Anda di halaman 1dari 8

1. Sebut dan jelaskan perbedaan teknik blotting berbasis DNA, RNA, da Protein! (Brown, Terence A. 2001.

Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques. Nature Publishing Group), (Anonim.---. Analisis Tanaman Transgenik. IPB) a. Blotting berbasis DNA Teknik blotting berbasis DNA menggunakan tenik Southern Blot.Keuntungan teknik ini adalah selain dapat menunjukkan integrasi gen juga dapat mengetahui jumlah salinan DNA yang terintegrasi. Analisa Southern Blot dapat digunakan untuk mengetahui sejumlah salinan gen dan kejadian transformasi yang berbeda serta membedakan integrasi ekstra kromosomal dan kromosomal. Kelemahan metode ini adalah membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dengan kemurnian tinggi serta waktu yang lama. b. Blotting berbasis RNA Hibridasi Northern merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk identifikasi dan transkrip RNA. RNA tidak dapat berikatan secara efisien pada membrane, sehingga pada analisis northern digunakan suatu membrane spesifik dimana RNA dapat berikatan secara kovalen. Dalam analisis northern , sekuen RNA spesifik dideteksi menggunakan teknik bloting yaitu RNA ditransfer dari agarose ke membrane. Hasil bloting dianalisis melalui proses hibridisasi dengan probe RNA. RNA mempunyai bentuk utas tunggal, sehingga dapat membentuk struktur sekunder melalui pasangan basa intramolekul, sehingga harus dielektroforasi di bawah kondisi

denaturasi.Denaturasi dilakukan dengan penambahan formaldehid ke gel maupun loading buffer, atau perlakuan glyoxal dan dimethyl sulfoxide (DMSO) pada loading buffer. c. Bloting berbasis protein Dalam blotting berbasis protein teknik analysis yang digunakan adalah western blot yang merupakan metode untuk mendeteksi DNA-binding protein. Dalam metode ini protein dipisahkan dengan elektroforesis dan ditransfer ke suatu membrane sehingga protein akan terikat secara kovalen. Perinsip dasar western blot adalah identifikasi pemisahan protein tidak berlabel dengan SDS gel elektroforesis polyacrylamide (PAGE) yang didasarkan pada immunoradioaktivitasnya dengan menggunakan antibody monoclonal. Kemudian protein ditransferke membaran dan diberi perlakuan awal untuk mereduksi ikatan non spesifik dari antiserum ke membrane. Inkubasi membrane dilakukan denagn antiserum spesifik, kemudian diinkubasi dengan antibody yang berkonjugasi dengan reagen pendeteksi dan berikatan pada antiserum primer.

Setelah itu diikuti deteksi dari immunoreaksi diantara antiserum primer dan target protein spesifik. 2. Sebut dan jelaskan langkah kerja dalam Western Blotting ( Fatchiyah dkk. 2012. Buku Penuntun Praktikum TABM Fakultas MIPA. Universitas Brawijaya) a. Preparasi sample (bertindak sebagai antigen) Sampel bisa diambil dari kultur sel maupun bagian dari jaringan. Untuk jaringan yangsolid bperlu dilakukan penghancuran menggunakna blender atau homogenizer. Detergen,garam dan buffer juga bisa digunakan untuk melisiskan membrane sel. Protease danphospatase inhibitor diberikan untuk mencegah terjadinya pemecahan jaringan denganenzimnya sendiri. Perispan jaringan biasanya dilakukan apda suhu dingin untuk mencegahdegradasi protein. Untuk memisahkan komponen sel dengan organel, dilakukan sentrifugasi b. Separasi protein pada gel elektroforesis c. Transfer protein dari gel elektroforesis ke membran PVDF atau NC Transfer protein dari gel ke membran dapat dikerjakan dengan tiga cara, yaitu: simple diffusion (Gambar A), vacuum-assisted solvent flow (Gambar B), dan electrophoretic elution (Gambar C dan D). Electrophoretic elution (bisa dikerjakan dengan 2 sistem yaitu wet transfer (C) atau semi-dry transfer (D)) merupakan teknik yang banyak dipakai dan direkomendasikan. Bufer transfer dengan kekuatan ionik lemah dipakai untuk mengurangi panas karena arus. Methanol diperlukan untuk meningkatkan pengikatan protein pada membran dan mengurangi pelebaran gel selama proses transfer.

d. Bloking nonspecific binding sites pada membran Blocking dilakukan untuk mencegah antibody sekunder bereaksi dengan protein nonspesifik yang masuk pada sampel. Blocking biasanya menggunakan BSA atau susu skimtanpa lemak pada TBS. pemberian Tween 20 atau Tritonn X-100 dapat memperjelas hasilfinal dari western blot mengurangi false positif

e.

Penambahan antibodi primer, antibodi sekunder Antibodi yang dipakai harus mempunyai kespesifikan dan afinitas yang tinggi (108

1010 / M). Antibodi mungkin lebih mengenal epitop dengan konformasi protein linier pada blot, karena itulah sampel memerlukan SDS-PAGE. Antibodi yang dipakai bisa monoklonal ataupun poliklonal. Antibodi poliklonal biasanya mempunyai afinitas tinggi tetapi mengandung antibodi yang tidak spesifik yang mungkin dapat mengikat protein yang tidak diketahui pada crude protein. Pada sistem direct, hanya dibutuhkan antibodi primer yang spesifik mengikat ke protein sampel (Gambar 12). Pada sistem indirect, selain antibodi primer juga diperlukan antibodi sekunder anti-IgG yang akan melekat pada antibodi primer. Antibodi sekunder biasanya diambil dari darah kambing (goat) yang sudah diinjeksi dengan antibodi kelinci (rabbit) sehingga dinamakan goat anti-rabbit IgG (Gambar 13). Untuk visualisasi pengikatan tersebut, diperlukan label berupa enzim atau radioaktif yang dapat dilekatkan pada antibodi primer (untuk direct) atau pada antibodi sekunder (untuk indirect). Enzim seperti horseradish peroxidase (HRP) atau alkaline phosphatase (AP) sering dipakai. Alternatif lain, enzim tersebut dapat dilabel dengan biotin yang akan mengikat streptavidin (avidin) pada HRP atau AP. Sistem biotin-streptavidin lebih sensitif karena visualisasi sampel teramplifikasi. Enzim tersebut akan merubah substratnya dari tidak berwarna menjadi berwarna yang melekat (terpresipitasi) pada tempat dimana terdapat ikatan antibodi primer dengan protein atau antigennya.

Tahapan Imunobloting Menggunakan Antibodi Sekunder Berlabel Enzim (Sistem direct). (A) Proses Transfer (B) Bloking (C) Penambahan Antibodi berlabel enzim Deteksi (D) Penambahan substrat (E) Substrat dikonversi menjadi produk insoluble (P)

Immunobloting menggunakan tiga Macam Antibodi Sekunder. (A) Antibodi Berlabel HRP (B) Antibodi Berlabel Biotin dengan HRP-Streptavidin (C) HRP-protein A

f.

Deteksi atau visualisasi pengikatan antigen-antibodi Hasil visualisasi berupa pita protein dengan berbagai jenis berat molekul yang dapat

digunakan sebagai acuan identifikasi.

3. Jelaskan istilah-istilah berikut: (Emantoko, Sulistyo. 2009. Antibodi rekombinan : Perkembangan terbaru dalam teknologi antibody. Departemen Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Surabaya), ((Anam, Khairul. 2009. SDS PAGE dengan Silver Staining dan Zimogram. IPB) a. Antibodi monoclonal Monoklonal antibody merupaka jenis antibodi yang merupakan pengembangan poliklonal antibodi. Larutan monoklonal antibodi, hanya mengandung satu macam molekul antibodi, sehingga larutan ini hanya mengenali

satu macam antigen. Berdasarkan sifat ini, maka larutan monoklonal antibodi sangat spesifik ketika digunakan sebagai alat deteksi

b. SDS PAGE Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran protein secara kualitatif adalah SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis ). Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril amida dengan bisakrilamida. Kisikisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untuk memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker,2000). SDSPAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion rendah dan dapat menentukan apakah suatu protein termasuk monomeric atau oligomerik, menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit atau monomer. Penggunaan SDSPAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut (Dunn,1989). Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang mengandung merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat sehingga kompleks proteinSDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan. (Hames, 1987). Sampelsampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,2000).

c. Indirect assay Metode deteksi menggunakan 2 antibodi yaitu antibodi primer dan skunder (antibodi yang dikonjugasi enzim) yang mengikat pada tempat berbeda pada antigen atau ligand. Antigen diikatkan pada fase padat kemuadian ditambah antibodi primer selanjutnya ditambahkan antibodi kedua (Ab2) yang dilabe enzim (sebagai konjugat) dan terakhir ditambahkan substrat sehingga menghasilkan produk yang bewarna yang menunjukan jumlh dari antigen target yang berada didalam sampel.

d. Sandwich assay Metode ynag dalam aplikasinya menggunakan 3 antibodi yaitu antibodi monoclonal, antibodi primer dan antibodi skunder berlaber enzim. Antibodi diikt pada fase padat untuk mengikat antigen. Kemudian ditambah antibodi primer dan selanjutnya ditambah antibodi skunder yang berlabel enzim

e. Nitrocellulose membrane Membrane nitroselulosa adalah membrane yang digunakan dalam imobilisasi asam nukleat pada uji northerm blots dan southerm blots, selain itu nitroselulosa banyak digunakan dalam mendukung kegiatan tes diagnostic dimana terjadi ikatan antigen-antibodi, yaitu pada tes kehamilan, tes U-albumin dan CRP, hal ini karena glisin dan ion klorida membuat transfor protein lebih efisien

4. Beriakan contoh hasil Western Blotting dan intrepretasikan hasil tersebut (Winarsih, dkk. 2011. Reaksi Silang antara Antibodi AdhO36 Salmonella Typhi dengan Outer Membrane Protein Vibrio cholerae Menggunakan Metode Western Blotting. Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya) Reaksi Silang antara Antibodi AdhO36 Salmonella Typhi dengan Outer Membrane Protein Vibrio cholerae Menggunakan Metode Western Blotting Sri Winarsih* , Sanarto Santoso* , Nyoman Artha Megayasa* Program Studi Pendidikan Dokter FKUB

Telah dilaporkan bahwa Salmonella Typhi memiliki antibodi AdhO36 yang memberikan protektivitas yang bermakna dalam menghambat perlekatan Salmonella Typhi pada usus mencit. Vibrio cholerae adalah agen penyebab infeksi usus akut yang dikenal sebagai kolera. Vibrio cholerae dilaporkan memiliki Outer Membrane Protein (OMP) dengan berat molekul yang mirip dengan protein AdhO36. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya reaksi silang antara antibody AdhO36 Salmonella Typhi dengan OMP Vibrio cholerae. Penelitian ini menggunakan studi explorative laboratorium dengan cara westernblotting. Hasil western Nlot yang diperoleh ditunjukkan oleh gambar berikut:

Dari hasil western blot diatas menunjukkan bahwa terdapat 3 pita protein dengan berat molekul sekitar 107kDa, 74kDa dan 38kDa dari OMP Vibrio cholerae yang bereaksi dengan antibodi AdhO36. Kesimpulan dari penelitian ini adalah OMP Vibrio cholerae telah terbukti untuk merespon antibodi AdhO36 Salmonella Typhi.

IMMUNOBLOTTING

Disusun oleh B-2011 : Septian Vidya Pangastuti 115130101111041

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013