Anda di halaman 1dari 26

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

BAB I PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang DNA merupakan molekul yang sangat panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida (ada empat jenis), yang bergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk untaian ganda. PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasa Adenine), dCTP (nukleotida berbasa Cytosine) dan dTTP (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002). Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode
1

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan. Lamdji (1998, dalam Wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan Surzycki (2000) pun menyatakan ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

1.2 Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah yang kami angkat pada praktikum ini adalah bagaimana rangkaian proses pengisolasian dan amplifikasi gen ITS dari DNA buah stroberi?

1.3 Pertanyaan Penelitian Untuk lebih mengetahui detail rumusan masalah dalam praktikum ini, kami mendukungnya melalui beberapa pertanyaan penelitian, diantaranya sebagai berikut: a. Bagaimana cara melakukan isolasi DNA dari buah stroberi? b. Bagaimana teknik amplifikasi DNA melalui PCR? c. Bagaimana pita DNA yang terbentuk melalui teknik elektroforesis dengan penanda gen ITS?

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi


1.4 Tujuan Adapun tujuan praktikum ini adalah sebagai berikut: a. Mengetahui cara mengisolasi DNA dari buah stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

b. Mengetahui cara mengamplifikasi DNA dari buah stroberi melalui teknik PCR c. Mengetahui cara elektroforesis DNA buah stroberi dengan penanda gen ITS

BAB II
3

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

ISOLASI DNA, PCR DAN ELEKTROFORESIS

2.1 DNA DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis induk. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan 3 berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen. DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma. Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5 ke 3sedangkan yang lain berorientasi ujung 3 ke 5. Ujung 5 merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5fosfat dan ujung 3 berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose
4

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dan sitosin. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah: 1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup. 2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekulmolekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri. (Campbell, 2008)

2.2 Isolasi DNA Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2008). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan DNA. Prosedur ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya 95 C) dalam asam, reaksi memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2deoksiribosa akan dikonversi ke w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260 dan 280 nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm, sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan
5

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi


protein akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada gel agarose, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal. Weisburg, et al (1991) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapantahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstraksi sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

2.3 PCR Rantai polimerase reaksi (PCR) adalah teknik ilmiah dalam biologi molekuler untuk memperkuat tunggal atau beberapa salinan sepotong DNA di beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan dari urutan DNA tertentu. Dikembangkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis, PCR sekarang teknik umum dan sering sangat diperlukan digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai aplikasi. Reaksi berantai polimerase dapat digunakan untuk memperkuatDNA beruntai ganda dan tunggal kedua. Untuk melakukan PCR, orang harus tahu setidaknya sebagian dari urutan molekul DNA target yang harus disalin. Umumnya, PCR menggunakan DNA kecil target 100-1000 pasangan basa (bp) panjang. Ini secara teknis sulit untuk memperkuat target lebih dari 5000 bp panjang. Sepasang primer oligonukleotida tunggal terdampar, yang memiliki urutan DNA melengkapi daerah mengapit dari urutan target, harus disintesis. Primer yang melengkapi kedua ujung urutan target, tetapi terletak pada untaiyang berlawanan. Primer biasanya 20-30 nukleotida panjang dan mengikat ke wilayah mengapit komplementer pada ujung 3 ' (Rao, 2006). Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA
6

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu (Wolfe, 1993). PCR menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan diamplifikasi (Davis et al, 1994). Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase yang digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan (Wolfe, 1993). 2.3.1 Komponen PCR

Pada proses PCR selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah: 1. Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan. 2. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. 3. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. 4. Ion Logam Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+) (Innis, MA, et al, 1994).

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

2.3.2Tahapan Reaksi Berdasarkan Mullis, et al, 1987 setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu: 1. Denaturasi Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 90C-95c selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. 2. Annealing Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40C-60C selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer. Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72 oC. 3. Ekstensi/elongasi Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70C-72C. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah
8

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3 dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler. Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut: 4. Pra-denaturasi Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu). 5. Final Elongasi Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan (Mullis, et al, 1987). 2.4 Elektroforesis Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil Elektroforesis digunakan untuk yang terlihat adalah
9

elektroforesis

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potonganpotongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings, 1994). Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Klug & Cummings, 1994). Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik danloading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings, 1994). Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikelpartikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Ward, 1998).
10

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA bermigrasi. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar well; ii) pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam well, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. (Zumft, 1997)

2.5 Internal Transcribed Spacer (ITS) Pada nrDNA ditemukan bagian yang tersusun berulang-ulang pada genom. Masingmasing kelompok pengulangan mengandung daerah yang akan ditranskripsi (gen 18S, 5.8S, dan 26S, Internal Transcribed Spacer dan External Transcribed Spacer) dan daerah yang tidak
11

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

ditranskripsi yaitu Non-transcribed Spacer (NTS). NTS memisahkan kelompok pengulangan yang satu dengan yang lain. Skema pengulangan pada nrDNA dapat dilihat pada gambar di bawah. Pada daerah yang ditranskripsi, daerah ITS terletak di antara kedua sisi 5.8S RNA. Daerah ITS sendiri terdiri dari ITS-1, gen 5.8S, dan ITS-2 secara berurutan (Hillis et al., 1996). ITS-1 dan ITS-2 memiliki struktur yang tida ekuivalen walaupun kadang-kadang memiliki struktur yang substitusional. ITS-1 berkembang dari daerah intragenik dan ITS-2 merupakan ekspansi segmen di unit besar rDNA. Penampakan dari daerah ITS dapat termutasi dengan adanya delesi dan insersi yang menyebabkan adanya perbedaan panjang daerah ITS diantara taksa-taksa.

Daerah ITS (Sumber : Hidayat 2001) Keterangan : NTS = Non-transcribed Spacer ETS = External Transcribed Spacer ITS = Internal Transcribed Spacer & Pancoro,

12

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

BAB III METODE PENGAMATAN

3.1 Alat dan Bahan A. Alat 1. Alat Isolasi DNA dan PCR a. Mortar b. Sarung tangan c. Saringan d. Tabung Eppendorf e. Mikropipet f. Tips kuning 20-200 l g. Mesin PCR h. Tube PCR 2. Alat Elektroforesis a. Sarung tangan b. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) c. Kertas parafilm d. Seperangkat alat elektroforesis e. UV transluminator f. Kamera digital B. Bahan
13

i. Tips biru 0,2-10 l j. Vortex k. Penangas air l. Ice box m. Sentrifuge n. Oven o. Alat pendingin

Isolasi DNA, PCR, Elektroforesis DNA Stroberi


1. Bahan Isolasi DNA a. Buah strawberry segar b. Es batu c. Buffer ekstraksi d. SDS 20% e. Potassium asetat f. Chloroform:Isoamil alcohol (24:1) g. Alcohol 100 dan 70% h. TE

Kelompok 3 Tri Ekawati H, dkk

14

2.

Bahan Mix PCR a. Buffer b. dNTPs c. Primer ITS-4 d. Primer ITS-5 e. Taq poly f. DNA template g. ddH2O h. MgCl : 5 l : 0,1 l : 0,5 l : 0,5 l : 0,25 l : 1 l : 13,65 l : 4 l

3. Bahan Elektroforesis a. Agarosa 1% b. DNA marker c. Sampel DNA d. Aquades e. Larutan buffer TAE 1x

3.2 Langkah Kerja 1. Langkah Kerja Isolasi DNA

2. Langkah Kerja PCR

3. Langkah Kerja Elektroforesis

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Hasil pengamatan yang kami lakukan dapat dilihat di gambar 5 (diberi lingkar merah) yang merupakan hasil elektroforesis dari isolasi DNA buah stroberi dan buah pisang (pada kelompok lain). Pada hasil tersebut tidak di menggunakan marker atau penanda, sehingga hasil tersebut merupakan benar-benar hasil isolasi DNA buah saja.
1 2 3 4 5 6 7 8

Gambar 3.1 Hasil Elektroforesis Kelas C 2008 yang pertama, keterangan: sumur 1= kelompok 1, sumur 2= kelompok 2, sumur 3 = kelompok 3, sumur 4 = kelompok 4, sumur 5 = kelompok 5, sumur 6 = kelompok 6, sumur 7 = kontrol positif, sumur 8 = kontrol negatif. Sumber: Dokumentasi Pribadi Setelah didapatkan hasil elektroforesis pertama dilakukan perbanyakan fragmen DNA yaitu pada situs ITS melalui PCR. Kemudian dilakukan elektroforesis kembali dengan hasil sebagai berikut:

1 2 3 4 5 6 7 8

Gambar 3.2 Hasil Elektroforesis Kelas C 2008 yang kedua, keterangan: sumur 1= marker, sumur 2= kelompok 1, sumur 3 = kelompok 2, sumur 4 = kelompok 3, sumur 5 = kelompok 4, sumur 6 = kelompok 5, sumur 7 = kelompok enam, sumur 8 = kontrol negatif. Sumber: Dokumentasi Pribadi 4.2 Pembahasan 1. Isolasi DNA Pada praktikum yang dilakukan terdapat 6 kelompok, 4 diantaranya mengisolasi DNA yang berasal dari buah stroberi sedangkan 2 lainnya mengisolasi DNA yang berasal dari buah pisang. Kelompok kami yaitu kelompok 3, termasuk kedalam kelompok yang mengisolasi DNA dari buah stroberi. Jika dibandingkan hasil isolasi DNA keduanya (stroberi dan pisang) tidak terlihat adanya perbedaan dari segi jumlah. Hal tersebut disebabkan proses pengambilan sumber DNA relatif mudah dan tersedia dalam jumlah yang banyak. Berbeda dengan isolaso DNA bakteri yang sebelumnya dilakukan, dimana terdapat perbedaan jumlah karena terkait sumbernya yang berbeda-beda. Pada saat isolasi dapat terjadi beberapa faktor yang dapat menyebabkan kegagalan, diantaranya sebagai berikut: a. Pada saat pencacahan buah, buah dicacah terlalu keras, hal tersebut dapat menyebabkan smear pada saat elekroforesis. b. Selain pencacahan yang terlalu keras, faktor lain yang dapat menyebabkan smear adalah pada saat pengambilan fase cair dari fase padat, fase padat terambil. c. Ketika penambahan etanol 70% ujung tips yang digunakan menyentuh tabung

ependorf dan menyebabkan kontaminasi (pengotor). d. Pada saat isolasi harus digoyang pelan, goyangan yang diberikan terlalu keras sehingga sampel dapat rusak. Begitupun dengan yang harus digoyang keras malah digoyang pelan. e. Pada saat pemindahan isolat dari tabung Ependorf ke tabung PCR terdapat kotoran yang terambil sehingga dapat menimbulkan kontaminasi.

2. PCR Pada saat melakukan teknik PCR, sebelumnya DNA dicampurkan dengan larutan mixing. Larutan ini mengandung beberapa bahan, diantaranya sebagai berikut: ddH2O, Taq buffer, dNTPs mix, Taq Poly, ITS- 4, ITS- 5 dan DNA templatenya sendiri. Ketika melalui tahap ini beberapa kesalahan dapat terjadi, sebagai berikut: a. Terdapat sidik jari pada tabung PCR, karena tabung PCR tidak boleh kotor termasuk oleh sidik jari tangan. b. Pada saat dilakukan mixing, tips yang digunakan terkontaminasi. c. Pada saat DNA template dimasukkan tidak terambil sepenuhnya, sehingga DNA yang diamplifikasi hanya sedikit. d. Pada saat PCR dilakukan primer salah mengenali gen yang diamplifikasi yaitu yang seharusnya mengamplifikasi gen pada tumbuhan malah mengamplifikasi gen pada bakteri yang terdapat pada tumbuhan, namun hal tersebut tidak akan terjadi pada amplifikasi ITS karena gen tersebut hanya terdapat ditumbuhan.

3. Elektroforesis Elektroforesis pertama merupakan elektroforesis hasil isolasi DNA tanpa melalui proses amplifikasi terlebih dahulu melalui PCR. Sehingga dapat dikatakan tujuan dari elektroforesis pertama ini hanyalah untuk melihat berhasil atau tidaknya isolasi DNA dilakukan. Pada hasil Elektroforesis yang pertama tampak seluruh band terputus-putus atau smear. Hal ini dapat disebabkan pada saat pemisahan fase cair dan fase padat protein ikut terambil atau pada saat pencacahan buah, buah dicacah terlalu keras sehingga DNA didalamnya dapat terpotong-potong. Seperti yang diketahui bahwa struktur buah (stroberi dan pisang) lebih lembut dibandingkan dengan bagian tumbuhan yang lain, sehingga pada saat pencacahan tidak memerlukan tekanan yang keras untuk

diambil sebagai sampel isolasi DNA. Selain itu dari hasil yang diperoleh tidak terlihat jelas pita marker (penanda) begitupun dengan pita marker positif dan negatif. DNA adalah sesuatu yang tidak terlihat di dalam gel, sehingga perlu penambahan Ethidium Bromida yang pada umumnya digunakan untuk membuat pita DNA terlihat. Molekul Ethidium Bromida berinterkalasi di antara basa menyebabkan DNA berfluorosescens ketika gel dieluminasi dengan sinar ultraviolet akan tetapi proses tersebut akan sulit apabila proses destaining tidak dilakukan. Proses destaining ini dilakukan setelah proses staining yaitu dengan membilas gel agarose dengan akuades. Hal ini dimaksudkan untuk menghilangkan Etidium bromida yang terperangkap di dalam gel sehingga ketika dieluminasi oleh sinar UV hanya pita DNA yang terlihat karena DNA berikatan dengan Etidium Bromida melalui ikatan hidrogen. Hal ini berkaitan dengan hasil elektroforesis yang kedua, yang merupakan elekroforesis hasil PCR dengan penanda ITS. Pada hasil elektroforesis tersebut tidak nampak band satupun, termasuk markernya. Marker yang tidak terlihat menyebabkan sulitnya menghitung kuantitas DNA tersebut. Kuantitas DNA sampel dapat diketahui dengan membandingkan pendaran pita DNA sampel yang dianalisis dengan pendaran pita DNA penanda (marker). Tidak terlihatnya band ini dapat dikarenakan oleh beberapa sebab, namun sebab utama yang paling memungkinkan hal tersebut terjadi adalah kurangnya konsentrasi EtBr yang digunakan sehingga band-band DNA tidak muncul. Kurangnya atau tidak adanya EtBr menyebabkan band DNA tidak berfluorescent ketika disinari UV sehingga tidak terlihat. Faktor lain yang menyebabkan tidak terlihatnya band tersebut adalah gagalnya PCR yang dilakukan sehingga gen ITS yang diinginkan tidak teramflifikasi. Mengenai kegagalan pada saat PCR tersebut mungkin saja terkait dengan hasil elektroforesis yang pertama, dimana DNA yang diisolasi tampak smear atau terpotong-potong sehingga mengalami kegagalan pada saat PCR.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan Isolasi DNA buah stroberi yang dilakukan berhasil dilakukan yang ditandai adanya potongan DNA pada hasil elektroforesis pertama, meskipun pada hasil elektroforesis tersebut band-band yang dihasilkan mengalami smear yang artinya DNA yang diisolasi terpotongpotong. Hasil isolasi DNA tersebut kemudian di amplifikasi untuk menghasilkan perbanyakan gen ITS. Lalu hasil amplifikasi tersebut di elektroforesis, namun hasil elektroforesis kedua ini menunjukkan tidak adanya band satupun, baik DNA maupun marker. Hal tersebut kemungkinan besar disebabkan kurangnya konsentrasi EtBr yang digunakan sehingga DNA tidak terlihat pada saat dilihat dibawah UV. 5.2 Saran Pada saat melaksanakan praktikum isolasi DNA perlu diperhatikan dalam kegiatan ini adalah ketelitian, keterampilan, dan ketepatan. Alat yang digunakannya pun harus steril dan sesuai dengan ketentuan.

DAFTAR PUSTAKA

Boddinghaus, I., Rogall, T., Flohr, T., Blocker, H., Bottger, E.C. (1990). Detection and identification of Mycobactera by amplification of rRNA. J. Clin. Microbiol, 28: 1751-

1759. Campbell, and Reece. (2008). Biology. San Fransisco : Pearson Education, Inc. Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. (1994). Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm. Hidayat, T. dan A. Pancoro, 2001, Studi Filogenetik Molekuler Anacardiaceae Berdasarkan pada Variasi Urutan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS), Hayati, 8, 98-101az Hillis DM, Moritz C & Mable BK (1996) Molecular Systematics. 2 edition. Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc. Innis, MA, Gelfand, DH. (1990). Optimization of PCRs. PCR Protocols: A guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., New York, p 3-12 Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. (1997). Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: A guide to the technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2. Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Englewood cliffs: xvi + 779 hlm. Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor. Mullis KB, Faloona FA. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol, 155: 335350 Priyani, 2011] Rao, Sridhar. (2006). Polymerase Chain Reaction [online]. Tersedia: http://www.microrao. com/micronotes/pcr.pdf . [24 Oktober 2011] Suryanto, Dwi. (2003). Melihat Keanekaragaman Organisme Melalui Beberapa Teknik Genetika Molekuler [online]. Tersedia: http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/ 841/1/biologi-dwis.pdf. [24 Oktober 2011] Ward, D.M. (1998). A natural species concepts for procaryotes. Current Opinion in Microbiology, p 1: 271-277. Weisburg, William G., Susan M. Barns, Dale A. Pelletier & David J. Lane. (1991). 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. Journal of Bacteriology, p 697703. Nunuk. (2004). Sifat Fisik dan Kimia DNA [online]. Tersedia: Prentice Hall,

http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/825/1/biologi-nunuk2.pdf. [24 Oktober

Wolfe, S.L. (1993). Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing Company, Belmont: xviii + 1145 hlm. Zumft, W.G. (1997). Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology and Molecular Biology Review 61: 533-616.

LAMPIRAN Lampiran 3.2 Cara Kerja

Gambar 1. Proses pencacahan atau penggerusan buah stroberi

Gambar 2. Proses penambahan larutan SDS kedalam sampel

Gambar 3. Hasil sentrifugasi pertama dengan kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit, terlihat adanya pemisahan antara pelet dan supernatan

Gambar 4. Proses pengeringan pelet DNA yang dihasilkan dalam oven 50C selama 10 menit

Gambar 5. Pelet pada tabung Eppendorf yang selanjutnya siap untuk digunakan pada tahapan PCR

Gambar 6. Larutan Mix PCR dalam tabung PCR yang siap diproses

Gambar 7. Proses dimasukannya sampel untuk di elektroforesis Lampiran 4.1 Hasi Pengamatan

Gambar 8. Hasil elektroforesis pertama yang dilihat dengan menggunakan UV

Gambar 9. Hasil elektroforesis kedua yang dilihat dengan menggunakan UV

Anda mungkin juga menyukai