorium.

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Departemen Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia dari bulan September 2013 sampai dengan bulan Juni 2014. Metode Penelitian 1. Ekstraksi DNA Genom Mycobacterium tuberculosis diekstraksi dari sel bakteri M. tuberculosis yang ditumbuhkan pada medium Lowenstein-Jensen (LJ) dengan menggunakan teknik pemanasan. Lebih detail lagi, sel bakteri M. tuberculosis dimasukkan ke dalam tabung plastik 1,5 ml berisi 300 l air steril. Kemudian, Tabung yang berisi sel bakteri tersebut dipanaskan 100 oC selama 30 menit dan setelah itu didiamkan sampai mencapai suhu ruang. Selanjutnya, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang mengandung DNA kemudian dipindahkan ke tabung dan disimpan -20oC sampai saat digunakan. 2. PCR Amplifikasi dan DNA Sekuensing PCR dilakukan dengan menggunakan primer yang mengandung situs pemotongan (situs restriksi) yang didesain agar dapat mengamplifikasi seluruh dari fragmen gen target secara spesifik. Fragmen yang sudah diamplifikasi kemudian di-sequencing untuk mengetahui susunan basa tetap in frame dan memastikan tidak ada mutasi. 3. Pengklonan Gen Target ke Plasmid pET 28b Plasmid pET 28b dan fragmen gen dipotong menggunakan enzim restriksi yang sesuai dengan situs restriksi yang tersedia. Fragmen yang sudah dipotong kemudian diligasi dengan enzim T4 DNA Ligase untuk mendapatkan plasmid yang mengandung gen target. 4. Perbanyakan Plasmid yang Mengandung Gen Target Plasmid rekombinan kemudian ditransformasikan ke E.coli strain DH5 menggunakan metode kimia, yaitu plasmid ditambahkan pada bakteri kompeten E.coli DH5. Kemudian, campuran diinkubasi dalam es selama 30 menit dan dilanjutkan pada suhu 42oC selama 1,5 menit. Bakteri yang ditransformasikan plasmid kemudian di kultur pada medium LB dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam yang dilanjutkan dengan inkubasi selama 18-20 jam pada suhu 37 oC di medium LB agar mengandung marker antibiotik. Bakteri yang tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik kemudian diisolasi plasmidnya serta diuji untuk melihat tidak ada mutasi pada susunan basanya. Plasmid yang mengandung sisipan gen target kemudian ditransformasi pada E.coli strain BL21 untuk kepentingan ekspresi protein. 5. Ekspresi Protein E.coli strain BL21 yang telah mengandung plasmid ditumbuhkan pada medium LB pada suhu 28 oC menggunakan inkubator dengan shaker sampai tingkat pertumbuhan OD600 0,4. Kemudian, kultur ditambahkan dengan IPTG 1 mM yang dilanjutkan dengan inkubasi pada kondisi yang sama selama 4-5 jam. Sel dipanen setelah dicuci dengan buffer Tris-EDTA (TE). Sel yang dipanen selanjutnya ditambahkan buffer lisis dan dipanaskan pada suhu 100 oC selama 10 menit dan dilakukan SDS-PAGE 8% untuk melihat protein ekspresi.

14

Jadwal Penelitian

No Kegiatan

Bulan Agu 13Sep 13

Okt 13- Des13 Nov13 Mar 14

April 14Mei14

Juni 14Juli 14

Juli 14Agu 14

1. 2.

3. 4.

Studi pustaka Persiapan alatalat dan bahan penelitian Penelitian Penulisan

15

Persyaratan Etik

Implikasi Etik Eksperimental pada Manusia Penelitian ini menggunakan arsip sampel (Bahan Biologi Tersimpan/ BBT) sehingga tidak memerlukan informed consent. Walaupun penelitian ini menggunakan arsip sampel, tetapi persetujuan etik akan tetap diajukan ke komisi etik untuk mendapatkan persetujuan kegiatan penelitian ini.

16

Daftar Pustaka Harus relevan dengan usulan. Tidak lebih dari satu halaman.

[1] World Health Oorganization, (2012), Global Tuberculosis Report 2012. Geneva: WHO Press. [2] World Health Organization, (2012), Tuberculosis Control In South-East Asia Region 2012. Geneva: WHO Press. [3] World Health Organization, (2011), Tuberculosis Profile: Indonesia. Geneva: WHO Press. [4] Delogu G, Fadda G.,(2009),The quest for a new vaccine against tuberculosis. J. Infect. Developing Countries. 3;5-15. [5] Parida S, and Kaufmann S.,(2010), Novel tuberculosis vaccines on the horizon. Curr.Opin.In Immunol. 22;1-11. [6] Rodrigues LC, Diwan VK, Wheeler JG, (1993), Protective effect of BCG against tuberculous meningitis and miliary tuberculosis: a meta-analysis. Int J Epidemiol.22(6):1154-8.