Anda di halaman 1dari 1

Pembahasan awal isolasi DNA plasmid

Tujuan praktikum kali ini adalah memahami metode isolasi DNA plasmid dari sel prokariot berupa bakteri Gram negatif menggunakan GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit. DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Sebelum melakukan percobaan, terlebih dahulu disiapkan bahan-bahan yang akan digunakan. Diantaranya bakteri Escherichia coli yang telah disisipkan plasmid pETDuet yang resisten terhadap antibiotik Ampisilin , ddH2O steril yang digunakan pada tahap pencucian, dan yang terakhir adalah GeneJETTM Plasmid Miniprep Kit (Fermentas Life Sciences) : Resuspension Solution, Lysis Solution, Neutralization Solution, Wash solution, Elution Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5), GeneJETTM Spin Columns dan tabung kolektor 2 mL. Tahapan pertama adalah adalah penyiapan suspensi bakteri. Sebanyak 1 koloni bakteri Escherichia coli yang telah disisipkan plasmid pETDuet yang resisten terhadap antibiotik Ampicillin diambil dari plate biakan yang sudah berumur 12-16 jam ,kemudian diinokulasikan kedalam 5 ml medium LB yang telah ditambahkan antibiotik ampisilin 5 L dan air steril. Biakan diinkubasi selama 12-16 jam pada suhu 37 oC dengan pengocokan 200250 rpm. Setelah itu, sebanyak 1,5 mL suspensi dimasukkan ke dalam 2 buah tabung Eppendorf 1,5 mL lalu disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm atau sama dengan 6.800 g selama 2 menit, lalu supernatant yang terpisah dibuang. Biakan bakteri kemudian ditambahkan kembali ke dalam tabung Eppendorf 1,5 mL sampai suspensinya habis dan disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm atau sama dengan 6.800 g selama 2 menit. Tujuan sentrifugasi ini adalah untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul. Setelah itu dilakukan tahap pencucian pelet, yaitu dengan cara menambahkan ddH2O steril diatas pelet sebanyak 1 mL dan kemudian dilakukan pipetting sampai pelet teresuspensi dengan air. Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan putaran 6.800 g selama 1 menit. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak 2 kali dengan menjadikan pelet berada dalam satu tabung Eppendorf.