Penentuan Cepat Tiamin, Riboflavin, Pyridoxine, dan Niacinamide di Formula untuk Bayi dengan Kromatografi Cair Abstrak Sebuah

disederhanakan, penentuan simultan vitamin B1, B2, B3, dan B6 dalam formula bayi ditambah dikembangkan dari deproteinized tunggal ekstrak sampel, dengan analisis dengan fase terbalik, kromatografi pasangan-ion dengan diasamkan metanol- fase gerak air. dioktilsulfosuksinat The kontra-ion memfasilitasi retensi unik dari vitamin piridin-based (niacinamide dan piridoksin) dan memungkinkan untuk pengukuran bersamaan dari kedua piridoksal dan riboflavin 5 -fosfat komponen endogen susu. lainnya alami terjadi congener vitamin terdeteksi memiliki signifikansi analitis minimal. deteksi UV digunakan untuk niacinamide, dan fluoresensi diprogram deteksi digunakan untuk riboflavin dan vitamin B6. Tiamin rutin ditentukan secara berurutan dalam kondisi elusi dimodifikasi. Vitamin fortifikasi susu formula untuk bayi diperbolehkan dalam rentang profilaksis didefinisikan untuk memenuhi gizi persyaratan bayi nonbreastfed dan tunduk pada kontrol regulasi ketat komposisi dan pelabelan. Potensi keragaman tambahan dan endogen bentuk terjadi vitamin individu hadir dalam rumus merupakan tantangan analitis yang signifikan, baik dari kepatuhan dan perspektif klinis. Ekstraksi merupakan faktor penting yang mempengaruhi keandalan analitis untuk perkiraan komprehensif konten vitamin B , dan dalam pandangan berbagai protokol yang digunakan , mungkin secara signifikan berkontribusi terhadap ketidakpastian pengukuran . Umumnya, kombinasi hidrolisis asam dan pencernaan enzimatik adalah digunakan untuk melepaskan endogen protein - terikat dan terfosforilasi vitamin B kompleks . Sebagai analit bebas dan dalam minimal bentuk molekul , mereka kemudian dapat dikumpulkan dengan vitamers tambahan selama protokol deteksi berikutnya . Namun, isi dari formula bayi dinyatakan pada dasar pemulihan vitamin ditambahkan selama pembuatan , sehingga menyederhanakan protokol ekstraksi yang diperlukan dan meminimalkan vitamin individu membentuk akan ditentukan . Secara khusus , susu formula yang mengandung vitamin B1 , B2 , B3 , dan B6 dilengkapi dengan tiamin hidroklorida , riboflavin [ atau kadang-kadang riboflavin mononukleotida ( FMN ) ] , niacinamide , dan pyridoxine dihidroklorida , masing-masing, tingkat dimaksudkan untuk kedua meniru ASI manusia dan kompensasi kerugian pengolahan. Protokol pengukuran tradisional yang didasarkan pada mikrobiologi assay sensitif dan menyediakan single yang , estimasi lactobacilli - spesifik aktivitas biologis melalui respon gabungan dari semua vitamers hadir . Namun , seperti metode yang panjang , manipulatif , dan umumnya presisi miskin . Alternatif kompendial spektrofotometri atau metode kimia fluorimetric mapan meskipun potensi mereka untuk gangguan matriks , sedangkan gas yang tersedia teknik kromatografi ( 1 ) belum umum diadopsi . Atribut relatif dari kompendial mikrobiologi

dan metode kimia untuk pelabelan gizi memiliki telah ditinjau ( 2-4 ) .

, Prosedur handal , dan nyaman yang cepat diperlukan untuk kontrol kepatuhan rutin dan pelabelan banyak dibentengi makanan , dan kromatografi ( LC ) prosedur cair, secara umum , telah digantikan metodologi alternatif. banyak seperti teknik untuk vitamin B - kelompok individu dalam nonfortified dan makanan yang diperkaya didasarkan pada protokol ekstraksi ketat diikuti dengan baik ion - penindasan , ion - interaksi , atau pasangan ion terbalik - fase LC . Metode ini telah secara komprehensif Ulasan dalam literatur ( 3-10 ) . Telah relatif mudah untuk mendirikan simultan, multianalyte LC atau teknik elektroforesis kapiler untuk menentukan Vitamin B-kelompok dalam obat-obatan dan vitamin daya tahan tubuh (11-17). Namun, kompleksitas dari matriks makanan dan tingkat analit rendah membatasi bersamaan atau simultan penentuan vitamin ditambahkan ke sedikit analit. Dengan demikian, berbagai kombinasi tiamin, riboflavin, niacinamide, dan pyridoxine telah berhasil ditentukan dilengkapi makanan dan prosedur tersebut telah secara komprehensif Ulasan (4, 10) atau dilaporkan (18, 19). aplikasi untuk susu formula semakin mengandalkan penghapusan sederhana protein dengan pengendapan kimia, diikuti oleh terbalik fase LC dengan baik asam ion-reagen pasangan alkilsulfonat (18-20), atau ion-penekanan mengikuti fase padat pembersihan (21).

eksperimental peralatan LC system.-Terdiri dari pompa, autosampler, dan diprogram Detektor UV dan fluoresensi dalam seri, dikendalikan oleh perangkat lunak Kelas-VP (Shimadzu, Tokyo, Jepang). A Kolom 5 mm, ujung bertopi, polimer C18 Luna Prodigy ODS (3) (150 '4,6 mm, kadar karbon 15,5%) dan kolom penjaga (Phenomenex, Torrance, CA) cocok, meskipun setara kolom juga dapat digunakan.

Analisis yang komprehensif dari vitamin B-kelompok di endogen tingkat dalam makanan alami memerlukan skema ekstraksi ketat yang dapat digunakan untuk melepaskan gratis, terfosforilasi, dan protein yang terikat bentuk. Skema tersebut, umumnya menggabungkan kedua asam dan enzimatik prosedur, telah baik ditinjau (3-5, 24). Namun, untuk makanan suplemen, teknik yang komprehensif tersebut mungkin kurang dibenarkan, dan strategi persiapan sampel disingkat menggabungkan penghapusan protein telah dilaporkan untuk memberikan estimasi gizi handal vitamin ini dalam formula bayi (19, 20, 25-27) dan susu (28, 29). Dalam metode tersebut, protein dihapus dengan trikloroasetat, perklorat, tungstic, sulfosalicylic, atau mineral precipitants protein asam, meskipun timbal asetat juga telah menganjurkan. Penelitian ini dipilih asam trikloroasetat, berdasarkan baik pada efektivitas dalam menghilangkan protein susu dan tidak adanya artefak bawah kromatografi yang kondisi yang dijelaskan.

Meskipun ion-penindasan telah berhasil sederhana aplikasi farmasi, ketidaksamaan struktural B-kelompok vitamin umumnya mengharuskan penggunaan teknik pasangan ion untuk analisis matriks makanan yang lebih kompleks. Para alkylsulfonates kationik telah dianjurkan hampir eksklusif, meskipun selektivitas pemisahan tersebut menghasilkan retensi miskin niacinamide dan piridoksin, dan retensi tinggi riboflavin (18-20, 25, 26, 30-32). Sayangnya, deteksi selektif dan sensitif niacinamide kehadiran awal-eluting eksipien matriks makanan sulit di bawah kondisi ini, karena hanya UV tersedia untuk memonitor vitamin ini. Garam natrium dari dioktilsulfosuksinat belum umum menganjurkan sebagai counter - ion di bawah fase terbalik Prosedur pasangan ion , meskipun fungsi yang unik adalah dijelaskan sebelumnya untuk aplikasi farmasi ( 33-35 ) dan vitamin B-kompleks ( 11 , 36 ) . Dibandingkan dengan konvensional alkylsulfonates , retensi disempurnakan diberikan untuk nitrogen struktur mungkin disebabkan yang sangat lipofilik fungsi alkil bercabang dua dari dioktilsulfosuksinat kontra -ion . Dengan demikian , di bawah dijelaskan kondisi eluen asam , niacinamide terprotonasi dan pyridoxine secara selektif dipertahankan , sehingga memudahkan

penggunaan lebih aman dari deteksi UV untuk niacinamide . Namun , retensi vitamin B - kelompok bukan semata-mata merupakan fungsi dari analit pKa , dan properti lainnya , termasuk polaritas , terlibat . Dengan demikian , retensi relatif hidrofobik riboflavin sebagian besar merupakan fungsi polaritas eluen , dan meskipun eluting awal , sifat fluoresensi spesifik dari kedua riboflavin dan FMN memungkinkan deteksi tegas mereka. Tiamin sangat dipertahankan di bawah kondisi yang dijelaskan untuk vitamin lainnya , dan eluen pH yang lebih tinggi dan metanol konten yang diperlukan untuk memfasilitasi analisis yang nyaman. meskipun tiamin dapat berhasil ditentukan secara simultan dalam kondisi elusi gradien ( 11 ) , panjang menengahi re - equilibrium terhadap kemanfaatan dari teknik ini . Oleh karena itu lebih baik untuk menganalisis untuk tiamin berurutan daripada secara bersamaan , meskipun tes yang sama ekstrak sampel yang digunakan . Pengukuran sensitif dan spesifik tiamin telah rutin dicapai pada kedua endogen dan tingkat bawah dilengkapi kromatografi dijelaskan kondisi , menggunakan pasca - kolom pembentukan tiokrom yang berfluoresensi biru dengan deteksi fluoresensi . Namun, untuk bayi ditambah formula dan makanan lain yang serupa , deteksi UV cukup sensitif , sehingga menyederhanakan kromatografi yang konfigurasi untuk analisis kepatuhan rutin . The B - kelompok vitamin disintesis oleh mikroorganisme rumen pada sapi dan disajikan dalam susu sapi terutama dalam bebas , bentuk nonphosphorylated mereka ( 37 , 38 ) . Dengan demikian , sebagian besar vitamin B1 terjadi sebagai tiamin gratis ( 27 ) , B2 sebagai riboflavin bebas dengan kontribusi kecil dari flavin monoucleotide ( FMN ) dan flavin adenin dinukleotida ( FAD , 25 , 39 ) , B3 terutama sebagai niacinamide gratis ( 38 ) , andB6 sebagai piridoksal gratis dengan cukup jumlah pyridoxamine ( 25 ) . Literatur konsensus umumnya didukung oleh data yang diperoleh untuk NISTRM8435 seluruh susu, di mana pemulihan endogen gratis B - vitamin rentang pada 61-85 % dari nilai yang ditetapkan . Penerimaan untuk ditambah NIST SRM 1846 susu formula , bagaimanapun , hampir kuantitatif , didasarkan pada kesesuaian dengan interval nilai yang diberikan didirikan dari metode referensi pengukuran jumlah vitamin konten . Data tersebut mengkonfirmasi kemanjuran dari ekstraksi dijelaskan protokol dalam memulihkan baik tambahan gratis dan sebagian besar vitamin endogen .

Setiap vitamin yang secara kuantitatif dengan teknik standar eksternal berikut analisis regresi linier dan interpolasi. FMN mungkin, namun, diukur baik terhadap otentik FMN seperti yang dijelaskan, atau terhadap standar riboflavin, berdasarkan hasil setara fluoresensi mereka (39). meskipun spektrofotometri (444 nm) dapat digunakan untuk mengukur vitamin B2, fluoresensi lebih disukai dalam pandangan kedua relatif tingkat rendah dan retensi miskin endogen FMN susu.

Berbagai kolom analitis berbasis C18 menghasilkan sebanding selektivitas untuk B2, B3, dan B6 kelompok, meskipun relatif pH rendah dan kandungan air yang tinggi eluen. meskipun inovatif Octadecylsilane tertanam-hidrofilik kolom telah dikembangkan untuk beroperasi di bawah kondisi seperti itu, aplikasi ini tidak menawarkan keuntungan lebih konvensional ketik kolom B. kesimpulan Sebuah metode cepat dijelaskan melibatkan ekstraksi sederhana Prosedur dan pasangan ion terbalik-fase LC penentuan vitamin B1, B2, B3, dan B6 dalam formula bayi. yang digambarkan protokol multianalyte memfasilitasi pengukuran kedua tambahan dan sebagian besar vitamin endogen, tanpa kebutuhan asam multistage dan / atau skema ekstraksi enzim. Perkiraan hampir kuantitatif kandungan vitamin agregat memberikan strategi yang mudah dan cocok-untuk-tujuan rutin analisis susu formula baik untuk kepatuhan atau gizi persyaratan pelabelan, dengan presisi unggul dibandingkan dengan Metode referensi tunggal-vitamin.