Microbiologie Medical

Lucrari Practice

1. Elemente legate de controlul calitii n laboratorul de bacteriologie / microbiologie

Cutoatecacestenoiuninuparafideutilitateimediat,trebuiesavemnvederefaptulc elesuntinclusentrunuldintrecelemaiimportantecapitolealeactivitii,noricetipdelaboratori nunumainlaboratoruldemicrobiologie. Defapt,cuctsuntnelesemaidetimpuriu,cuattpotfimaiutilendezvoltareaviitoarea oricruimedic,caremaidevremesaumaitrziuvatrebuisneleagimportanalaboratoruluiclinic ngeneralirespectivalaboratoruluidemicrobiologienparticular,ncolaborarecucelelalte specialitimedicale.Amdecissintroducemacesteelementenprimulcapitolalmanualuluide lucrripractice.Considermnecesarparcurgereaacestornoiunidectretoicolegiiimplicain diferiteleactivitidesfuratensistemulsanitar.Recomandmcitireaialtormaterialeredactate peaceasttem,dinliteraturamedicalromneascsauinternaional. noricelaborator,inclusivnlaboratoruldemicrobiologiealUMFCarolDavila,estenecesar stabilireaunorresponsabiliti.Chiarincazulncareactivitateapracticserezumlaoseriede demonstraiiiprezentareaunoranumiteaspectepentrutineriiaflainstagiu,elementelelegatede controlulcalitiinutrebuiesfieignorate. Atuncicndestevorbadeunlaboratorclinicdemicrobiologie,iarderezultateleobinutepoate depindeevoluiaiuneorichiarviaaunuipacient,controlulinterndecalitateintrn responsabilitateaefuluidelaborator,caretrebuiessupervizeze(directsauprindelegarede responsabilitate)toateactivitiledesfurateiscontrasemnezebuletineledeanaliz. 1.ntrunsistemmedicalbinepuslapunct,buletineledeanaliznesemnate,semnate indescifrabil,verificatenumaidectrepersonalulmedicalcupregtiremedieetc.,trebuiesdispar isfienlocuitedebuletinedeanalizredactateduptoaterigorile,incluzndsupervizarea menionatmaisus.

2.nfiecarelaboratortrebuiesexisteisfieaccesibiloricruimembrualpersonalului delaboratorundocumentscris,fiesubformaunuimanualtehnic,fiesubformaunuidosarncare sfieincluseoseriedemateriale,dupcumurmeaz: Untabelnominalalpersonalului,datetehnicedesprefiecaremembruprecumidate carespermitcontactareauneianumepersoanencazdenecesitate Unregulamentdeordineinterioar,inclusivnormeledeprotecieamunciiinormelede securitatemicrobiologic,precumidescriereasarcinilorfiecruimembrualpersonaluluide laborator Olistcuprinzndtoateformulareleutilizatenlaboratorprecumidescriereafiecrui formularnparte,inclusivrecomandriprivindmoduldecompletarealformularelor Unplanallaboratorului Olistaanalizelorcarepotfiefectuatenlaborator Tehniciledeidentificareamicroorganismelorizolate,porninddelanormelederecoltare, conservareitransport(pentrufiecaretipdeprodusnparte),testeleutilizate,listamediilorde culturiareactivilorutilizai,inclusivmoduldeprepararealacestora. nmodideal(pentrucdeocamdatacesterecomandrinusuntaplicatentoatelaboratoarele dinaranoastr)artrebuicamanualul(dosarultehnic)sfierevizuiticompletatperiodicis includnormelemetodologiceredactateitransmisedectreinstituiacareseocupde coordonareaicontrolulactivitiidesfuratensistemullaboratoarelordemicrobiologiedin Romniaprecumiactelenormative(recomandri,ordinedeministru,ordonanedeguvern,legi etc)aprutenlegturcuactivitateadelaborator. Celemenionatemaisussuntvalabilepentrulaboratoareledemicrobiologie,darnparte,sepot aplicaoricruitipdelaboratorclinic. 3.nmodnecesar,periodic,ncadrullaboratoruluitrebuieorganizatescurtentlniricare spermitschimbuldeopiniintremembriipersonaluluidelaborator,prezentareaunorreferate alctuitedupmaterialedespecialitateaprutenliteraturanaionalsauinternaional,discutarea unoraspectelegislativelegatedeactivitateadelaboratoretc. 4.Omodalitateobiectivacontroluluiinterndecalitateestereprezentatdesolicitarea (dectreefuldelaborator,carevaefectuaiverificarearezultatelor)realizriiunortesteavndla dispoziieprobeoarbe,rezultatulcorectfiindcunoscutnumaidectrecelcareapregtitproba respectivirespectivdectreefuldelaborator. 5.nprotocoluldelucru,pentrufiecaretestnparte,estenotificatutilizareaunuicontrol pozitivirespectivaunuicontrolnegativ(spreexempluncazultestuluisusceptibilitiila bacitracin,controlulpozitivvafireprezentatdeotulpindeStreptococcuspyogenesiarcontrolul negativvafireprezentatdeotulpindeStreptococcusagalactiae),astfelputndusevalida rezultateleobinute. nmodcomplementar,controluldecalitateexternartrebuiscondiionezeautorizaia eliberatpentrufuncionareaoricruilaboratordemicrobiologieclinic,attnsistemulpubliccti ncelprivat.Dinpunctdevedereoperaional,fiecarelaboratorartrebuisprimeasc: unnumrdecod,careestecunoscutdelaboratorulrespectividectreinstituiacare organizeazcontrolulexterndecalitate periodic,unnumrdeprobe,alcrorrezultatvafiverificat(pentruexamene bacteriologice,micologiceiserologice)

formularestandardizatepentruretransmiterearezultatelorobinute. ndeplinirearecomandrilormenionatemaisusvaconduceimplicitlaproteciapacienilor, identificareaunoranumiteerori,compararearezultatelorlanivelnaional,posibilitateacolaborriila nivelinternaional,realizareauneistandardizrinmicrobiologiaclinicromneasc,creterea ncrederiituturorpartenerilordinsistemulsanitar. Identificareaunormodalitidelucrunecorespunztoareartrebuisconduclaretragerea autorizaieidefuncionarecureacordareaacesteianumaidupndeplinireatuturorcriteriilor necesareuneiactivitiutilediagnosticuluiicaresnupunnpericolsntateasauviaa pacienilor. Controlulcalitiilaniveluloricruilaboratorvaatingeeficienamaximcucondiia uneicolaborrintreclinicilaborator.Suntncpreafrecventesituaiilencaresolicitarea unuiexamendelaboratorestefcutfrresponsabilitate,frcolegialitateifraaveasuficient nvedereinteresulpacientului.Attpersonalulmedicaldinlaboratorcticeldinclinictrebuies acionezenstrnscolaborare.Numainacestcazrezultateleobinutepotficorectinterpretate, eventualelerezultatecareparincorectepotfianalizateicorelatecusituaiaconcret,particulara unuianumepacient,iarncazulpersisteneisuspiciuniiuneieroridelaboratorsepoatesolicitan cunotindecauzrepetareauneianalizesausepoaterealizaprelevareaunuinouprodus patologicsauauneiprobedesngepentruobinereaseruluidecercetat. nvedereastabiliriiuneibunecolaborritrebuiesexisteocomunicarepermanentntre colegiicareidesfoaractivitateanclinicinlaborator. Trebuiesrecunoatemcdinpcatebunacolaborareicomunicarentreverigilesistemului desntatereprezintncundezideratneatinsnaranoastr,curelativpuineexcepii.Pornind delabuletinuldeanalizidocumenteletehnicecaretrebuiesfiedisponibileattpentrulaborator ctipentruclinic,continundcuscrisorilemetodologicecareaudevenitdincencemairaren ultimii1015anitrebuiegsitecelemaibunesoluiidecomunicarecolegialitiinific.Este datoriamanageruluiinstituieimedicaleca,mpreuncuefullaboratoruluiiefiiseciilorclinice, sfacilitezeorganizareaunorntlniriperiodicentrecolegi. Trebuiediscutateiagreatenmodcolegialcriteriilecarepotconduce,spreexemplu,la respingereaunorprobe.Trebuiedesfiinatmodalitateadelucruncareseacceptpentrulucrun laboratororiceprob,indiferentdemodulncareafostrecoltat,transportatiindiferentdaceste nsoit(saunu)deunbuletincaresolicitoanumitexaminareicareartrebuismenionezeo seriededatestrictnecesare.nlocsfieprelucrateprobefrcalitate,carenuaucumsconduc larealizareaunuidiagnosticmicrobiologiccorespunztoriutilpacientuluicareprezintoinfecie deetiologieprobabilmicrobian,estedepreferatcaacesteprobesfierespinseissesoliciteo nourecoltare,corespunztoarecalitativicantitativ. naintedeancheiaaceastdestuldesumarprezentare,dorimssubliniemncodatc acestenoiuniartrebuicunoscuteiaplicatedeopotrivnsistemulpubliciprivat. Controlulinterniexterndecalitatetrebuiesreprezinteoprioritateabsolutpentru sistemulnaionaldesntateiarelementelelegatedeacestaartrebuisfiecunoscutencdin perioadadepregtiredebazaoricruimedic,biologsauasistentmedical.

2. Elemente legate de conduita n laboratorul de bacteriologie / microbiologie. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie.
intaactivitiinlaboratoruldebacteriologie/micologiearputeafidefinitfoartepescurtdrept stabilireatratamentuluicaretrebuieurmatncazulunuipacientcareprezintoboalinfecioasde etiologiebacterian/fungic.Defaptlucrurilesuntmultmaicomplicate,dateledelaboratornupot fiinterpretatenlipsauneipregtiriserioaseattdinpunctdevedereteoreticctipractic,nlipsa uneiactivitisusinutenperioadadepregtirecaredureazmaimulianiidefaptcontinutoat viaa. Ceeacetrebuiesfiensfoarteclarncdelanceputestec,frrespectareaunorprincipii, ncondiiileefecturiisauinterpretriimecaniceaunortesteetc.,diagnosticuldelaborator microbiologiccorectdevineimposibil. nvedereaatingeriiscopului,nlaboratoruldebacteriologiesevorefectuatehnicilenecesare: stabiliriiprezeneisaudovediriiabseneiunoranumitebacteriilanivelulunuianumit substrat studieriibacteriilorizolatepentruidentificareagenului,grupului,speciei,tipului(delacaz lacaz)avndlabazoseriedecaracterealebacteriilor,precum caracterelemorfotinctoriale caractereledecultur caracterelebiochimice(pigmentogeneza,sintezaaltorfactoricarepotfievideniai macroscopic,sintezaunorenzime,sintezadebacteriocine,capacitateadeafermentaunanumit

substrat,capacitateadeafolosiunanumitsubstratdreptunicsursdecarbonetc) caractereleantigenice(utilizndtehnicidindomeniulimunologiei) caractereledepatogenitate sensibilitateafadebacteriofagi caracterelegatedesintezaanumitormetaboliisaustructurimoleculareidentificabile spreex.printehnicidecromatografie caracterelegeneticeetc stabiliriifaptuluicbacteriaizolatesteimplicatnprocesulinfeciosrespectiv stabiliriisensibilitiilaantibioticeichimioterapice monitorizriievoluieisubtratament(dovedireaeficieneitratamentuluiantibacterianales) identificriicontaminriidelaborator depistriipurttorilordegermenietc. Chiardaccelemenionatemaisusparcomplicate,elereprezintosimplificarenraportcu complexitateaactivitiidinlaboratoruldebacteriologie. Pentrundeplinireaobiectivelor,laboratoruldebacteriologietrebuieastfelconceputnct condiiiledelucrusfieoptime.nplus,trebuiesavemnvederecnmomentulefecturiioricrei tehnicidelaborator,estenecesarsfieasiguratproteciapersonaluluidelaboratorprecumi prevenireacontaminriiprobelordelucru.Toateelementelenecesaretrebuiesaparscrise manualultehnicmenionatncadrulcapitoluluiprecedent. Cldirealaboratoruluidebacteriologiemedicaltrebuiesasigure,pectposibil,prevenirea expuneriilapraf,curenideaer,sfieluminoasinmsuraposibilitilorspaiiledelucrusfie orientateastfelnctsprevinincidenadirectarazelorsolare(avndnvedereefectulbactericid alradiaiilorUVacestelementestedemaximimportannlaboratoruldemycobacteriologie). Fiecarencperealaboratoruluidebacteriologietrebuiesaibodestinaieprecisiarplanul laboratoruluinansamblutrebuiesprevadunanumitflux,pectposibilntrunsensunicn vedereapreveniriicontaminriipreparatelordelaboratorirespectivprevenireantlniriidintre materialelecontaminateimaterialelesterile. Laboratoruldebacteriologiemedicalincludencperi(spaii)nvedereadesfurrii corespunztoareaurmtoareloractiviti: recepionareaprobelorrecoltatenafaralaboratorului recoltareaprobelornlaborator prelucrareaprobelornvedereacultivrii,identificriibacteriilorimplicateetiologic,prin diferiteletehnicibacteriologice realizareadiferitelortehniciimunologiceutilendiagnosticulbacteriologicsauimunologic pregtireamaterialelornecesarenlaborator sticlrie alteinstrumentedelaborator reactivi mediideculturetc depozitareamaterialelornecesarenlaborator splareamaterialelornaintedesterilizareetc.

nafardecelemenionatemaisus,nlaboratoruldebacteriologiemaiexistspaiidestinate activitiloradministrative(birouri),vestiare,grupurisanitareetc. ncazulunorlaboratoarespecializate(deex.studiulacizilorgraiprintehnicidecromatografie, studiulcaracteristicilorbacterieneprintehnicidebiologiemolecularetc.),existanumite particularitinplanificareaidistribuireaspaiilorfuncionaledinlaboratorelementeletehnice legatedeacestestructurisuntprezentatendiferitemanualetehnicecarepotficonsultatedectre ceiinteresai. ncperile,spaiile,mobilieruldinlaboratoruldebacteriologievorficonstruitenaafelncts permitrealizareauneicureniiidezinfeciilacelmainaltnivelncazulacestuitipde laboratoaresepoatevorbidenecesitateaatingeriiperfeciunii.Vafiacordattoatateniapentruca laboratorulsfieorganizatnvederea realizriiscopuluimenionatmaisusprintehnicileenumerate preveniriicontaminriiprobelordelaborator preveniriirspndiriigermenilornmediulambiant preveniriiinfeciilordelaborator. naintedeancheiaprezentareaprincipalelorncperi(spaii)dinlaboratoruldebacteriologie, dorimsmenionmc: structuraprezentatpentrulaboratoruldebacteriologienudifernmodesenialde structuraunuilaboratordemicrobiologiengeneral nstructuralaboratoruluiestededoritsfieincluse(nmsuraposibilitilorinfuncie denivelullaboratorului,deexempluncazulunuilaboratordespitaluniversitar)spaiincaresse poatdesfuraactivitidenvmntipregtireteoreticipractic,spaiincarearputeaavea locidiferitentlniritehnicentremembriipersonaluluidelaborator laboratorultrebuiesfielegatfuncionaldeclinic. Dateleprivindfuncionarealaboratoarelorcareefectueazanalizemedicalesuntinclusen Ordinulministruluisntiinr.119/2004,normativaducelaziOrdinulministruluisntiii familieinr.609/2002,precedatdeOrdinulministruluisntiinr.915/2000.Acesteacte normativetrebuierevizuiteiadaptateperiodic.

Normedeprotecieamunciinlaboratorul demicrobiologie
nlaboratoruldemicrobiologieselucreazcumicroorganismepotenialpatogenesaudovedite afipatogene,caresepotidentificandiferiteprodusepatologice(ex.snge,materiifecale,urin etc)sauaufostizolatenculturilanivelullaboratorului.Existiposibilitatecaunanumitlaborator sprimeascspreidentificareculturiiizolatedelaunlaboratorcuunniveldecompeteninferior. Chiardacactivitateasedesfoarntrunlaboratordedicatlucrrilorpracticei demonstraiilorfcutesubsupraveghereaunuicadrudidacticpentrustudenisautinerimedici rezideni,existoseriederegulicaretrebuieaplicatecustricteenvedereaeliminriiriscurilorde contaminare: 1.Estestrictinterzisaccesulpersoanelorstrinenlaborator.Tineriimedicisauviitori

medicivoraccedenlaboratorivorparticipaladesfurarealucrrilorpracticenumaidup audiereainsuirea(doveditprinsemnturapeunprocesverbalpregtitnacestsens)regulilor deprotecieamuncii. 2.Toateproduselebiologicevorficonsideratecapotenialinfectante. 3.Esteobligatoriepurtateaechipamentuluideproteciehalatuldeproteciereprezint nivelulminimacceptat.Halatultrebuiesfiecuraticorectncheiat.nanumitesituaiiseva recomandautilizareamnuilor,ochelarilor,mtii,bonetei,orului,nclminteideprotecie.Se recomandcaechipamentuldeproteciesfiepstratseparatdehaineleutilizatenexterior. 4.NusevorpurtamnuidelatexnmomentulmanipulriibeculuiBunsen. 5.Mncatulibutulsuntinterzisensaladelucrripracticedemicrobiologie.Fumatul esteinterzis,conformlegii,noriceinstituiemedicaldinRomniaicuattmaimultnueste acceptatntrunlaboratordemicrobiologie. 6.Seinterziceaplicareadecosmetice,lcuireaunghiilor,purtareadeunghiifalse, manipularealentilelordecontactetc. 7.Esteinterzisintroducereanguraoricruiobiect. 8.Pipetareacuguraestestrictinterzis.nvedereapipetriisevorutilizadispozitivede pipetareadecvate. 9.Nuestepermisdepozitareaobiectelordeuzpersonalpemasadelucru(haine,geni, serviete,caieteetc).Serecomandcahainelesfielsatelagarderobsauntrunspaiuspecial amenajat. 10.Manipulareamaterialuluicontaminatsevarealizacumaximprecauiepentruevitarea rspndiriimicroorganismelor.ActivitilesevordesfuranvecintateabeculuiBunsenaprins. 11.nsmnrileseefectueazlaflacr.Sevorflambaguriletuturorrecipientelor(tub, eprubet,flacondesticletc)utilizate,attladeschiderectilanchidere. 12.Ansabacteriologicsevasterilizalarou,attbuclactifirulansei(iarportansaseva flamba)nainteidupfolosire.Atuncicndsaterminatlucrulcuansancrcatcuprodus patologic,nvedereasterilizriibuclaanseivafiintrodusiniiallabazaflcriiundetemperatura estemaisczut,pentruaprevenimprocareacuparticuleinfecioase.Atuncicndselucreaz ntrunlaboratordeanalizesevorluapreacauiisuplimentare. 13.Sevorutilizaansebacteriologicecorecticompletnchiseicuobuclcudiametrulmai micde3milimetripentruaseevitadescrcareaspontan.Nusevorfacemicribruteatunci cndansaestencrcatcuproduspatologic.Sevorevitagesturileampleisevamenineun permanentcontrolasupramicrilorefectuatenlaboratoruldemicrobiologie. 14.Recomandmcatoateactivitilecarepotfiefectuatenlaboratorsfienscriseidetaliate nmanualultehnicallaboratorului.naintedencepereaoricruitestsauaoricreimanevre,trebuie savemnmintetoipaiipecareurmeazsifacem(conformprotocoluluidelucru)astfelnct savemuncontrolmentalpermanentalfiecreimanevrepecareurmeazsoexecutm. 15.Nuestepermisfugainicimersulrapidprinlaborator. 16.Pipetelecontaminate(pipetePasteur,pipetegradateetc)nusevordecontaminalaflacr, civorfiintroduse(evitndproducereadestropipotenialinfectani)nflaconulcudezinfectant (lichiduldezinfectanttrebuiesdepeascnivelulpnlacareaajunsprodusulcontaminant), undevorfimeninutepentrucirca24ore(nfunciedesubstanadezinfectantutilizat).Flaconulcu amestecdezinfectantesteobligatoriu.Totnamesteculdezinfectantvorfiintrodusecuaceleai

precauiilameledesticlfolosite. 17.Toatecelelalteobiectecontaminate(exceptndanselebacteriologice,pipeteleilamele) sevorintroducelafinalulactivitiipractice,cuprecauie,ntrunrecipient(ex.ogleatdinmetal, cucapac)carevafiautoclavat. 18.Sevarestrngepectposibilutilizareaobiectelorascuite,tietoareineptoare. 19.Pentrundeprtareaobiectelorascuitedeunicntrebuinarerecomandmutilizareade cutiisigurencareacesteasfiecolectate.Acestecutiivorfiulteriorincinerate. 20.ncazulncarearelocaccidentalcontaminareauneisuprafeecuprodusepatologicesau culturi,ncazulncareacestevenimentsedatoreazunuitnrmedicsauviitormedicaflatn pregtire,nprimulrndtrebuieanunatfrntrziereasistentulresponsabilcupregtirea respectiveigrupedelucru.Serecomandacoperireacuopnzasuprafeeicontaminatedup caresetoarnosoluiedezinfectantcaresevameninepelocnfunciederecomandrile productorului,darnumaipuinde30minute.Ulteriorsepoatetrece(dupcaz)lacurirealocului. 21.Lasfrituluilucruluinlaboratorsevorsplaminilecuapispun. 22.nafardeacestemsuri,sevoraveanvederetoatecelenecesareevitriioricruirisc carearputearezultanurmautilizriiunorsubstanecaustice,manipulriidiferiteloraparate electriceetc. nceeacepriveteutilizareacabinetelordesiguranbiologic(hote,boxe,nie),vorfiprezentate unelenoiunincapitolulal3lea. Respectareaacestornormedeprotecieestestrictnecesar. TrebuiesavemnvedereifaptulcrecomandrileidirectiveleUniuniiEuropenendomeniul biosecuritiiaufostadoptatedectrearanoastr.

3. Date privind echipamentul i aparatura utilizate n laboratorul de microbiologie

ndiferitelencperi(spaii)alelaboratoruluidemicrobiologieputemntlnioseriede echipamente,elementedebirotic,diferiteaparate. Spreexemplu,nncpereaundearelocrecepionareaproduselorpatologicetrebuiesexiste registresauunsistemcomputerizatdenregistrareadatelor(nregistrareacorectadatelorn sistemulsanitartrebuiesreprezinteoprioritatepentruoricaredintreunitilemedicaleindiferent desistemulpublicsauprivat),stativepentrutuburi,eprubete,flacoaneetc,unincubatorla37C,un frigideretc.nloculundesedesfoardiagnosticulmicrobiologictrebuiesexistelandemn ansebacteriologice,diferitepipete,pense,baghetedelemn,tampoanedediferitedimensiuni,becul Bunsen,microscopul,lupa,lameilamele,trusedecolorare,centrifuga,balana,baiadeap,un incubator,unfrigider,plciPetri,eprubete,containerepentrumaterialulcontaminat,cabinetulde siguranbiologicetc. nceleceurmeazvorfienumerateopartedintreustensileleiaparatelecaresepotgsin

laboratoruldemicrobiologie. 1.Microscoape,lupeitrusedecolorani: microscopoptic(cmpluminos) altetipuridemicroscop,carepotfiutilizatencamerobscur(microscopcufond ntunecat,microscopcucontrastdefaz,microscopcufluorescen)nsituaiiparticularede diagnostic trusepentrucoloraiiuzuale(albastrudemetilen,Gram,ZiehlNeelsenetc)ispeciale lupdemnilupstereoscopic(pentrustudiereamorfologieicoloniilor) 2.Cabinetedesiguranbiologic(incinte,boxe,nie): cabinetuldeclasI,ncareaerulcuratantreneazaerosoliiproduidinsprepersoana carelucreazicareseaflnlaboratorctremediulexterior,printrunfiltrucarereinemajoritatea particulelorpericuloase cabinetuldeclasII,ncareaerulcuratptrundefiltrat,esterecirculatprinfiltreastfel nctsuprafaadelucruvinencontactcuaersterilnboxnusevorintroducesursedecldur cabinetuldeclasIIIestecompletnchismediculiintroduceminilenzonadelucru prinmnuifixateetanlaaparataerulesteattadmisctievacuatprinfiltre 3.Termostateibideapsaudenisip: termostatereglateladiferitetemperaturi,nfunciedeprofilullaboratoruluiia germenilorstudiai(ex.3537Cpentrubacterii,28Cpentrufungietc) cameretermostat bideapdediferitemrimi(ex.pentrudecomplementareaserurilorla56C) bidenisip(ex.pentrucoagulareaunormediidecultur/Loeffleretc) 4.Frigidere: frigideredediferitedimensiuni,cutemperaturainterioarde+4C/estedepreferat utilizareaunuifrigiderseparatdecongelator,deoarecefrigiderulsedeschidemaifrecventiaceasta vainfluenatemperaturadincompartimentulcongelator camerefrigorifice congelatoarede20Cide70C(pentruanumitelaboratoarespecializate) 5.Centrifugiibalane: nmodcurentsuntutilizatecentrifugicuvitezade3000g,preferabilcurotororizontal (pentrudiminuareacantitiideaerosoli)napropiereacentrifugiisevaplasaobalan,pentru echilibrareatuburilor centrifugicuvitezesuperioare,nlaboratoarespecializate(mycobacteriologie) centrifugicuvitezesuperioareisistemdercire(biologiemolecular) balanetehnice(pentrumediidecultur,reactivi,soluiinvolumemari) balanefarmaceutice(pentrusoluiidecolorani,altesoluiinvolumemici) balananalitic(pentrureactivincantitifoartemici) balanelectronic(pentrubiologiemolecular) 6.Mojare,agitatoare,dispozitivedetriturareaesuturilor 7.Aparatepentrudistilareaidemineralizareaapei 8.AparatepentrustabilireapHului 9.Fotometresaucolorimetre 10.Distribuitoarepentrumediidecultur

11.Aparateidispozitivepentrusterilizareidezinfecie: incinerator(deregul,nvedereaincinerriisencheieuncontractdeprestriserviciicu ofirmdeprofil) etuv(pupinel,cuptorPasteur) autoclav filtredediferitetipuri lmpicuUVetc 12.Containerepentrumaterialulcontaminat: gleidemetalcucapac sacidinmaterialplastic sacirezistenilatemperaturileatinsenautoclav borcanecusoluiidezinfectanteetc 13.Inventardesticlrie: eprubetedediferitedimensiuni(ex.12/120mm,16/160mm) tuburidecentrifug eavdesticlpentruconfecionareadepipetePasteur pipetegradatedediferitedimensiuni baghetedesticl baloane flacoane(ex.Erlenmeyer) pahare(ex.Berzelius) exsicatoare cilindriigradaidediferitedimensiuni plciPetri lameilamelepentrumicroscopieetc 14.Inventardematerialplasticicauciuc: dispozitiveadaptatelapipetepentruaeliminapipetareacugura tuburidecentrifug containerepentruproduselepatologice plciPetri ansecalibrateetc 15.Altearticoledelaborator:trepiede,stelajedelemnsaumetal,couridesrm,sitede azbest,becuriBunsen,casolete,foarfeci,bisturie,pense,sonde,seringi,ansebacteriologice(cu bucl,ansefir,dinplatinsaunichelin),tampoanediferite,tijecutamponialteinstrumente pentrurecoltareaproduselorpatologice,termometreetc.

Francercasmenionmtoatedispozitivele,echipamentele,aparatelentlnitentrun laboratordemicrobiologieamconsideratcaceastlistareesteutilattpentrumediculsau biologulcarelucreaznlaboratorctipentruviitorulmedic,indiferentdespecialitate.

4. Metode de dezinfecie i sterilizare utilizate n laboratorul de microbiologie

Definiiidebaz
Sterilizareareprezintdistrugereasaundeprtareatuturormicroorganismelorpatogenesau nepatogene,formevegetativesauspori,depeosuprafasaudintrunmediu(lichidsausolid). Septicnseamncontaminatcumicrobipatogenisauinfectat(deexempluinfeciauneiplgi). Asepticnseamnlipsitdemicrobi,indiferentdacmicrobiisuntpatogenisaunepatogeni. Asepsiareprezintansambluldemetodeprincareevitmcontaminareamediuluiambiantcu germenimicrobienisauprincareputemmeninesterilitateaesuturilor,mediilordecultur, medicamentelorinjectabileetc. Dezinfeciareprezintdistrugereaformelorvegetativemicrobiene(uneoriiasporilor)din anumitemedii(lichide,solide)saudepesuprafee.Serealizeazcuajutorulunoragenifizicisau cuajutorulsubstanelordezinfectante. Antisepsiareprezintnlturareasaudistrugereaformelorvegetativemicrobienedepe tegumente,mucoasesaudinplgi.Serealizeazcuajutorulsubstanelorantiseptice.

Sterilizarea
Toatematerialeleutilizatenlaboratoruldemicrobiologietrebuiesfiesterilenaintede utilizare.Existomarediversitatedematerialecaretrebuiesterilizate,astfelnctimetodelede sterilizaresuntdestuldevariate,dupcumurmeaz: 1.Metodedesterilizareprincldur cldurauscat clduraumed 2.Metodedesterilizareprinfiltrare 3.Metodedesterilizareutilizndradiaiile 4.Metodechimicedesterilizare. Metodeledesterilizarecareutilizeazradiaiile(cuexcepiaradiaiilorultraviolete)imetodele chimicedesterilizare(ex.cuoxiddeetilen)suntutilizaterareorinlaboratoruldemicrobiologie.

Sterilizareavafintotdeaunaprecedatdepregtireamaterialuluicareurmeazsfiesterilizat: splare,uscare,ambalare/ncazulmaterialelorcurate,necontaminate autoclavare,splare,uscare,ambalare/ncazulmaterialelorcontaminaterefolosibile Existoseriedemetodepentruacontrolaeficienasterilizrii,prinindicatoriifizici(ex. termometru),chimici(ex.floaredesulf,tiouree)saubiologici(ex.sporideBacillus stearotermophilus).

Sterilizareaprinclduruscat
Sterilizareaprinclduruscatarecamecanismoxidareasaucarbonizareastructurilor bacteriene. 1.Sterilizareaprinnclzirelaincandescen(larou)reprezintintroducereaimeninerea nflacrabeculuiBunsenpnlanroire,petoatlungimea,aobiectuluicareurmeazafi sterilizat.Sepoateaplicapentruansabacteriologic(cubuclsaufir)saupentruspatul. Flambareareprezinttrecereaprinflacr(dectevaori)aunuiobiect,fraseatinge temperaturadeincandescen.Flambareaseaplicpentruportans,gtulunuirecipientdesticl (tub,eprubet,flaconetc)saupentrucapilarulpipetelorPasteur. 2.Sterilizareacuaercaldserealizeaznetuv(pupinel,cuptorPasteur).Etuvaesteocutie metaliccupereidubli.Cuajutorulunorrezisteneelectriceiaunuitermostatseobineimenine temperaturapentrusterilizare.Uniformizareatemperaturiininteriorulaparatuluiesterealizatcu ajutorulunuisistemdeventilaie. Pentrumajoritateamaterialelorcareurmeazafisterilizate,temperaturadinetuvtrebuies ating180C,pentruoduratde1or.nunelesituaiitimpuldesterilizarepoatedepi60de minute(ex.pentruambalajededimensiunimari). Sterilizareacuaercaldesteindicatpentruobiectedesticl,obiectedeporelan,pulberiinerte itermostabile,uleiurianhidre,instrumentarchirurgical(pentruinstrumentarulmetalicestede menionatfaptulcrepetareasterilizrii,ntimp,conduceladeclireaoelului)etc.Nusevor sterilizanetuvsoluiileapoase,obiecteledeplastic,obiecteledecauciuc,vat,bumbac,fibr sintetic,altematerialetermolabile,materialecontaminatedinlaborator. 3.Incinerareareprezintardereapnlaobinereadecenu.Existanumiteregulistricte privindincinerarea,pentruaprevenidiferiteletipuridepoluare. ncazulspitalelor,demulteorisuntprevzuteincineratoarenstructuraunitiisanitare respective.Deregul,nvedereaincinerriisencheieuncontractdeprestriserviciicuofirmde profil.Dinpunctuldevedereallaboratoruluidemicrobiologiearputeafisupuseincinerriimateriale deunicfolosindinplastic,reziduuriorganicesolide,gunoi,cadavreleanimalelordeexperien etc.

Sterilizareaprincldurumed
Sterilizareaprincldurumedesteceamaieficientmetoddesterilizareiareca mecanismcoagulareaproteineloridegradareaenzimelor. 1.Autoclavareaesteesenialattpentrulaboratoareledemicrobiologiectipentruunitile sanitarengeneral,indiferentdesistemulpublicsauprivat.Vaporiideaprealizeazla0,5

atmosfereotemperaturde115C,la1atmosferotemperaturde121Cirespectiv134Cla2 atmosfere. Autoclavularecapiesprincipaluncazancupereimetalici,caresenchideetancuun capacprevzutcuunsistemspecialdenchidereininteriorulcruia,vaporiideapsunt comprimailapresiuneanecesarnvedereasterilizrii.Existmaimultetipurideautoclave: autoclavecuperetesimplu verticale orizontale autoclavecumantadeaburi verticale orizontale. ncontinuare,dreptexemplu,vomdiscutanumaidespreautoclavulcuperetesimplu,vertical,la carevaporiiprovindinapaaflatncazanuldepresiuneiajungncameradesterilizaredejosn sus.Presiuneadininteriorulcazanuluiestenregistratdeunmanometru.Pentrupunerean funciuneaautoclavului,ndotareexist2robinete:unulsuperior(robinetuldeaerivapori,care permitelegturantrecazanimediulexterior)iunulinferior(robinetulcarepermiteevacuareaapei dincazan).Pentruaevitaaccidenteleexistosupapdesigurancaresedeschideipermite evacuareavaporiloratuncicnd,accidental,presiuneavaporilordepetelimitadesiguran.n momentuldefapentruevitarearisculuideavenincontactcuvaporideapfierbiniaflaisub presiune,autoclavelesuntdotatecuunsistemcarenupermitedeschidereacapaculuipncnd presiuneadininteriornuoegalizeazpeceadinexterior.Cazanuldepresiuneesteinclusntrun pereteexteriorsolidcarelaparteainferioarareunspaiuncareseaflsursadecldur. nparteainferioaracazanuluidepresiuneseaflunsuportpecareseaeazoplacde metalperforat.Pesuportseaeazmaterialelecaretrebuiesterilizateiarfaptulcplacaeste perforatpermitetrecereavaporilordeapproduidupnclzireaapei.nvedereasterilizriise procedeazastfel: verificmnivelulapeidinparteainferioaracazanului,caretrebuiesfiepnlao distande23centimetridesuportdacnivelulasczut,secompleteaz(recomandabilseva utilizaapdistilat) aezmpesuportobiecteleimaterialeledesterilizat,ambalatecorespunztor nchidemetancapacul,folosindsistemulspecialdeetaneizarecucareestedotat autoclavulpecarelavemladispoziie conectmsursadecldur deschidemrobinetulpentruevacuareaaeruluiivaporilor(dacrmneaerncazanulcu presiuneeficienasterilizriivascdeaconsiderabilvaporiideapfiindmaiuori,vornclzin specialparteasuperioaracazanuluintimpceaerul,carevaatingetemperaturiinferioare,fiind maigreu,varmnenparteainferioaracazanului) nchidemrobinetuldupevacuareaaeruluiiapariiaunuijetcontinuudevapori presiuneadincazanncepescreasciesteurmritcuajutorulmanometruluiatunci cndpresiuneaatingevaloareadorit(deex.1atmosfer),reglmsursadecldurnaafelnct aceastpresiunesfiemeninutpentrutoatduratasterilizrii(deex.30minute) duptrecereacelor30minutentrerupemsursadecldurilsmautoclavulsse rceascpncndpresiuneadininteriorajungelanivelulpresiuniiatmosferice

deschidemlentrobinetuldevapori deschidemsistemuldeetaneizareicapaculautoclavului lsmobiecteleimaterialelesserceascnautoclavuldeschis atuncicndtemperaturaajungelacirca80Cputemscoatematerialelesterilizate. Prinautoclavareputemsterilizadiferitesubstanensoluie,sticlrie(cuexcepiapipetelori lamelor),materialecontaminatedinlaborator,instrumentarchirurgical(metalic,decauciucsau bumbac),mediidecultur,aparatedefiltratetc. 2.Tindalizarea(sterilizareafracionat)esteometoddesterilizareprincldurumedcare evitdepireauneitemperaturide100C.Substaneledesterilizatsemeninla56100Ctimpde 3060minute,3pnla8zilesuccesiv.Astfel,utilizndmediicarepermitgerminarea,dupprima nclziretimpde3060minutesuntdistruseformelevegetativeiarduprcirearelocgerminarea sporilor.nziuaurmtoaresuntdistruseprinnclzireformelevegetativerezultatedingerminarea sporiloriarduprcirearelocgerminareasporilorcarenuaugerminatnprimazietc. Dinpunctdevederetehnicpotfiutilizateautoclavelacaresevameninepermanentdeschis robinetuldevapori(iastfelnusevadepininteriortemperaturade100C),bideapsaubi denisip. Printindalizaresepotsterilizaalimente,unelemediideculturetc. Pasteurizareaifierbereanureprezintmetodedesterilizare,darsuntutilizatenanumite situaii.Pasteurizareafoloseteclduraumediareaplicaiinconservareapentruscurtdurata unoralimente(lapte,bereetc).Existopasteurizarejoas(30minutela5665C),opasteurizare medie(15minutela6575C)iopasteurizarenalt(25minutela8590C).Prinpasteurizaresunt distrusebacteriilenformvegetativdarnuisporii.Fierbereapoatefiutilizatatuncicndnu dispunemdealtemetodeeficientedesterilizare.Fierbereatimpde30minutedistrugebacteriilen formvegetativ,fungiiivirusurile,darnuisporiibacterieni.Timpulsenregistreazdupceapa anceputsfiarb.Eficienaacesteimetodepoateficrescutprinadugareadecarbonatdesodiu 12%.

Sterilizareaprinfiltrare
Microorganismelepotfireinutemecanicielectrostaticnporiiunuifiltru.Trecereaunuilichid printrosubstanprevzutcuporicarevareinemicroorganismeledinlichidulrespectivpoart numeledesterilizareprinfiltrare. Dealungultimpuluiaufostutilizateoseriedefiltreclasice(porelan,sticlporoas,azbest impregnatcucaolin,pmntdeinfuzori).Actualmentesefolosescdincencemaifrecvent membranefiltrantedinacetatdecelulozcuporozitintre8i0,025mm.nvedereafiltrriisunt necesareoseriedepieseprecum:unrecipientncareseintroducelichidulcareurmeazafifiltrat, unrecipientncaresevacolectalichidulsterilizat,oplniecaresemonteazetanntrecele2 recipiente,opompdevidcarevaaspiralichiduldinprimulnaldoilearecipient,prinmembrana filtrant.Toateacestepiesesuntsterilizateprinautoclavarenaintedencepereafiltrrii. Existialtevariantetehnice.Cuoimportanpracticparticulararfidemenionatfiltrele pentrusterilizareaaeruluidincabineteledesiguranbiologic(clasaIIiclasaIII),filtreleHEPA (HighEfficiencyParticulateAirFilters). Sterilizareaprinfiltrareesteutilizatpentrudecontaminareaaerului,aunormediidecultur

(carenusepotsterilizaprinautoclavare),aunorreactivicaresuntsensibililatemperaturileatinse ncazulsterilizriiprinclduretc.

Sterilizareaprinintermediulradiaiilor
Radiaiileneionizante(UV)sauionizante(Xetc)auefectebactericideprinruperealegturilorde hidrogen,oxidarealegturilordubleetc. RadiaiileUVsuntutilensterilizareasuprafeelordelucru(pentrurepartizareamediilorde cultur,altemanevreasepticeetc)ncazulncarenuexistcabinetedesiguranbiologiccuflux laminar.LmpilecuUVsuntnumitelmpigermicide. Radiaiileionizantesepotutilizansterilizriindustriale(pentrualimente,medicamente, seringideunicntrebuinareetc).

AntisepsiaiDezinfecia
Antisepticeleidezinfectantelesuntsubstanecuaciuneantimicrobianneselectiv,alternd structuriifunciicomunemicroorganismeloriorganismelorsuperioare.Antisepticelepotfi utilizatepetegumenteimucoase,dezinfectantelepotfiutilizatenumaipesuprafeeistructuri carenusuntvii. Clasificarenfunciedemecanismuldeaciune a).Substanecaredenatureazproteinele(aungeneralefectbactericid):acizii,bazele,alcoolii (deexemplualcooluletilicde70,folositpentruantiseptizareategumentelor). b).Substanecareoxideazgruprilechimiceliberealeenzimelor(deexemplu,SH): hipermanganatuldepotasiu1,utilnantiseptizareamucoaselor,peroxiduldehidrogen,soluie3 %nap,utilizatnantiseptizareaplgilor,halogenii(Cl2,I2,Br2)iderivaiilor(hipoclorii,cloramine, soluiiiodurateetc)nconcentraiicorespunztoareetc. c).Substanecareblocheazgruprilechimiceliberealeenzimelor(deexemplu,SH):metale grele[sruriledemercur,preparateleorganomercuriale(exemplumerthiolatdesodiu),srurilede argint,compuideargintcoloidal(exemplucolargol,protargol)cuefectebactericide],gruprile alchilaleformaldehidei,glutaraldehidei,oxiduluideetilenetc. d).Substanecarelezeazmembranelecelulare:fenolii[acidulfenicareutilizrilimitate datoritproprietilorcausticeitoxicitiisaleesteetalonulfadecaresemsoaractivitatea antimicrobianaantisepticeloridezinfectantelor(indicelefenolic),crezolii,hexaclorofenul, clorhexidina(cuefectetoxicemaireduse)etc],detergenii[anionici(spunuri,perlanetc),cationici (sruricuaternaredeamoniu,deexemplubromocet),amfolitici(deexempluacidul dodecilaminoacetic),neionici(deexemplupropilenglicolul)]. e).Substanecarealtereazaciziinucleici:coloraniibazici(violetdegenian,albastrude metilen,fucsinbazicetc),derivaiideacridin,deexemplurivanolul. ncontinuarevomprezentapescurtctevadintresubstaneledezinfectante,inndcontde faptulcnuexistniciundezinfectantideal.Existnumeroasesubstaneinumeroiproductori deantisepticeidezinfectante. Hipocloriii:

soluiiledehipocloritsepreparperiodic(seinactiveazdupmaimultde24ore) concentraiancloractivestediferitnfunciedescopulurmrit(ex.2.500ppmclor activpentrudezinfectareapipetelorcontaminate) auefectdezinfectantasuprabacteriilornformvegetativ,sporilorbacterieni,fungilor (100ppmnoor),virusurilor(200ppmn10minute) efectulestediminuatconsiderabilnprezenasubstanelororganice(nspecialproteine), maselorplastice,detergenilor Derivaiifenolici: datoritatoxicitii,potenialuluicarcinogeneticicorozivitii,fenoliinusefolosescca atare,cisubformaderivailorfenolici soluiilefenolicesepreparperiodic(dupcelmult24ore) concentraiapoatefidiferitnfunciedescopulurmrit(deobiceiestede25%) auefectdezinfectantasuprabacteriilornformvegetativ,fungilor,unorvirusuri(ex.HIV einactivatdesoluia0.5%) efectulestediminuatpesuprafeeledecauciuc,lemnsaumaterialplastic Glutaraldehida: celmaifrecventesteutilizatconcentraiade2%,launpHalcalin areefectdezinfectantasuprabacteriilornformvegetativ(ncazulmycobacteriiloreste necesaruntimpmailungdeexpunere),fungilor,virusurilor datoritfaptuluicnucorodeazmetalele(aacumsentmplncazulsubstanelor prezentatemaisus)sepoatefolosiiladezinfectareasuprafeelormetalice nupoatefifolositpentrusuprafee,datoritvaporiloriritaniitimpuluimarede expunereidealpentrudezinfectareaechipamentelorcontaminatecepotfiimersateoperioadamai maredetimpncontaineremeninutenchise Iodoforii: suntsubstanecarecomplexeaziodulpecarelelibereaznsoluiiapoase auefectdezinfectantasuprabacteriilornformvegetativ,unorsporibacterieni,fungilor, unorvirusuri(ex.virusuricunvelilipidic) suntinactivaidesubstaneorganice(nspecialproteice),maseplastice,detergeni potfiutilizaipentrudezinfeciasuprafeelor,dezinfeciapipetelorcontaminate. Sterilizareacuetilenoxid(CH2CH2O): exercitactivitibactericideprinalkilareaacizilornucleiciiprinnlocuireahidrogenului labilprintrogruparehidroxietil(CH2CH2OH) sporiideBacillussubtilisnusuntdistrui acesttipdesterilizareseutilizeazpentrumaterialecarenurezistatuncicndsunt supuseaciuniitemperaturiisauradiaiilor(ex.materialedincauciuc,plastic,echipamentelectronic etc) etilenoxidulpoateexplodavariantelepentruevitareaexplozieiinclud:1.utilizarea etilenoxiduluincamerespecialecarepermitmeninereauneipresiuninegative2.combinareacu CO2ncameredeoelspeciale3.combinareacuhidrocarburifluorinate indiferentdevariantafolosittrebuierespectatetoaterecomandrileproductorului. existoseriedeinconvenientenceeacepriveteacesttipdesterilizare(efecte

carcinogenetice,efectelanivelulsistemuluinervosetc) sterilizareaestenprincipiuinfluenatde:concentraiaetilenoxidului,temperatur, umiditatearelativitimpuldeexpunere(spreex.odublareaconcentraieivareducelajumtate timpulnecesarpentrusterilizare).

5. Schema general a diagnosticului microbiologic

Diagnosticuldelaboratornmicrobiologiepoatefiundiagnosticbacteriologicsaumicologic (direct),undiagnosticimunologic(indirect)sauocombinaieacelordouvariantemenionate.Aa cumammenionat,ncontinuaredorimsprezentmetapeleprincipalealediagnosticului microbiologic(bacteriologic,micologic,imunologic),structurpecareurmeazsdiscutm, concret,diferitesituaiincadrulcapitolelorcareurmeaz.nanexe,atuncicndvomdiscuta recoltareaitransportulproduselor,vomsintetizapentruuneledintreacesteprodusesituaiile posibilenmomentulncarenuavemnfaunanumitgensauoanumitspecieciprodusuldin carevomizolaagentuletiologic,iniialpresupus. 5.1.Diagnosticuldelaboratorbacteriologic/micologic 5.2.Diagnosticuldelaboratorimunologic 5.3.Povestiriadevrate

5. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic

Diagnosticuldelaboratorbacteriologic/micologicaremaimulteetape,ianume: 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologic(ctmaiaproapededebutulbolii,nainteca pacientuluisisefiadministratantibioticesauchimioterapice,ctmairapidicorectdinpunctde vederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsieiantisepsie,prelevndun anumitproduspatologicnfunciedemanifestareaclinicncazulrespectiv,deexempluurinn cazuluneiinfeciiurinare,materiifecalencazuldizenteriei,sputncazultuberculozeisau aspergilozei,scuamencazuluneimicozecutanatesuperficialeetc)(vezianexanr.6). 2.Examinareamacroscopicimicroscopicaprodusuluipatologicreprezintdemulteorio etapesenial,carepoateorientapaiiurmtori. Pentruexamenulmicroscopicsevorrealizaminimdoufrotiuridinprodusulpatologicrecoltati transportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen(AM)/Giemsairespectiv Gram.Estepreferabilsavemntotdeaunacelpuinncunfrotiu(derezerv),nspecialncazuln careprodusulpatologicestepreios(LCR,produsrecoltatprinpunciebiopsieetc).ncazul

suspicionriiuneiinfeciimycobacterieneestenecesarrealizareaunuialtreileafrotiu,careseva coloraZiehlNeelsen.Frotiurileseexamineazlamicroscopuloptic,iniialcuobiectivul40pentruo analizmaigeneral,pentrustabilireacmpuluimicroscopicsaualzoneideinteres,apoicu obiectivuldeimersie.Senoteazprezenadiferitelorcelule(eventualmodificatefadenormal, buratedemicroorganisme),prezenacelulelorinflamatorii(dovadareactivitiiorganismului,ex. leucocite,surprinzndeventualfenomenuldefagocitoz),precumieventualaprezena microorganismelor(bacterii,levuri,pseudofilamente,micelii),carevafiinterpretatcuprecauie,n contextuldat.Chiardacexamenulmicroscopicestedecelemaimulteoriunexamenorientativ, trebuierealizatdefiecaredat,curigurozitate,nanumitesituaiiputndfifoarteimportantifoarte util. Atuncicndprodusulrecoltatestereprezentatdesnge,urinsaumateriifecale,deregulnu serealizeazfrotiurifixateicolorate.Spreexemplu,ncazulmateriilorfecale,sevafaceo coprocitogram,unpreparatproaspt(nativ)ntrelamilamel,cutndusenspecialprezena leucocitelor(dariaunorstructuricarepotdaanumiteinformaiicuprivirelafuncionalitatea tractuluidigestiv).ncazulsuspicionriiuneiinfeciiurinare,sevarealizaunsedimenturinar(dup centrifugareaurinei),caresevaexaminantrelamilamelnvedereaaprecieriinumruluide leucocitepecmpmicroscopic,ncazulncareacesteaexist,nvedereaaprecieriiprezeneiunor cilindriileucocitariprecumiaaltorcelulenormalesaupatologice,aprezeneiunorelemente fungiceetc.,datecarepotfideosebitdeutilenvedereaunuidiagnosticcorectiutilpentru pacient. ncazulsuspicionriiuneiinfeciimicoticesuntutileattpreparateleproaspete(ex.preparatul montatnsoluiedeKOHglicerol1020%),frotiurilecucoloraiinegative(tudeIndia,nigrozin), precumifrotiurilecolorateMayGrnwaldGiemsasauGram. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicsevafacenfunciedesituaie(mediilei condiiiledeincubaresevoralegenfunciedepresupusulmicroorganismpecaretrebuiesl izolmspreex.ncazulncareinfeciaesteprodusdemicroorganismestrictanaerobe,nlipsa condiiiloranaerobedecultivareesteimposibilizolareaagentuluietiologic).Pentrufungitrebuie utilizatemediilepotriviteiotemperaturmaimicdectceautilizatncazulbacteriilor.Cultivarea sevarealizanaafelnctssepoatobinecoloniiizolate(tehnicansmnriinpoligon)i respectivoculturpur,caresevaidentifica. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: a)Caracteremorfologice:sevarealizaunfrotiudincoloniaizolat,frotiucaresevafixai coloraGramsauZiehlNeelsen,dupcaz,isevaexaminamicroscopic.Prinexaminareafrotiurilor sevorevidenianumaimicroorganismecuformitinctorialitatesimilar(ncazulgermenilorcu polimorfismimportant,ex.Proteusspp.,pefrotiuvomobservaaspectemorfologicediferite,dela aspectecocobacilarepnlaformefilamentoase).ncazullevurilor,aspectulestecocobacilar, Grampozitiv,dardedimensiunimaimari. b)Caracteredecultur:sevorexaminacoloniileizolateaprutepemediiledecultursolidei carepotfidetipSpentrumajoritateagermenilorstudiaiinclusivpentrulevuri,detipRn cazulCorynebacteriumdiphteriae,MycobacteriumtuberculosisiBacillusanthracis,detipMn cazulbacteriilorcapsulate,deexempluKlebsiellapneumoniaeirespectivunaspectpufosncazul mucegaiurilor(detaliiprivindaspectelecoloniilormicrobienesuntprezentatencapitolelededicate

fiecruigennparte). c)Caracterebiochimice:acesteapotfifoartevariatedelaospeciemicrobianlaaltaipotfi foarteutilespreexempluncazuldiferenieriienterobacteriilor(introducereanpracticamediilor multitestpermiteevaluareamaimultorcaracteresimultan,ex.mediileTSI,MIU,sistemeleAPI etc).ncazulfungilorsuntutilizateauxanogramasauzimograma. d)Caractereantigenice:caractereleantigenicevorfiexaminatebazndunepestructurai antigenicitateamicroorganismeloripespecificitateareaciilorantigenanticorp.Vomutiliza anticorpicunoscuipentruaidentificaantigenelemicrobienenecunoscute.Spreexemplu,prin reaciideaglutinaredirect,pelam,sepotidentificaantigeneleirespectivspeciileitulpiniledin genulShigella,Salmonella,Vibrioetc).Reaciideaglutinareindirectsepotutilizapentru detectareanp.p.astreptococilordegrupAsauBetc.,pentrudetectareaunorenterotoxine,pentru detectareaunorfungi(Cryptococcusneoformans,Candidaalbicans,Aspergillusspp.)etc. e)Caracteredepatogenitate:putemexaminacapacitateaunuimicroorganismdeaelabora anumitesubstanecurolnpatogenitate(ex.coagulazaprodusdeStaphylococcusaureus)sau infeciaexperimentalaunuianimaldelaborator(ex.izolareapneumococilordelaunpacientcu pneumoniedupinoculareasputeilaoarecelealbncazulncarensputexistpneumococi, animalulvamurin2448deore,iardinsngeleluisevaizolaoculturpurdeStreptococcus pneumoniae). f)Sensibilitatealaunanumitbacteriofagspecific(lizotipie) g)Altecaractere(identificatedeex.prinmetodealebiologieimolecularesaualtemetode moderne)(vezianexanr.7). 5.Antibiogramairespectivantifungigrama(testareasensibilitiilaantibioticeichimioterapice antibacterieneiantifungice,nvedereastabiliriitratamentului)serealizeazdeobiceiprinmetode difuzimetrice.ncazulunorinfeciigrave,antibiogramadifuzimetrictrebuiesfiecompletatde determinareaconcentraieiminimeinhibitorii(CMI)irespectivbactericide(CMB).ninfeciigrave, cupotenialfatal,poatefinecesardeterminareaniveluluideeficienpentruantibioticulutilizat, respectivstabilireaniveluldeeficieninhibitorie(NEI)iniveluluideeficienbactericid(NEB)(vezi icapitolul7).

5. 2. Diagnosticul de laborator immunologic

Diagnosticuldelaboratorimunologicpoatefiserologici/sauimunobiologic. ncadruldiagnosticuluidelaboratorserologicsevadeterminaprezena(sausevadovedi absena)anticorpilor,nserulpacientuluiinvestigat,utilizndantigenecunoscute.ndiagnosticul serologicnebazmpespecificitateareaciilorantigenanticorpiutiliznddiferitetehnicitrebuies putemrspundelaminimtreintrebrieseniale,ianume: existanticorpinserulpacientuluiinvestigat? careestetitrulanticorpilor? cumevolueazndinamic(ntimp)acesttitrunacestsenssevorrealizaminimdou

determinridiferitelaunintervalde710zileaceastanaliznevapermitesdifereniemsituaia uneiafeciuniacute(titrulanticorpilorestemaicrescutlaadouadeterminare,nmodclasicde4 ori),desituaiancarepacientulestedejanconvalescen(titrulanticorpilorlaadouadeterminare vafimaisczut)saudesituaiaunuipacientcuoafeciunecronic(titrulanticorpilorvafi asemntorsaufoarteapropiatlaceledoudeterminrisuccesive).nvedereaidentificriiunei infeciiacute,ovariantposibilnmajoritateasituaiilorestedeterminareaanticorpilorspecificide tipIgM. ncadruldiagnosticuluidelaboratorimunobiologicsevastudia,deexemplu,reactivitatea pacientuluifadeunanumitantigeninoculat.Intradermoreacialatuberculin(PPD,preparat proteicpurificat)saulacandidinreprezintexempleclasice,nacestsens.Tehnica intradermoreacieiestefolositnmaimultescopuriitrebuiesavemnvederecnfunciede scopulurmritirespectivnfunciedeantigenulinoculat(idemecanismulimplicat),modulde citirealrezultatelorvafidiferit(vezianexanr.3). Considermcpentruoricemedic,indiferentdespecialitate,multedintreprincipiile microbiologieisuntfoarteutile,meritsfieneleseiaplicatecorespunztor. Pentruceicaresededicmicrobiologieisaubolilorinfecioase,acestenoiunireprezintobaz obligatorie,carepoateficompletatutilizndpedeopartediferiteletratatemedicalendomeniudar iexperienapersonaldezvoltatattdinpunctdevedereteoreticctipractic.

5. 3. Povestiri adevrate
1.Desprediagnosticitratamentninfeciileurinare Problemaluatndiscuieesteauneicolegemaitinere,studentntrunanmarelamedicin, dardefapt,caiurmtoarea,poateficonsideratoproblemcarepoatefiaunuisisteminua unuicazparticular. nurmcumaimultdeunan,coleganoastrprimetediagnosticuldelitiazrenali recomandareadeeliminareaacalculilorprinlitotripsie[manevrcareconstnmrunireacalculilor urinari,fragmentelefiindapoieliminatenmodnaturalprinurinaccesullacalculisefacepecale endoscopicisubcontrolendoscopicpulverizareacalculilorpoatesfierealizatcuajutorulunei pense(litotripsiemecanic),cuajutorulultrasunetelor(litotripsieultrasonic),prinundedeoc repetate(litotripsieelectrohidraulic)saucuajutoruluneifibrelaser(litrotripsieculaser)].Manevra esteexecutat,cusucces(conformprotocoluluioperator). Dup5luni,nanulurmtor,semnelecliniceianalizeledelaborator(nspecialurocultura nsoitdetestareasensibilitiilaantibiotice)permitpunereadiagnosticuluideinfecieurinar(ITU) cuEscherichiacoli.Viitorulmedicprimetenorfloxacin,timpde10zile.Pentrucla3sptmni delaprimuldiagnosticsimptomatologiapersist,primeteunnoutratament,deaceastdatcu amoxicilin+acidclavulanic.Lancheiereaceluidealdoileatratament,simptomatologiapersist icoleganiseadreseazsolicitndunsfat,menionndicmediculurologiarecomandats nceapuntratamentcucefuroxim(cefalosporindegeneraiaaIIa)iUrovaxom,timpde20de

zile,apoisrefacanalizele.TulpinadeE.coliidentificatlaultimulexamenbacteriologic prezentasensibilitatela:acidnalidixic,ceftazidim,cefuroxim,cotrimoxazol,fosfomicin, gentamicin,rezistenla:amoxicilinilaamoxicilin+acidclavulanicieraintermediarla norfloxacin(cualtecuvinte,putemremarcaevoluiasubtratamentatulpinii,iniialsensibilla norfloxaciniamoxicilin+acidclavulanic,rezistenctigatntrepte). Larecomandareanoastr,colegaseprezintdinnoulauncontrolechografic,conformcruia sepunnevidenelementelitiazice.Estecunoscutfaptulclitiazarenalreprezintunuldintre factoriideriscpentruapariiaipersistenaITU. Opinianoastrafostca,nacestcaz,analizeledelaboratorsserealizezenINCDMI Cantacuzinoipentrucerancvacaniarreedinanuerancapital,coleganoastra respectatrecomandareanadouajumtatealuniiseptembrie.Dindiscuiilepecaleelectronic amaflatcmediculurologaafirmatcestevorbadeoboaldetubrenalicnacestecondiii trebuieseviteITU,carepotfifactordeagravare.Coleganoastreradejangrijoratdatorit rezisteneilatratamentainfecieicuE.coli. DupadministrareadeUrovaxom,uroculturarealizatlaBucuretinlunaseptembrieafost steril,situaieconformcustatusulclinic(lipsasemnelorsausimptomelor). Totui,dupcirca23sptmni,semneleisimptomelerevinicoleganiseadreseazdin nou,pentruunsfat,menionndirezultateleobinutelatestareasensibilitiilaantibioticepentru tulpinadeE.coli(menionatemaisus)icerndsirecomandmunuldintreantibioticeledinlist pentruancepeunnoutratament. Aacumnicidiagnosticuliprescriereatratamentuluilatelefonnureprezintunbunexemplu nmedicin,niciutilizareaciielectronicenupoatessubstituieexamenulclinicianalizelede laborator.Avndnminteacesterecomandripecareleamnvat,larndulnostru,nvremea studenieisauntimpulrezideniatului,singurulsfatpecarelampututexprimaafost:refacerea analizeidelaborator,totlaINCDMICantacuzino. SfatulafosturmatiardiagnosticulafostITUcuKlebsiellapneumoniae,ceeaceacontrariato pecoleganoastr(totui,rezultatulnuafostsurprinztor). Pentructoataceastdiscuiesepurta,dinnou,pecaleelectronic(coleganoastrse ntorsesenlocalitateadereedin)ipentrucnutiamundefuseserealizatultimulexamende laborator,nprimulrndamsolicitataceastinformaie.Aflndattlaboratorulctimediculcarea pusdiagnosticul,aceastaareprezentatpentrunoiocertitudinecultimuldiagnosticesteiel corecti,ncontext,existaudouposibilitideprimintenie: infeciecuunaltgermendinfloraproprie,ncondiiilelitiazeirenale infeciedubl,attlanivelurinarctinaltsediu,caretrebuietratatsimultan, urmndcasituaialitiazeirenalesfierezolvatulterior. Recomandareaafostderealizareaunuinouexamenbacteriologic.Apelndlaunuldintrecei maiexperimentaicolegi,unuldintrepuiniiiadevraiiprofesoridincatedrademicrobiologie(ajuns /scoslapensie),nfinalafostdoveditodublinfecie,ITUilanivelgenital,cuKlebsiella pneumoniae.Tratamentulinfecieilanivelulambelorsediiaduslavindecareainfeciei,dispariia semnelorisimptomeloriprimireamulumirilorderigoare,prinemail. 2.Cuprivirelalipsadiagnosticuluimicrobiologiciurmrileacesteilipse Unaltcolegmaitnr,deaceastdatnprimiianidestudiu,arelatatdupmomentulncare amdiscutatirezolvatosituaieparticular,medical,cnvremeacopilrieiaprimitdefoarte

multeoriantibiotice,deregulncadruluneiautomedicaiistabilitnfamilie. Celemaifrecventeprobleme,cailamulialicopii(dacnuchiarlatoi)eraulegatede nasgturechi(ORL),iarmedicamenteleantimicrobieneprimitesaurepetatanualidemaimulte oripeanpnsprevrstade1314ani. Separecunmomentimportantafostlegatdeoinfeciedeacelaitip,cumanifestriceva maiserioase,careaudeterminatfamiliasseprezintempreuncutnrulnostrulamediculde familieacesta,analizndautomedicaiapropusaconcluzionatcrespectivulmedicamentn cantitateapropusreprezentaunriscpentrupacientinacestcontext,pacientulanelescnu trebuiesmaiacceptemedicaiacaatare(chiardaceraminor,laaceadat).Totui,colegul nostruaconcluzionat:oricumafostsuficientdemulttimpsiaupastileaiurea. ns,toateacesteproblemesauartatafiminore,fadeceeaceaurmat. ntrotoamn,lanceputdeliceu,ntrovineri(majoritateaproblemelorimportante/gravesepot petrecevinerea,nweekend,noaptea,lasfritdeprogrametc),tnrulcolegarevenitacascu durerifoartemarinzonaarticulaieicoxofemurale,dupolovituraparentminor,ncursulunui mecidefotbal.Unadintreeroriafost,probabil,faptulcprimareacieacasafostobaiefierbinte (darrealmentefierbinte). Dup3648deoredurerilesauintensificatfoartemulticopilul(aveatotuinumai15ani)nu samaipututdeplasafrajutorulunuiadintreprinisauaunuicadrumetalic. Aunceputperipluriprinunitisanitare,iniiallaunspitalcuprofildeurgenecopii,ulteriorla unspitaldeurgenpentruaduli,laoseciedeortopedie(imaginileradiologicenusugeraunimic, separe).Laceldealdoileaspitalsauadministratmedicamentecalmante,sauefectuatnoi radiografiiplusrecomandareadeareveniluni,pentrunoianalize. ntimpulweekenduluidurerilesauintensificatiafostnregistratfebra(peste38,5C) copilulnumaiputeapunepepmntmembrulinferiordrept. Larecomandareaunorcunotine,familiasandreptatiniialctreceldealtreileaspital(cu profildecopii).Laacestspital,ntotcursuldimineiirespective,nimeninuagsittimpulnecesar pentrualconsultapecopilcaremenioneaz,dinamintiri:nimeninusauitatlamine,eum ineamdepereiimamaalerga...,motivpentrucareauplecatdelaaltreileaspitalisau ndreptatspreceldealdoilea,celcuprofildeaduli.Analizeleefectuateaufostremarcabileprin intensitateainflamaiei(tradusprinvalorilenaltealereactanilordefazacut)isugerareaunei infecii.Mediculaluatlegturacuuncolegdelaunalpatruleaspital(cuprofildecopii), suspicionnd,separe,unprocestumorallocalizatosteoarticular. Dinamintiriledecopilamputearemarcantretimptrecusercam5zile,poatechiaro sptmn,urlamdedurerecndncercamsmerg,abiamaiputeamsmdaujosdinpati dacaeramajutaturlamdedurerepentrucnumaisuportamsfiuatinsdeveniseunchinsmerg labaiepentrucoricumduramultiacolonupreamaiputeamsstau...misaufcutanalize, radiografiianalizeleindicauoinfeciecarecretea"ncomparaiecuanalizeletrecute... radiografiilenuspuneaunimic. Medicii,dupuntimp,auindicattratamentcuoxacilin,12g/zi,iarntrediagnosticele diferenialeluatendiscuiesauaflat:cancerosos(celmaifrecventdiscutat),tuberculozosoas, reumatismi...ncelmaibuncaz,oinfecie(copilul,actualulnostrucoleg,iamintetecdup multtimpaaflatdelaprinicaexistatisuspiciuneadecancer,darpriniiautiutacestlucru delanceputiimaiaminteteialteaspecte,pecarenuleputemdiscutanmaterialulde

fa). Dupcirca1sptmndelainternare,pacientulsedeplasacumaregreutate,circa15metri n30deminute,casajunglabaie(noroccunitebieicarestteaucuminensalonim ajutau).Aprimitncontinuareoxacilin12g/zi,afostexaminatrepetat,radiologic(separecsau executat2025deradiografiidebazindelanceputipnntimpulacesteiinternri),semnelede laborator(reactaniidefazacut)aunceputsstagnezesausevoluezepozitivdurerileau continuat,lafeliimpotenafuncional. Lasfaturileunorprieteni,priniiaudecisstransferepacientulnalcincileaspital,cuprofilde aduli,transfercarenuafostrealizatcufoartemultuurin,dar,separecacestultimtransfera fostsalutar.Actualulnostrucolegpoartiastziundeosebitrespectcelorcaresauocupatdeel nclinicadeortopedieaspitalului,attefuluideclinicdariunuicoleg,carelaaceavremeera maitnripecareavemplcereaslcunoateminoi.Datoritsuspiciuniidecancerosos,au urmatalteanalize,otomografiecomputerizatioscintigrafieosoas(dinfericireinfirmnd respectivasuspiciune)tratamentulantiinfeciosafostcontinuatiniialcuoxacilin2g/zin asocierecugentamicin2mg/kg/corp(de2oripezi)timpde2sptmni,urmatdetratamentcu oxacilin2g/zi. Tnrulnostrucolegimaiamintetec,naintedetransferullaalcincileaspitaltratamentula fostadministratintravenoscndamplecatdela...dejaartamcaundrogataveampemini foartemultevenesparte,cheaguripebranule...iarnmomentulncareaauzitpentruprimadat caexistatsuspiciuneadecancerososaslbitcirca4kgn2zile. nfinal,pacientulafostexternat,vindecat,dupolungperioaddesuferin. Dindiscuiacutnrulnostrucolegidinamintirileacestuia,nuamremarcatvreoncercarede diagnosticmicrobiologic,vreorecoltaredeproduspatologiccaresfietransmisspreanaliz (naintedeadministrareaantibioticelorsauchimioterapicelor),vreorecoltaredesngepentru hemoculturi. Nuputemmenionatoateimpresiilepecarecopilul,pacientul,tnrulcolegleaacumulatpe parcursulacesteiexperienedevia.Totui,amintimodorinexprimatdeacestadefiecaredat cndtrebuiesmerglaspital,mrogsdaudeunOM. 3.Despreuneleteoremedintimpulfacultiisaurezideniatului Foartemulttimp,lacursurintimpulstudenieisauntimpulrezideniatuluiamfostnvaic IDRcuPPD(veziianexanr.3)nuareniciovaloare,nRomnia,pentructoicopiiisunt vaccinailanatere,pentructuberculozaesteendemicetc.nacestecondiiitoicetenii romniauIDRpozitivionoutestarenuvaaducenicioinformaieutil.Amsuspicionatdemult timpcaceastteoremnuareacoperirereal. nultimiidoiani,princolaborarecuoseriedestudenientuziati(sigur,studiiletrebuie continuateiestenecesarrealizareaunorobservaiipeunlotsemnificativstatistic),amnceput infirmareaacestorsupoziii,transmise,dinpcate,multorgeneraiidestudeni,rezidenietc.Dincei peste60destudenicareaudoritsparticipelastudiu,n40,9%dintrecazurivaloarecitiriila48i 72deoreafost0(zero)milimetrintimpcen19,7%valoareainduraieiafostdepeste10ipn la22milimetri.ntruncaz,consultulcumediculdespecialitatepneumoftiziologadusla recomandareaadministrriidehidrazidaaciduluiizonicotinic,pentruprevenireauneituberculoze manifeste,ceeaceprobabilafostsalutarpentrurespectivul,maitnr,coleg.

6. Norme privind prelevarea i transportul produselor patologice n diagnosticul microbiologic direct

nschemageneraladiagnosticuluimicrobiologicdirect,fiecdiagnosticulseadreseazunei infeciibacteriene,fieuneiafungice,recoltarea(prelevarea)itransportulprodusuluipatologic reprezintoetapesenial.Dealtfelaceastafirmaieesteperfectvalabilindiagnosticul virusologicsauparazitologic.Utilizmtermenuldeproduspatologicnrelativexces,adicde regulrecoltmunanumitproduscareestepotenialpatologicfaptulcestepatologiclvom dovedi(sauinfirma)ncursuldiagnosticuluidelaborator.Pentruasimplificamoduldeexprimare, vomacceptautilizareaacestortermenicaatare. Prelevareaitransportulprodusuluipatologic(p.p.)efectuatecorespunztorvapermite realizareaetapelorurmtoaredediagnostic,culminndcustabilireasensibilitiilaantibioticei chimioterapiceamicroorganismuluiimplicatpatogenicninfeciadoveditlaunpacient anume(nuexistboli,cibolnavi).

Reguliprivindrecoltareaproduselorpatologice
Secunoscoseriederegulicaretrebuierespectatecustricteencursulacesteietape: esterecomandabilcarecoltareaistabilireamodalitiidetransportap.p.sfiefcut demedicsausubndrumareaunuimedicdespecialitate prelevareap.p.trebuiesaiblocnaintecapacientulsfiprimitantibioticesau chimioterapice acestdezideratestendeplitdincencemairarceeacecreazmulteproblemen diagnosticulmicrobiologiccontribuindilaselectareamicroorganismelorrezistentela medicamenteleantimicrobiene eforturileprivindndeplinirealuitrebuiesaparinattpacientuluictimedicilor

implicai(medicdefamilie,medicdealtspecialitate) chiardacboalaestegraviartratamentulantibioticpareurgent,trebuiereinutc pentrurecoltareap.p.carepoateducelaundiagnosticcarearputeasalvaviaapacientuluisunt necesarenumaictevaminuteduprecoltareap.p.sepoateadministraprimadozdeantibiotic sauchimioterapic,alesempiric,pecriteriideprobabilitate ncazulncareevoluiasubtratamentantibioticestenefavorabil,diagnosticul microbiologicvapermite(ntretimp)izolareaagentuluietiologicistabilireasensibilitiila antibioticeichimioterapiceastfelnctschimbareatratamentuluisevaputeafacenmodriguros, tiinific alternativelesuntreprezentatedeschimbareatratamentuluinmodmaipuinraional sauchiariraional,cuposibileurmrinefastepentrupacientsauapelarealacocteilul(asocieri)de antibioticecuriscurilederigoare ncazulncare(dintrunmotivsaualtul)tratamentulcuantibioticeafostnceputnainte deprezentarealaspital/laborator,nfunciedeboalasuspectatsepotrecomandaurmtoarele abordri oprirea,dacesteposibil,tratamentuluipentru2448ore,curecoltareap.p.i ncepereadiagnosticuluimicrobiologic recoltareap.p.imediatnaintedeurmtoareadozdeantibiotic ncercareadeantagonizareaefectuluiantibioticului,nmediuldecultur(ex.cusulfat demagneziuncazulncaresauadministrattetracicline) diluareainoculului(maialesdacpacientulaprimituntratamentbacteriostatic)n mediuldeculturfrantibiotic notificareanformularulncaresesolicitanalizadelaboratoricarensoetep.p. precuminbuletinuldeanaliz,atuturordatelorprivitoarelatratamentulprimitdectrepacientul investigat recoltareaitransportulp.p.trebuiesserealizezectmaiaproapededebutulbolii,dar trebuiealesmomentulcelmaipotrivit(optim),respectivmomentulncareesteceamaimare probabilitatecaagentuletiologicssegseascnprodus nfunciedeevoluiabolii(deex.coproculturanfebratifoidsevaefectuadupprima sptmndeevoluie) nfunciedespecificulfiziopatologicalboliirespective(deex.serecomandefectuarea hemoculturiinaccesulfebril) produsulpatologicdincareestimmcvomputeaizolaagentuletiologicalbolii suspicionatevafialesnfunciedemaladieivaputeafireprezentatspreexemplude osecreiedelanivelulpresupuseiporideintrare(ex.secreienazalsaufaringiann difterie,secreiegenitalncazuluneibolivenerieneetc) unprodusdelanivelulcilorderspndirenorganism(ex.snge,esutrecoltatprin biopsiedelanivelulganglionilorlimfatici) unprodusdelanivelulcilordeeliminaredinorganism(ex.urinninfeciiletractului urinar,materiifecalentroboaldiareicacutetc) unprodusdelanivelulfocaruluiinfecios(ex.lichidcefalorahidian/LCRnmeningit, sputnpneumonieetc) nvedereaalegeriiprodusuluicareurmeazafirecoltatestenecesarcunoaterea

patogeniei,evoluieiielementelorclinicelegatedebolileinfecioase,ceeaceesteesenialncazul practicriicuadevratamicrobiologieiclinice periodicitateacucareserealizeazrecoltareadep.p.poateinfluenarezultatuln anumitecazuri,spreexemplu nsuspicionareaunuisepsis(denumireaacceptatactualpentrusepticemie)se recomandrecoltareaa23probedesngen24ore,pentruhemocultur nsuspicionareauneibolidiareiceacuteserecomandrecoltareaacteuneiprobede materiifecale,treizileconsecutiv,pentrucoprocultur nsuspicionareauneituberculozepulmonareserecomandrecoltareaacteuneiprobe desput,treizileconsecutivetc ceeaceafostprelevatitransmispentruexaminaretrebuiesreprezintecuadevrat p.p.(acelproduscareconinecumareprobabililtatemicroorganismulinfectant),spreexemplu ncazulncareestesuspicionatdiagnosticuldemeningitiafostrecoltatLCR,n cazulncaremeningitaestedeetiologiebacteriansaufungic,microorganismulimplicat patogenicvaputeafiidentificatncursuldiagnosticuluimicrobiologic nschimb,dacncazulncareestesuspicionattuberculozapulmonarsevortrimite spreexaminaresalivsausecreiidelanivelularboreluluirespiratorsuperiornlocdesput, diagnosticulmicrobiologicesteimposibiletc dinp.p.sevorprelevaiutilizancursuldiagnosticuluimicrobiologicporiunilecelemai reprezentative,respectivaceleporiunincaresuntcelemaimariansedeidentificare/vizualizare prinmicroscopie/cultivareiizolareamicroorganismuluiinfectant,spreexempluncazulrecoltrii demateriifecale(suspiciunedeboaldiareicacut)sevorselectaporiunilemucopurulente (eventualmucosanguinolente) estenecesarsserecoltezeocantitatedep.p.suficientpentruefectuarea diagnosticuluimicrobiologic(preparateproaspete,frotiuri,cultivripemediidecultur,inoculrila animaledeexperien,reluareaunormanevrencazulcestenecesar recoltareaitransportulp.p.trebuiesserealizezencondiiistrictede asepsie,pentruprevenireacontaminriiceluicarerecolteaz,pentruprevenireasuprainfectrii pacientuluiipentruprevenireacontaminriip.p. sevorrespectaprecauiunileuniversaleprivindprevenireacontaminriinunitile sanitare sevaevita,pectposibil,contaminareap.p.cumicroorganismecareaparinflorei microbienenormale(spreex.printehnicaderecoltare/vezirecoltareaurineisauprinmanevre invazivecareunteazcilenaturaleprincaresunteliminatemicroorganismele/vezirecoltarea sputeiprinlavajbronhoalveolar) sevorutilizainstrumentesterileirecipiente(containere/recoltoare)sterile. Regulileprezentatemaisusreprezintelementefundamentalenvedereaobineriiunui diagnosticcorecti,dupopinianoastr,trebuiecunoscutedeoricepersoanimplicatnactul medical,inclusivdestudeniilamedicin,chiardacnuvoralegepentruviitorpregtirean domeniulmedicineidelaboratorsaundomeniulbolilorinfecioase. naintedeancheiaaceastparteacapitoluluiprivindnormeleprivindrecoltareaitransportul p.p.ndiagnosticulmicrobiologicdirectdorimssubliniemctevaaspectecarenutrebuiesfie neglijate,dupcumurmeaz:

instrumentelepentrurecoltaretrebuiesfienunumaisteriledariadecvate,deex. foartefrecventesteutilizattamponuldevat,nsrecoltareacutamponartrebuisfierecomandat doarrecoltriiitransportuluip.p.=secreiedelasuprafaamucoaseloritegumentelorculeziuni vatapoateconinesubstaneinhibitoarepentrumicroorganisme cantitateadep.p.recoltabilestemic microorganismeleileucocitelermnnproporiemarepevatinupotfiuor transferatepefrotiu,mediudecultur pentruanumitemicroorganisme(ex.Bordetellapertussis)utilizareatamponuluicuvat estecontraindicat recipientelepentrurecoltareitransporttrebuiesfienticurate(darprincltiresfie eliminateoricesubstanechimicecuposibilefectantimicrobian)iapoisterilizate,preferabilprin autoclavarenchiderearecipientelortrebuiesfieperfect,pentruaprevenioricecontaminarepe parcursultransportului recipientelepentrurecoltareitransporttrebuiesfiemarcatecorespunztornaafel nctsnufieposibilapariiaunorconfuziiceeacesenoteazperecipienttrebuiescorespund cuceeaceafostnotatpeformularuldesolicitarearespectiveianalize dateledeidentificareialtedatesemnificaticevorfitrecutenurmtoareledocumente registrulunitiisanitare/seciei/cliniciicaresolicitanalizarespectiv(ncazulncare recoltareaprodusuluipatologicsefacenafaralaboratorului) formularulprincaresesolicitanalizamicrobiologic registruldelucruallaboratorului formularulprincareseanunrezultatulanalizei(buletinuldeanaliz) pentrusimplificare,unsingurformularpoateincludeattparteacorespunztoarea solicitriianalizeictibuletinuldeanalizmicrobiologic oaltmodalitatedesimplificarearputeafireprezentatdenregistrareaelectronica dateloriutilizareametodelormodernedetransmiterealorexistdoarctevaunitisanitaren Romniaundesuntutilizateacestemetode pentrureducereacantitiidedateirespectivasigurareaconfidenialitii,serecurgela numrulunicdeidentificare,ungrupdecifreiliterecarepermitcodificareaiasociereaacte unuiastfeldenumrfiecruipacientnparte cutoatecnregistrareadatelorparepentrumajoritateacelorimplicainactulmedicalo simpliinutilbirocraie,aceastmodalitatedeapreciereestecompleteronatnregistrarea datelorifluxulinformaiilornsistemulsanitarsuntextremdeimportanteiestenecesarsfie depusetoateeforturilenvedereaefecturiilornmodcorespunztor(dinpcateoreledestudiu dedicateacestoraspectesuntmultpreareduseattpeparcursulstudenieictincursul rezideniatului) elementeimportantecaretrebuienotificateatuncicndsesolicitoanalizdelaborator microbiologic pentruidentificareaprodusuluipatologiccareurmeazafiprelucratsevornotanumele, prenumele,vrstapacientului(saunumrulunicdeidentificare),datailoculrecoltrii(unitate sanitar,clinica,secia,salonul) pentrufacilitareaalegeriiceleimaipotrivitemodalitipentruprelucrareap.p.sevornota diagnosticulprezumtiv,naturap.p.,examenulsolicitat,datadebutuluibolii,cemedicaie

antimicrobianafostadministratrespectivuluipacient(antibioticsauasocieredeantibiotice,data nceperiiadministrrii,doze,durat) nacelaisenssevornotadataiorarecoltrii,dataiorarecepionriinlaborator, cineicumafcutrecoltarea,cumafostasigurattransportulp.p. subliniemfaptulc,celmaiadeseavenimncontactcuformulareincomplete/ completateindescifrabil/completatecueroriichiardacarputeapreaincredibil,formulride genulnumeX,prenumeY,probZ,rugmtoatbateriadeanalizesuntncmultpreafrecventei artrebuicadefiecaredatsconduclaodiscuiefermcuexpeditorulpncndasemenea comportamentevorfieliminate,nbeneficiulpacienilor.

Motivepentrucareunp.p.arputeafirespins delaanalizamicrobiologic
Respingereap.p.artrebuisreprezinteoexcepienactivitateaunuilaboratordeanalize medicale,darexistanumitemotivecarepotconducelaaceastdecizie.naintedeaprezenta ctevaexemplenacestsensdorimssubliniemfaptulcactivitateamedicalsedesfoar ntrunsistemncareexistmaimulteverigicaretrebuiesfuncionezeperfect(fiecarenparte)iar ntreverigilesistemuluiartrebuisexisteoperfectcolaborare. nvedereastabiliriidiagnosticuluiitratamentuluicorespunztorncazulunuipacientcare prezintoanumitboaltransmisibil(infecioas)nuexistosubordonareciocorelarea activitilor.Attlaboratorulcticlinicaaudendeplinitfunciifoarteimportante,uneoridecisive pentruviaapacientului. Pentrucansituaiilelimitfuncionareasfieperfectestenecesaruncontinuuantrenament attdinpunctdevedereteoreticitehnicdarinceeaceprivetecolaborareadintreparteneri. Respingereaunuip.p.isolicitareadectrelaboratorarecoltriiunuinoup.p.decalitate,cares permitstabilireadiagnosticuluimicrobiologic,trebuienelesecaungestnormalatuncicnd anumitereguliderecoltareitransportsuntneglijate. nanumitesituaii,chiardacsuntsesizatediferitedisfuncionalitinceeaceprivetemodul ncarep.p.afostrecoltatitransportatctrelaborator,problemelepotfirezolvateprintelefonsauo discuiedirect,spreexemplunvedereaidentificriiunuip.p.careafostrecepionatfrdatelede identificare.ns,ncazulncareaceastdiscuienupoateconducelastabilireaidentitiip.p., respectivaprobnutrebuieprelucratnlaborator. ncazulncarep.p.afostidentificatdarestenecorespunztordinpunctdevederecalitativ, prelucrareaacestuiaartrebuitemporizat(p.p.meninutla+4C)pnnmomentulncareseia legturacumediculcareasolicitatanalizaiseanalizeazdacrecoltareaarputeafirepetati urmatdetrimitereaunuip.p.corespunztor.ncazulncareonourecoltareesteposibilprimul p.p.sendeprteazisevaprelucraaldoilea.ncazulncarenuesteposibilonourecoltarei seestimeazcprelucrareap.p.chiarnecorespunztorpoateaducevreunbeneficiupacientului examinat,sencearcobinereadatelorcarepotfiobinute(curezervelederigoarecarevorfi menionatenbuletinuldeanaliz). Iatctevamotivederespingereaunuiproduspatologic:

sputrecoltatpeparcursula24deore sputcaredefaptconinesalivisecreiidintractulrespiratorsuperior urinrecoltatcumaimultde60deminutenurm(carenuafostmeninutla+4C) exsudatfaringian,exsudatnazal,sput,urin,materiifecaleetcpentrucaresesolicit izolareaiidentificareagermeniloranaerobi produsepatologicepentrucareesteevidentcontaminarea(deex.datoritunui recipientdecolectarenecorespuztor)etc.

Transportulproduselorpatologice
nceeaceprivetetransportulproduselorpatologiceestesemnificativpropoziiaurmtoare: produselepatologicetrebuiesajungnlaboratorncelmaiscurttimpposibil.Fadeaceast recomandarecucaractergeneral,arfidediscutatoseriedeaspecteconcrete. Transportulctmairapid/sauprelucrareaimediataunuip.p.recoltatchiarlanivelul laboratoruluisuntrecomandatefermdatoriturmtoarelorconsiderente: estenecesarmeninereacondiieiiniialeaprodusuluipatologic(coninutmicrobian, citologieetc)pentruaputeanregistraoimaginectmaiapropiatdeceeaexistentlanivelul procesuluiinfecios diferitelemicroorganismeaudiferitetemperaturioptimepentrusupravieuire celelaltecondiiinecesaresupravieuiriimicroorganismelordifernfunciedefiecare grupdemicroorganismenparte(pH,deshidratare,radiaiiUVsauradiaiisolarengeneral, prezenaoxigenului,prezenasubstanelorantimicrobiene,fenomenedeautolizetc) microorganismeledinfloraasociatsepotmultiplicancursultransportului(deregul mailesnedectmicroorganismelepatogene) utilizareamediilordetransportmodificaspectulcitologicalp.p. estenecesarprevenireacontaminriip.p.precumiprevenireacontaminriimediului externsauapersonaluluicareasigurrecoltarea,transportuliulteriorprelucrareap.p. nanumitesituaii(rezistenamicroorganismuluinmediulexteriorestedeosebitde redus)sevarecomandarecoltareaiprelucrareap.p.lapatulbolnavuluisau,dacesteposibil, pacientulvafiinvitatnlaboratorpentrurecoltare pentrufoartemultedintrep.p.sepoateacceptauntimpdetransportde12ore(repetm propoziiademaisus:p.p.trebuiesajungnlaboratorncelmaiscurttimpposibil) ncazulncaretimpuldetransportalp.p.nupoaterespectaceeaceesteindicatse poaterecurgelaconservareaacestuiadupcumurmeaz meninerealatemperatursczut(containerizotermcugheala0Csaufrigiderla +4C)demenionatcNeisseriameningitidis,Neisseriagonorhoeae,Haemophilusinfluenzaeetc nurezistlaacestetemperaturi utilizareaunuimediudetransport(CaryBlair,Stuartetc/vezicapitolul9) adugareadepenicilin,streptomicinicloramfenicolatuncicndseurmrete

izolareaunuifung(ageniietiologiciaimicozelorcutanatesuperficialepotrezistampachetaten hrtiesteriliintrodusentrocutiePetripnla48deorefrsnecesiteadugareade antibiotice) aspirareap.p.lichidnsering,cueliminarearapidabulelordeaerinchiderea seringiicuajutorulunuidopdecauciucsterilncareintroducemimediatacul(atenielamanevrarea aculuideseringncondiiilerecoltriiunuiproduspatologicuman/riscdenepareitransmiterea altorinfeciiex.HIV)atuncicndurmrimizolareauneibacteriianaerobecarearputeasupravieuin acestcazcirca30deminuteetc transportulctrelaboratorsevarealiza numaidectreuncurierinstruitnacestscop nrecipienteetanepecaresevalipipictogramapentruriscmicrobiologic iarncazulncarep.p.trebuieexpediatprinpotsevorrespectanormativelelegalen vigoareprecumirecomandrilespecialerecunoscutelanivelinternaionaldintrecarecelemai utilizatesuntelaboratedeWorldHealthOrganization(WHO),CenterforDiseasesControland Prevention(CDC)sauNationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards(NCCLS)cumeniunea cprimele2potfiobinutenmodgratuit.

Exemplederecoltareitransportpentructeva produsepatologice
1.Exsudateoticesaunazale pacientulstpescaun,cufaaspresursadelumin(preferabilluminanatural) utilizmtampoanecuvatobinuiteuorumezitecusoluiesalinfiziologicsteril, cevamaimicidectncazulrecoltriiexsudatuluifaringian untamponvafiutilizatpentruexamenmicroscopicdirect untamponvafiutilizatpentrunsmnarepemediidecultur ncazulsuspicionriidifterieisevorutiliza3tampoane tamponultrebuiencrcatctmaibinecup.p.(lrotimrelativfermpesuprafeeleunde esteprezentp.p.) estedepreferatutilizareaimediatap.p.iarncazulncareacestlucrunuesteposibil, tamponulvafitrimisctrelaboratornmediudetransport 2.Exsudatulfaringian serecolteazpreferabildimineaanaintecapacientulsmnnceifrssefisplat pedini,frsfiutilizatgargarismecudiferitesoluii(iardacacestecondiiinuaufostrespectate, recoltareasevafacedupminim4ore) pacientulstpescaun,cufaaspresursadeluminigtulnuoarextensie neaezmpuinlateralfadepacientpentruaevitacontaminareacupicturieliminate ncursulunuieventualaccesdetuse(depreferinvompurtamasciochelari) deprimmbazalimbiicuajutorulunuiapstordelimbsterilincondiiideiluminare adecvatexaminmfaringeleposterior,pilierii,amigdalelepentruasesizacaresuntzonele inflamate(roii,cudepozite,ulceraiietc)ieventualeledepozitepurulente

utilizmutilizmtampoanecuvatobinuite untamponvafiutilizatpentruexamenmicroscopicdirect untamponvafiutilizatpentrunsmnarepemediidecultur ncazulsuspicionriidifterieisevorutiliza3tampoane solicitmpacientuluispronunevocalaAiprintromicaredetergere,circular, ferm,recoltmsecreiadelanivelfaringian,amigdalianinsistndnzoneleundeexistulceraii, depozite(ncazulncareseremarcprezenauneifalsemembraneodetamcugrijnspre periferieirecoltmsecreiacareexistsubaceaststructur) trebuiesevitmatingereabazeilimbiisauapalatuluimoale estedepreferatutilizareaimediatap.p.,sauncelmult13orencazulncareacest lucrunuesteposibil,tamponulvafitrimisctrelaboratornmediudetransport

3.Sputa ndiagnosticulmicrobiologicalinfeciiloracutealecilorrespiratoriiinferioare(IACRI)se potexamina prelevatecaresepotcontaminancursulrecoltriicuflorabacteriannormal:sput, tamponnazal/faringian,aspiratnazal/faringian,aspirathipofaringian,produsrecoltatprin bronhoscopiesimpletci/sau prelevatecarepermitevitareacontaminriiorofaringiane:aspirattranstraheal,aspirat transtoracic,aspiratbronhoscopicprincateterprotejatcucanuletelescopate/lavajbronhoalveolar, biopsietransbronic,biopsiepulmonarpetoracedeschis,aspiratpleural,hemoculturi cutoatecestecontaminatcufloranormalorofaringian,sputareprezintprodusul patologicrecoltatcelmaifrecvent,nmajoritateaIACRI.Sepotobineprobecalitativ corespunztoarenmomentulncarepacientulseprezintnunitateasanitar(esterecomandabil sserecoltezeprimasputeliminatmatinalinniciuncazsputadin24deore).Pacientul trebuiesneleagdiferenadintre"aexpectora"i"atuiiscuipa". nainteaprelevriiserecomandperiajulsimplualdinilor,cltireaenergicaguriii gargaracuap(saucusoluiesalinfiziologic) dacprobaapareconstituitnprincipaldinsaliv,trebuiessolicitmimediatpentru prelevareauneinoiprobecarespermitulteriordefinitivareadiagnosticului.nIACRIoprob mucopurulentnvolumde23mlarputeafisuficient. stimulareaexpectoraieiprininhalareadeaerosolicalzicusoluiesalin(3%)ofer,de regul,probecitologicnesatisfctoare(sputaindusarputeafiutilnizolareaPneumocystis carinii).ncazulncaresepresupuneoinfeciemycobacteriansaufungicesterecomandat recoltareaiprelucrareaa3produse,n3zileconsecutive. splareasputeiintensmucopurulente(n3bisuccesivedesoluiesalinizoton) reducecontaminareaorofaringianfrainfluenasemnificativconcentraiabacterieiinfectante prinsntramafibrinoasaprobei.Fluidifierea(deex.cuNacetilLcistein)permiteomogenizarea produselorpatologiceserealizeaznctevaminute. ncazulsuspicionriiuneiinfeciifungice,probelefluideseconcentreazprin centrifugare20deminutela3000rot/min.,apoiseexamineazsedimentul.Dinprobelebiopticese disecmicifragmentesuspectecuvolumedecirca1mmcaresuntapoiexaminatela

stereomicroscop(mrire30).esutulcazeos,fibrosigrsimeaascundnmodfrecventhifeleiar tratareacuKOHnuclarificpreparatulfiindnecesardisociereaiomogenizareaprobei. produselepatologicerecoltatepentrudiagnosticulmicrobiologictrebuietransmise promptctrelaborator(preferabilnmaxim1or,acceptabiln12ore) produselerecoltatentrunrecoltorsterilde50200ml,cucapaccarepermiteo nchidereetan,suntetichetateiexpediateimediatlalaboratorpentruafiexaminate.Nuexist modalitioptimedeconservareaprobelor.Meninerealaotemperaturde4Cprevinemultiplicarea contaminanilor,conservuniipatogeni,darscadepnlaanulareansadeizolareaaaltora(ex.H. influenzae,N.meningitidis). utilizareaunuimediudetransportperturbraportuldintrebacteriiireperelecitologice aleprobei,esenialepentruapreciarecalitiiprobeiiinterpretarearezultatelorsputoculturii,darn cazulncareseapreciazcsevadepitimpuldetransportrecomandatsepoateutilizamediul StuartsauAmies.ncazulncareseurmrete,spreexemplu,izolareaM.pneumoniae,cultivarea trebuiefcutctmairapidprodusulpatologicpoateficonservatmaxim4orenlipsaunuimediu specialipnlamaxim24deoredacseutilizeazmediuldetransportpentrumolicute.ncazul ncarearfinecesaroconservareprelungit,estenecesarutilizareauneitemperaturide70C(n niciuncaztemperaturacongelatoruluiobinuit). 4.Puroiul existnumeroasecondiiiclinicencareaparsupuraii(superficialesauprofunde)iar tehnicaderecoltarevariaznfunciedeorigineapuroiului(arsuriiplgisuprainfectate,abcese, flegmoane,fistuleetc) esterecomandatcapentrurecoltaresfolosimtampoanecuvatsterilenumaincazul ncarenuavemoaltsoluie puroiulpoatefirecoltatcuansabacteriologic,pipetaPasteur,prinbiopsiere,chiuretare sau,atuncicndestevorbadecoleciiprofunde,prinpuncieiaspirare nspecialpentrusituaiilencarevomrecoltap.p.dintrocolecieprofund,colaborarea ntreclinicilaboratortrebuiesfiefoartebun atuncicndsuspicionmoinfeciecumicroorganismeanaerobesuntnecesarepregtiri specialeicelpuinutilizareaseringiicaresenchidecudop(vezimaisus)existgermeni anaeobicarepotfidistruinctevasecundedecontactcuoxigenul transportulctrelaboratorsevarealizautilizndmediidetransportsaucontainere speciale(pentruasigurareaanaerobiozei)p.p.trebuiesfieprelucratn12ore 5.Materiilefecale(vezicapitolul28) 6.Urina(vezicapitolul29) 7.Sngele(vezicapitolul31) 8.Lichidulcefalorahidian serecolteazncazulsuspicionriiprezeneiunuisindrommeningeal,dupexaminarea funduluideochi(verificmpresiuneanarteracentralaretinei,semnedestazpapilar) suspiciuneaesteridicatdemediculdespecialitate(boliinfecioase,neurologie, medicininternetc)iarrecoltareasevafacelapatulbolnavuluidectremediculcareare competenadeaexecutaaceastmanevr(ex.prinpuncielombar) tehniciledeasepsietrebuiesfieriguroasentoatesituaiile,darncazulrecoltriiLCR ateniatrebuiesfieimaisporit

chiardacacestmanualdelucrripracticeseadreseaznumaiinfeciilorbacterienei fungice,trebuiesprivimlucrurilenansamblulloridreptexemplu,snuuitmcexist meningiteinfecioaseimeningiteneinfecioaseiarmeningiteleinfecioasepotfifungice,bacteriene, parazitare,virale,prionicenplus,pentruelucidareaetiologieiuneimeningiteestenecesar efectuareaunorexaminribiochimiceadiacentecelorcitologiceimicrobiologiceastfelncteste dedoritrecoltarea(laadult)auneicantitide510mlLCRrecoltareap.p.esteinvazivivatrebui sfimnstaresexecutmtoatetestelenecesarefrasolicitarepetareapuncieilombare recomandmrecoltareaLCRn23tuburisterile(2tuburivorficentrifugateiardinal treileatubsevorrealizatestelebiochimiceialtetesteutilepentruasugeraetiologia)dacLCR estefrancpurulent,examenulmicroscopicdirectsefacefrcentrifugare nmodideal,LCRtrebuieprelucratimediat,cualtecuvinterecoltareaiprocesareap.p. trebuiesnceaplapatulbolnavuluirecomandmcapelngtrusanecesarmanevreide recoltaresavemladispoziieospirtier,stativepentrueprubete,mediideculturdiverse (agarsnge,Lwenstein,Sabouraudetc) dacLCRurmeazafitransportat,transportultrebuiessefacctmairapidilao temperaturapropiatdetemperaturacorpuluiuman(nniciuncazla+4CattHaemophilus influenzaectiNeisseriameningitidis,agenietiologicirecunoscuiaimeningitelorbacterienesunt distruiprinrefrigerare) unalmotivnfavoareaunuitransportioprelucrarefoarterapidaLCRestereprezentat destudiulcitologicalp.p.imaiprecisdenumrarealeucocitelorpolimorfonuclearecarenceps fiedistrusennumrsemnificativncdinprimele3060minuteduprecoltare 9.Secreiirecoltatedelanivelulaparatuluigenital existmaimultetipuridesecreiicarearputeafirecoltatenfunciedemanifestarea clinicnmaterialuldefavomdiscutadoaropartedintreacestea ncazulsecreieiuretrale,labrbat recoltareap.p.trebuiessefacdimineaa,naintedemiciune,saulacelpuin2ore dupaceastancazulncarepacientulnuseprezintdimineaainuesterespectatcondiiade maisusiardup2oredelamicionaresecreiaestencantitatepreamic,ivomrecomandas consumectmaipuinelichidenrestulzileiisrevinndimineaaurmtoare,naintedemiciune suntnecesaretampoanedevatsterile(untamponpentruexamenulmicroscopicial doileapentrucultivare)sau,alternativoansbacteriologicsterilesterecomandabilcaansas aibfirulibucladeplatin(sauarputeafioansbacteriologicdeunicntrebuinare) seobservpenisulimeatulurinarprecumidacexistsecreieuretral dacexistsecreieuretral,aceastaesterecoltatcutamponul(saucuansa) ncazulncarenuseevideniazsecreieuretralnmodspontan,cumnaprotejatde omnudelatex,exprimmuretrautiliznddegetulmareiindexulirecoltmsecreiacare apare dacniciprinaceastmanevrnuputemobinep.p.vomrecurgelarecoltarea intrauretralcutamponul(saucuansa) nacestscopsuntnecesaretampoanededimensiunimaimici,preferabildinalginatde calciu(saudacronnsuspiciuneauneiinfeciicuChlamydiaspp.sauMycoplasmaspp.)dup introducereablnd,pecirca2centimetrilungimeirotireaintrauretralaprimuluitampon,aldoilea tamponvafiinseratcuaproximativ1centimetrumaiprofund

nsuspiciuneadegonoreeserecomandcultivareaimediatduprecoltarepemediulde culturnclzitla37Cncazulncareacestlucrunusepoaterealiza,tamponulcup.p.vafi transmislaboratoruluinmediudetransport(ex.mediulStuartpentruNeisseriagonorhoeaesaualte variantepentruChlamydiaspp.sauMycoplasmaspp.) ncazulsecreiilorcervicale,lafemei recoltareasevafacepreferabilnprimele10ziledupciclulmenstrual,pemasa ginecologic,dupintroducereavalvelorginecologiceiexaminareavizualavaginuluiicolului uterin dacseremarcosecreiepurulent,cuajutorulunorcompresesterilesendeprteaz secreiadelaniveluicoluluiextern folosim3tampoanesterileintroduseirotiteuor12centimetrincoluluterin(2dintre tampoanelevomutilizapentrufrotiuriGramiGiemsaiaraltreileapentrucultivareprocedndaa cumammenionatmaisus). 10.Diferitep.p.recoltatensuspiciuneaunorinfeciifungice ninfeciilefungice,nfunciedelocalizaresepotrecoltap.p.foartevariate spreexemplu,nmicozelecutanatesuperficiale dupantiseptizarealeziuniicualcoolmedicinal(70)raclmtegumentuliutilizm pentruexaminarescuameleproduse attscuamelectialtestructuri(firedepr,fragmentedeunghieetc)se mpacheteaznhrtiesterilcareseintroducentrocutiePetriisetrimitepentruprelucrarei examinarenlaborator(nmaxim48deore) nmicozeleprofunde,nfunciedelocalizare recoltmp.p.iltransmitemctrelaboratoravndgrijsprevenimdeshidratarea produsului serecomandprelucrareaiexaminareaimediat(uniifungisuntfragiliestededorits putemevaluasituaiafungilorfoarteaproapedemomentulrecoltriipentruaputeanelegecarea fostsituaiainvitro) iarncazcontraradugmpenicilin,streptomicinicloramfenicolpentruinhibarea multiplicriibacterieneimeninemp.p.la+4C(supravieuirealaaceasttemperaturdepindede fungulimplicatipoatevariadelaorela2sptmni,aacumsentmplncazulunorfungi dimorfi). Aacumammenionat,dateleprezentatenucuprindtoateposibilitileivariantele.Am ncercatsdmdoarctevaexemplecaresuntorientative.Pentruceiinteresaiexistmanuale dedicateexclusivrecoltriiitransportuluiproduselorpatologice,nmicrobiologie. Pentrutreidintrep.p.amalesoaltmodalitatedeprezentare.Recoltareaurinii,materiilor fecaleisngeluivafidiscutatnparteaspecial.

7. Preparate microscopice, frotiuri i principalele

coloraii utilizate n microbiologie

Microorganismelestudiateaudimensiunifoartemici,deordinulmicronilor,astfelnctpentru examinarealorestenecesaromriredecirca1.000X,aacumvomdiscutaincapitolul urmtor.Existdiferitetehniciprincaresepoatepunenevidenprezenaunormicroorganisme ns,demareutilitateesteexamenulmicroscopiccaresepoateadresaunorpreparate microscopiceproaspete(umede,ntrelamilamel)sauunorfrotiurifixateicoloratenfunciede suspiciuneadiagnostic,p.p.examinatetc. nschemageneraldediagnosticmicrobiologic(direct)vomexaminamicroscopicprodusul patologic(etapaa2a)saucoloniaaprutpemediuldecultur(etapaa4a,punctulb, identificareapebazacaracterelormorfotinctoriale). Uneoriexamenulmicroscopicestedecisivpentrudiagnostic,alteoriareunrolorientativ,ns, chiardinaldoileaandestudiuarfibinecaviitoriimedicisneleag,reiniulteriorsaplice celenvate,indiferentdespecialitateapecareovorurma.

Preparatemicroscopiceproaspete(umede,native,ntre lamilamel)
estedepreferatsfolosimlameilamelenoisupuseurmtoarelorprocedurisuccesive (imersarenamestecsulfocromicctevazile,splare,cltire,pstrarenalcool50%) lameleseusuc(folosimocrpcurat)apoisedegreseazsuplimentarprinflambare (treceredectevaoriprinflacrabeculuiBunsen) depunempelamopicturdinprodusulcareurmeazafistudiat dacprodusulpatologicareconsistenlichidian(ex.urin,sedimenturinar,materii fecale,LCR,serozitatedinancrupresupussifiliticetc)vafiutilizatcaatarepentruomaibun vizualizareputemadugaalbastrudemetilen,lugol,tudeIndia,nigrozinetc dacculturaesterealizatnmediulichid(ex.pentruLeptospiraspp.)sevautilizaca atare dacvremsstudiemspreexemplumobilitateamicroorganismelorcareauformat coloniipeunmediusolidvomdescrcaoansdincolonientropicturdesoluiesalin fiziologic,apdistilatsaubulion dacp.p.esterecoltatntrosuspiciunedemicozsuperficial,pelamademicroscop sevadepuneopicturdintrosoluie1020%KOHglicerolncaresevadescrcaidispersap.p dacvremsstudiemaspectulfungilorfilamentoi(mucegaiuri)dintrocolonie,pelam sevadepuneopicturdesoluielactofenolalbastrucotonncarevomdescrcaunfragmentdin periferiacolonieirespective acoperimpicturacuolamel celmaifrecventpresmuorlamelapentruaeliminaeventualelebuledeaer ncazulp.p.recoltatntrosuspiciunedemicozsuperficial,nclzimuorpreparatul printrecerecugrij,de23ori,pedeasupraflcriibeculuiBunsen dacvremsstudiemaspectulfungilorfilamentoi(mucegaiuri)dintrocolonie,nu trebuiesmicmsauspresmlamela nmicroscopiaopticpecmpluminosaezmpreparatulpeplatinamicroscopuluii

examinminiialcuobiectivul10,apoicuobiectivul20sau40(nufolosimobiectivuldeimersie) sepotfolosiialtetehnicimicroscopice.

Frotiuri(preparatemicroscopicefixateicolorate)
Structurapereteluimicrobiandeterminoanumitafinitatefadecolorani,ceeacepermite examinareaidifereniereabacteriilorsaufungilornfrotiuri. frotiurilesepotrealizaporninddelaprodusepatologice(recoltatedelaomsaudela animaledeexperien)saudinculturamicrobian(nmediulichidsausolid) frotiultrebuientinsnstratctmaisubire(preferabilnunistrat) estedepreferatsfolosimlameilamelenoisupuseurmtoarelorprocedurisuccesive (imersarenamestecsulfocromicctevazile,splare,cltire,pstrarenalcool50%) lameleseusuc(folosimocrpcurat)apoisedegreseazsuplimentarprinflambare (treceredectevaoriprinflacrabeculuiBunsen) Executareafrotiurilordinp.p.cuconsistenfluidsaudinculturimicrobienerealizaten mediudeculturlichid dupceamflambatlama,oaezmcuparteaflambatnsus sterilizmansabacteriologiciateptmsserceasc prelevmasepticp.p./culturidepunemprodusulncentrullamei ntindemprinmicridedutevino(dehaurare)peaxullungallameiprodusul prelevat,nstratctmaisubire,avndgrijsnuneapropiemdemarginilelamei/ntinderease poatefaceiprinmicricirculare,excentrice lsmlamasseusucelngbeculdegaz(nugrbimuscareaprineventualetreceri alefrotiuluiprinflacr)ncazulncareavemndotareundispozitivncarelamasepoateaeza iuscala+70C,vomutilizaaceastmetod fixmfrotiulexistmetodechimicedefixare,nscelmaifrecventfolosimfixareaprin cldur,distrugndnacelaitimpimicroorganismele(careprezintoafinitatetinctorialmai maredectcelulelevii) nacestscop,trecemfrotiulprinflacr(aacumamprocedatipentruflambarea lamei,naintedeexecutareafrotiului)nsdeaceastdatparteapecareamntinsp.p.saucultura esteorientatnsuscaomodalitatedecontrol,atingemdosulminiiculamaflambatiar temperaturaatinsprinflambarenutrebuiesfiemaimaredectpecareoputemsuporta frotiulfixatestegatapentrucolorare Executareafrotiurilordinp.p.cuconsistensolidsaudinculturimicrobienerealizate nmediudecultursolid dupceamflambatlama,oaezmcuparteaflambatnsus cuajutorulflaconuluicupicurtorsaucuansabacteriologicsterilizatircit depunemncentrullameiopicturdesoluiesalinfiziologicsauapdistilat sterilizmansabacteriologiciateptmsserceasc prelevmasepticp.p./unfragmentdincolonieidepunemprodusulnpicturadefluid depelam

omogenizmfoartebinep.p./fragmentuldecolonienpicturadefluid procedmcamaisuspentruntinderea,uscareaifixareafrotiului Executareaamprentelordeorgan/altep.p. flambmlama cuparteaflambatatingemsuprafaadeseciuneaorganuluirespectiv lamasepoateaplicaipesuprafaadeseciuneaunorprelevatebiopticesauobinute prinnecropsie procedmcamaisuspentruuscareaifixareafrotiului

Colorareafrotiurilor
Existfoartenumeroasemetodedecolorareafrotiurilor.Dintreacesteavomprezentadoar ctevadintrecoloraiilefolositemaifrecvent. nvedereacolorriiavemnevoiedeotruspentrucolorare(stativdecolorare,coloraniconform reeteidecolorare,apdistilatsauapcurentpentrusplare,stativdeuscare). Pentrucolorareafrotiurilordinproduspatologicfolosimcelmaifrecventcoloraiilecu albastrudemetilen(A.M.),Giemsa,Gramidupcaz,ZiehlNeelsen.nfunciedesuspiciunea diagnosticip.p.examinatsepotfolosiialtecoloraii(deex.coloraiaGimenezpentru depistarearickettsiilorpeamprentedeorgandelaanimaleinfectateexperimentalsaucoloraiacu albastrudetoluidinpentruevideniereaPneumocystiscarinii). ncazulmultoradintrecoloraiileuzualeaufostrealizatediferitemodificrinfunciede experienaautoriloriscopulurmrit.Deex.coloraiacuA.Mpoateaveaurmtoarelevariante: albastrudemetilenLfflerpentrucelemaimultecoloraiisimplesaucaunaldoilea colorantncoloraiaZiehlNeelsen albastrudemetilenpolicrompentruevideniereaBacillusanthracisnp.p.,pentru corynebacteriisaunlocuindcoloraiademaisus albastrudemetilen(variantaWayson)pentrup.p.,cuosensibilitatemaibundect utilizareaA.M.Lffleretc. ncursullucrrilorpracticeprecuminmanualuldefasevadiscutanumaicteovariantcu referirelaprincipalelecoloraiifolositenmicrobiologie.Ceiinteresaiauladispoziiepentrustudiu unbogatmaterialteoreticiardupncheiereaantrenamentuluipersonalnceeaceprivete realizareadefrotiuriicoloraii,fiecarevaputeaalegeovariant,aplicabilnfunciedesituaie. PentrucolorareafrotiurilorobinutedinculturvomfolosinspecialcoloraiileGram, ZiehlNeelsenialtecoloraiispecifice,dupcaz(coloraiipentrucili,capsul,sporietc).

Coloraiacualbastrudemetilen
acoperimfrotiulcusoluiedealbastrudemetilen,pentru34minute(nuarerosts acoperimcucolorantlamanntregime) splmcuapdistilatsauapdelarobinet aezmfrotiulnstativpentruuscare(depreferat)saugrbimuscareaprintamponarecu

sugativsauhrtiedefiltru examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm

ColoraiaGiemsa
fixareafrotiuluinusefacelacaldcichimic,cualcoolmetilic(deex.timpde1minut) scurgemlamaiateptmevaporareaalcooluluimetilic acoperimfrotiulcusoluieMayGrnwald(diluatnpriegalecutamponfosfat),pentru 3minute nclinmlamaiscurgemsoluiacolorant(careareirolfixator) acoperimfrotiulcusoluieGiemsa,pentru10minute splmcutamponfosfat ateptmcafrotiulsseusuceiexaminmcuunobiectivintermediardaccolorarea celulelorestemaislabdectceaateptatacoperimdinnoufrotiulcusoluieGiemsa,nc10 minute splmcutamponfosfat aezmfrotiulnstativpentruuscare(depreferat)saugrbimuscareaprintamponarecu sugativsauhrtiedefiltru examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm

ColoraiaGram
dilumntrunrecipientfucsina(9priapdistilat/1partefucsin) acoperimfrotiulcuvioletdemetilsaucristalviolet(violetdegeniandinpunctdevedere istoric),pentru13minute(nuarerostsacoperimcucolorantlamanntregime) ndeprtmcolorantul acoperimfrotiulculugol(mordant,fixator)pentru13minute ndeprtmlugolul acoperimfrotiulcuunamestecdealcoolaceton(1parteaceton/3prialcoolde 96)pentruuntimpfoartescurt,78secunde splminsistentcuapdistilatsauapdelarobinet acoperimfrotiulcufucsinadiluat1/10pentru1minut splmcuapdistilatsauapdelarobinet aezmfrotiulnstativpentruuscare(depreferat)saugrbimuscareaprintamponarecu sugativsauhrtiedefiltru examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm

ColoraiaZiehlNeelsen
Esteocoloraieutilnidentificareaprezeneidebaciliacidalcoolrezisteni(BAAR), solubilizndperetelebacterianprincretereatemperaturii,facilitndpenetrareacolorantului. punemfrotiuluscatifixatpeunsuportsituatdeasupratvieidecolorare acoperimcompletlamacufucsinbazicnediluat(filtratextemporaneu) trecembeculdegazaprinspesublamaacoperitdefucsin,pnncepeemitereade vapori(nuatingemtemperaturadefierbere).ncazulncarelamanumaiesteacoperitcompletcu fucsin,adugmcolorant.Timpuldelucruestede10minute,perioadncarerepetmde3ori operaiadenclzirealameipnlaemitereadevapori. splminsistentcuapdistilatsauapdelarobinet adaugmamesteculdecolorantacidalcool(3mlacidclorhidricconcentrat/97mlalcool

etilic9095),pentru23minute splmcuapdistilatsauapdelarobinet recolormcualbastrudemetilen,1minut splmcuapdistilatsauapdelarobinet aezmfrotiulnstativpentruuscare(depreferat)saugrbimuscareaprintamponarecu sugativsauhrtiedefiltru examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm

ColoraiaKinyoun
EsteocoloraieutilnidentificareaprezeneideBAAR,frautilizanclzireancursul etapelordecolorare(coloraielarece). acoperimlamacompletcuohrtiedefiltrudecupatnacestscop picurmsoluiedefucsinfenicatKinyounpncndhrtiadefiltrusembibcomplet iateptm5minute ndeprtmhrtiadefiltru splminsistentcuapdistilatsauapdelarobinet acoperimlamacuamesteculdecolorantacidalcoolpentrucirca30secundevrsm amesteculdecolorantirepetmoperaiapentrunc30secunde splminsistentcuapdistilatsauapdelarobinet acoperimfrotiulcualbastrudemetilen,pentru1minut(nuarerostsacoperimcu colorantlamanntregime) splmcuapdistilatsauapdelarobinet aezmfrotiulnstativpentruuscare(depreferat)saugrbimuscareaprintamponarecu sugativsauhrtiedefiltru examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm

Coloraiifluorescente
Existmaimultevariante,inclusivcoloraiincareseutilizeazanticorpimarcaifluorescent. VomprezentancontinuarecoloraiafluorescentcuauraminO.Esteocoloraieutiln identificareaprezeneideBAAR(sensibilitatecrescut). colormcusoluiedeauraminO(amestecdeauraminO,alcooletilic,fenol,ap distilat),pentru15minute splmcuapdistilat decolormcuamestecdeacidalcool,pentru5minute splmcuapdistilat contracolormcusoluiedepermanganatdepotasiu,pentru2minute splmcuapdistilatsauapdelarobinet aezmfrotiulnstativpentruuscare(depreferat)saugrbimuscareaprintamponarecu sugativsauhrtiedefiltru examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm

ColoraiaGimenez
Esteocoloraieutilnidentificarearickettsiilorpeamprentedeorgandelaanimaleinfectate experimentalsaunculturiprecumipentruidentificareaincluziilordeChlamydia trachomatissauChlamydiaspp. acoperimlamacuxilol,pentru5minute

ndeprtmxilolul acoperimlamacualcooletilic(96),pentru23minute ndeprtmalcoolul acoperimfrotiulcusoluiadefucsinfenicatpreparatdupreetaGimenez,pentru12 minute,fucsinasepicurpefrotiuprintroplnieprevzutcuohrtiedefiltru splminsistentcuapdistilatsauapdelarobinet acoperimfrotiulcusoluiedeverdemalachit,pentru69secunde splminsistentcuapdistilatsauapdelarobinet aezmfrotiulnstativpentruuscare examinmlamicroscop,notmobservaiile,interpretm. ncapitolulurmtor,dupprezentareamicroscopuluioptic(ncmpluminos),vomenumerao seriededateprivindstructurilecarepotfiobservate.

8. Tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic

Microscopulesteuninstrumentabsolutnecesarnvedereastabiliriiunuidiagnostic bacteriologicdirect(existtehnicidemicroscopiecarepotfiutileindiagnosticulmicrobiologic indirect).Existmaimultecategoriidemicroscoape.nmoduzualexamenulmicroscopicutilizeaz microscopuloptic(microscopiaopticpecmpluminos).nanumitesituaiisepoaterecurgela microscopiacufondnegru,microscopiacucontrastdefazsaulamicroscopiacufluorescen.n cazulutilizriiultimelortreitipuridemicroscopestenecesarocamerobscur.Microscopia electronic,microscopiaprotonicsaualtetehnicisofisticatedemicroscopienufacobiectul materialuluidefa(acestetehniciarputeafiutilizatencercetare,deex.pentruaevidenia interrelaiadintrebacterieibacteriofag).

Microscopulopticimicroscopiaopticpecmpluminos
Microscopulopticesteuninstrumentcarepermiteobservareaobiectelormaimicidectcele carepotfivzutecuochiulliber(sauculupa).Microscopulformeazimaginivirtuale,mritei rsturnatealeobiectuluicuajutorulunuisistemdelentileobiectividelentileocular. Distanaminimdintredoupunctealeunuiobiectcaremaipotfivzuteseparatunulde celalaltprinmicroscopeste:

undelreprezintlungimeadeundaradiaieifolosite,nesteindicelederefraciealmediului strbtutderadiaientreobiectioculariaruesteunghiuldintreaxaopticirazelecelemai ndeprtatedeaxcaremaiptrundncnobiectiv.Pentruamicoraaceastdistanirespectiv pentruambuntiperformanelemicrosopuluiexistmaimultemetodedintrecarevommeniona dou,utilizateinstudiulmicrobiologic:

utilizareaunorradiaiiculungimedeundlctmaimic(deex.pentruradiaia ultravioletsepotdistingeobiectecudimensiunide0,15mm) mediultransparentdintreobiectiobiectivsaibunindicederefracienctmaimare (aacumseprocedeazncazulmicroscopuluicuimersie). nmicroscopiaopticpecmpluminosluminaestetransmisdealungulaxuluioptical instrumentului,prinpreparat,nacestecondiiiobinnduseuncmpvizualputernicluminat,ncare obiectele,pentruaputeafivzute,sedistingpefondulluminosfieprinopacitate,fieprinculoarea lor(nspecialduputilizareaunortehnicidecolorareaserevedeacapitolul7). Potfirealizateimsurtoricuajutorulmicrometrelor(utilemaimultndiagnosticul parazitologic)micrometrelesuntplcuedesticlpecaresuntmarcatescalefindivizate,de dimensiunicunoscute,acrorimaginesepoatesuprapunepesteimagineaobiectuluidecercetat.

Prilecomponentealemicroscopuluioptic
Microscopulopticareurmtoareleprilecomponente: 1.Piciorulmicroscopului,alctuitdintromasmetaliccuroldesusinere,pecarese sprijinplatinamicroscopului.Peplatinamicroscopuluiseaeazapreparatul.Platinaprezintun orificiucentralcarepermitetrecerearazelorluminoaseiorificiilateralencaresuntprinicavalerii cuajutorulcrorapreparatulestefixatpeplatin.Cuajutorula2uruburicesegsescsub platform,aceastasepoatedeplasape2direciiperpendiculare. 2.Tubulmicroscopuluisusineocularuliobiectivul.Tubulpoatefideplasatmairapidi grosiercuajutorulmacrovizeiimailentifincuajutorulmicrovizei.Lacaptulsuperioraltubului sepotpuneocularecudiverseputeridemrire,caresepotschimbauor.Frecventutilizmn microbiologieocularecuputereademrire10x. Obiectivulsemonteazanrevolver,situatlacaptulinferioraltubului.Revolverulesteun suportspecialcarepermitemontareamaimultorobiectiveiinterschimbarealorprinrotire. Obiectivulestecompusdintrunsistemcentratdelentileaezatentruntubmetaliccarese nurubeazlarevolver.Putereaseparatoareamicroscopuluiestedeterminatdeputerea separatoareaobiectivuluiacruiputeredemrireestecuattmaimarecuctdistanafocala acestuiaestemaimic. Existobiectiveuscate(ex.10x,20xsau40x)icuimersie(ex.90xsau100x).Obiectivele uscateprimescfascicululdelumincetreceprinpreparatdirectprinaer,astfelcopartedin razeletrimisedeobiectctrelentilaconcavsepierdprinfenomenuldereflexietotal.Pierderea razelordelumindatoritacestuifenomensepoatenlturaprininterpunereantrelameli obiectivauneipicturideuleidecedrusaudealtlichidcuindicederefracieapropiatdecelal sticleidincareestefcutlentilafrontalaobiectivului,aacumsepetrecencazulobiectivelorcu imersie,foartefrecventutilizatenmicrobiologie. 3.Dispozitivuldeiluminareesteformatdinoglindicondensator. Oglindaareroluldeadirijarazeledelasursadeluminspreaxulopticalmicroscopului prezintosuprafaplaniunaconcaviestefixatpeunsuport,naafelnctsepoateroti njuruladouaaxeperpendiculare 4.Condensatorulcareesteformatdin23lentilecuajutorulcroraluminareflectatde

oglindesteconcentratasupraobiectuluifasciculululparalelderazedelumincarecadepe condensatordevineconvergent.Pentruaobineoimagineclar,condesatorulsepoatedeplasape verticalpncndobiectulsegsetenfocarulfascicululuiconvergentcareiesedincondensator. Razeledelumin,naintedeintrareancondensator,trecprintrunsuportdefiltreiodiafragmiris (diafragmdeapertur).Condensatorulcontribuienmodeseniallaluminozitateaimaginii.

Examinareafolosindmicroscopulopticncmpluminos
1.Examinareaunuipreparatproaspt(ntrelamilamel) Pelamsedepuneopicturdinsuspensiacareurmeazafiexaminat,seacopercuo lamel,seaeazpeplatinamicroscopuluiisefixeazcuajutorulcavalerilor. Condensatorulestecobortcirca1,5cmsubplatin,diafragmulestesemideschisiar obiectivul40Xestecobortpndeasupralamelei(privindprinlateral). Privindprinoculare,rotimfoartencetmacrovizaridicnduortubulmicroscopuluipnapare cmpulmicroscopic.Punemlapunctimagineacuajutorulmicrovizeiireglndluminaprin modificareafanteicondensatorului. Sepotexaminaastfel:sedimentulurinar,materiifecaleproveninddelaunpacientcudiaree, suspensiidebacteriicaresepresupunecsuntmobile,preparateumederealizatencazul suspicionriiuneimicozecutanatesuperficialeetc sedimenturinar/putemvizualiza:celuleepiteliale(malpighiene,vezicale,uretraleetc), celulesanguine(leucocite,hematii),cilindriiurinari(hialini,leucocitari,eritrocitari,epiteliali,granulari etc),cristaleurinare,levuri(eventualnmugurite,cublastoconidii),Trichomonasvaginalisetc examenulsedimentuluiurinarestefoarteutil preparatmontatnsoluieKOH/putemvizualiza:levuri(numr,form,dimensiuni), blastoconidii,atroconidii,pseudohife,microorganismeasociate preparatcoloratcutudeIndia(coloraienegativ)/putemvizualiza:levuricapsulate, nconjuratedeunhalouclarpefondulntunecatalpreparatului,ex.Cryptococcusneoformans ncazulncareseurmretemobilitateamicroorganismelor,trebuiesputemdeosebi micarearealdemicareabrownian(oscilaiepelocaparticulelor)urmrimrepereleaflaten vecintateamicroorganismeloretc. 2.Examinareaunuipreparatfixaticolorat Frotiulseaeazpeplatinamicroscopuluiisefixeazcuajutorulcavalerilor. Centrmzonapecaredorimsoexaminm.Procedmcamaisusutilizndobiectivul40x alegemcmpulpecarelvomexaminaulteriorcuobiectivulcuimersie(deex.uncmpncare sesizmprezenaleucocitelor). Ridicmtubulmicroscopului,punemopicturdeuleidecedrupelam,nzonapecare urmeazsoexaminm.Condensatorulesteridicatpnsubplatinamicroscopuluiiare diafragmuldeschis. Privinddinlateral,folosimmacrovizaicobormobiectivulcuimersie(90xsau100x)pn atingemsuprafaalameirealizndcontactulicuuleiuldecedru.Manevratrebuierealizatcugrij pentruanuspargefrotiul. Privimprinoculareirotimfoartencetmacrovizaridicndfoartencettubulmicroscopic,pn

prindemimagineacmpului.Cuajutorulmicrovizeipunemlapunctimaginea. Sepotexamina:morfologiacelulelordinprodusulpatologic,prezenaleucociteloridac acesteasuntmodificate,prezenabacteriiloridispunereaacestora(ex.intrasauextraleucocitar), morfologiabacteriilor,morfologiaunorparazii,morfologialevurilor,aspectulfrotiurilordesngeetc frotiucoloratcualbastrudemetilen(A.M.)/putemvizualiza:bacteriicoloratenalbastru nchis,ncazulbacteriilorcapsulate,aceaststructurvaapreacaunhalounecolorat,celule diferite(nfunciedesediulrecoltrii)iceluleinflamatoriipentrucarenucleulaparentroculoare albastrumainchisntimpcecitoplasmaaparecunuanedealbastrucoloraiacuA.M.permiteo maibundifereniereadetaliilorstructurale frotiucoloratGiemsa/putemvizualiza:hematii(rozroii),polimorfonucleareneutrofile (citoplasmroz,granulaiibrune,nucleuviolaceu),polimorfonucleareeozinofile(citoplasmroz, granulaiibrune,nucleuviolaceu),limfociteimacrofage(citoplasmalbastr,nucleuviolaceu), bacteriicoloratenviolet,formetroficedePneumocystiscarinii(nucleurou,citoplasm albastr),Histoplasmacapsulatumncitoplasmacelulelorfagocitare(levuricoloratenrou), incluziunideChlamydiatrachomatis(corpusculiireticulaiaparalbatri,corpusculiielementariapar roii)etc frotiucoloratGram ncazulncarefrotiulafostrealizatdinculturpurputemvizualizamicroorganismecu aceeaiform,aceleaidimensiuni(excepieProteusspp.),oanumitdispoziie,cusaufr capsul(halounecolorat),grampozitive(coloratenviolet)saugramnegative(coloratenrou), levurilesecoloreaznviolet ncazulncarefrotiulafostrealizatdinproduspatologicputemvizualizacelulediferite (nfunciedesediulrecoltrii)iceluleinflamatoriipentrucarenucleulicitoplasmaaparndiverse nuanederou,bacteriigrampozitivei/saugramnegative,fibrinilevuricaresecoloreazn violetetc frotiucoloratZiehlNeelsensauKinyoun/putemvizualiza:bacilideculoareroie,relativ fini(ncazulprezeneiBAAR),altebacterii(neAAR),celulediferite(nfunciedesediulrecoltrii)i celuleinflamatoriideculoarealbastr(toatestructurileneAARaparcoloratealbastru)etcncazul colorriiunuifrotiudinculturpurvomevidenianumaibacilideculoareroie.

ntreinereamicroscopului
Dupterminareaexamenuluimicroscopictrebuieefectuateurmtoareleproceduri: nchidemsursadelumin ridicmcuajutorulmacrovizeitubulmicroscopului cobormcondensatorul scoatemlama(saulamailamela)depeplatinamicroscopului preparateleproaspetelepunemnborcanulcuamestecdezinfectant preparatelefixate(pecareurmeazslepstrm)seintroducntruncontainercuxilol (12minute)apoi,dupevaporareaxiloluluisepunntrocutie tergemlentilaobiectivuluicuimersiecupulpadegetuluisaucuohrtiemoale,

special,pentruaocuradeuleiuldecedru(periodic,vomtergelentilaacestuiobiectivcuun tifonfoartecuratmbibatnxilol) curmplatinamicroscopuluiilentilacondensatoruluicutifoncuratmbibatnxilol acoperimmicroscopulcuohusdeplasticsaupnz,pentrualferidepraf pentruapreveniefectulnedoritalmultiplicriiunorfungiasuprasistemuluioptic,o recomandarearfimeninereamicroscopuluintrunambalajdepolietilenmpreuncuosubstan desicant,spreexemplusilicagel.

Microscopulcufondntunecat(negru)
Pentruacesttipdeexaminareesteutilizatunmicroscopopticobinuitlacareseadapteazo sursdelumincuintensitatemareiuncondensatorcardioid(cuoglinzisfericeconcentrice),cu posibilitidediafragmarealuminii.Condensatorulpentrucmpntunecat(fondnegru)oprete accesulspreobiectivalrazelordelumindirecteiarobiectulesteiluminatoblic.Astfeloparte dintrerazeledifractateireflectatedeobiectuliluminatoblicptrundnobiectivcareapareluminos pefondulntunecatalcmpului. Pentruaevitareflexiatotalarazelor,naintecaobiectulsfieluminat,acestaesteimersat ntropeliculdelichid(lichiddeimersiecuindicederefraciemairidicat,ex.glicerina).Lamele trebuiesaibgrosimeade1milimetru(distanafocalacondensatoruluifiind1,2milimetri). Tehnicadeexaminare Dupcentrareadiafragmeidecmpfolosindobiectivulcumrire10xicondensatorulpentru cmpluminos,trebuiesnlocuimacestcondensatorcucondensatorulcardioid.Condensatorul cardioidestecudiafragmanchis.Ridicmcondensatorulpnlanivelulplatineimicroscopuluii punempelentilacondensatoruluiopicturdeglicerin. Pregtimpreparatulproaspt(ntrelamilamel)ilplasmpeplatinamicroscopuluiastfel nctsvinncontactcuglicerinadepelentilacondensatorului.Fixmpreparatulcuajutorul cavalerilor. Examinminiialcuobiectivul10x,apoicuobiectivul40xcobortpnaproapedesuprafaa lameleipunemlapunctimagineacuajutorulmicrovizei.Cndobinemimagineacurgeriicurentului delichidtimcamprinscmpulmicroscopic.Utilizndmaidepartemicrovizapunemlapunct detaliileiapoinregistrmceeaceamexaminat. Examinarealamicroscopulcufondnegruesteindicatnmodspecialpentruexaminarea morfologieiimobilitiipentruTreponemapallidumnserozitateadinancrulsifiliticsau pentruLeptospiraspp.nproduspatologic(ex.urin)saudinmediidecultur. lichidulclarrecoltatiancrulsifilitictrebuieexaminatnmaxim20minutedup recoltareputemvizualizaspirocheteluminoase,fine,lungi,cuspireregulate,capeteefilate,cu micridenurubare,flexie,translaie,pefondnegru npreparatulproasptcareconineleptospireputemvizualizafilamenteluminoase, spiralate,foartemobile,cumicridenurubareiflexie,pefondnegru.

Microscopulcucontrastdefaz
Pentruacesttipdeexaminareestenecesarsavemndotareamicroscopuluioseriedepiese

strictnecesare,respectiv:uncondensatorspecialcareincludeoseriedediafragmeinelare, obiectivedefaz(defaptobiectiveobinuitelacarenplanulfocalsuperiorafostmontatoplac defazobiectiveledefazsuntgravatecuPh),ocularedecentrare,lampcuintensitate luminoasmare,filtruverde. Folosindmicroscopiacucontrastdefazesteposibilobservareaobiectelortransparentecare prezintvariaiidegrosimesauvariaiialeindiceluiderefracienstructuralor.Suntutilizate preparatemicroscopiceproaspete.Faptulcacestepreparatenusuntfixateicoloratepermite examinareaunorcaracteristicicarearputeafialteratencursulacestorprocese.Sepotexamina structuricitoplasmatice,morfologiacelular,daristructuribacterienesaufungice.

Microscopulcufluorescen
Microscopulcufluorescentrebuiesfiedotatcuurmtoarelepiesespeciale:sursaderadiaii (deex.olampdinsticldecuarcuvaporideHgcareemiteradiaiiultraviolete),setuldefiltre (caloric,deexcitaie,debaraj),condensatorulpentrufondntunecat. Filtreleauurmtoareleroluri.Filtrulcaloricabsoarberadiaiilecaloriceemisedelamp(sursa deradiaiiemiteattradiaiiultravioletectiradiaiiluminoaseicalorice).Filtreledeexcitaie permitnumairadiaiilorculungimedeundmic(ex.ultraviolete)sacceadctrepreparatul microscopic.Acesteradiaiireprezintradiaiideexcitaie.Filtredebarajsuntdefaptfiltrede proteciepentrucnupermittrecerearadiaiilordeexcitaienocivestreacspreocularirespectiv spreochiulexaminatorului,ntimpceluminaemisdefluorocromitreceipoatefiperceput. Filtreledeexcitaieidebarajsuntalesenfunciedefluorocromulutilizat. Condensatorulmretecontrastulimaginiimaibinedectuncondensatorobinuit. Pentruexaminareanfluorescenmaisuntnecesarectevaelemente,respectivobiectivele acromate(cumeniuneacobiectivulcuimersietrebuiesaibdiafragmiris),utilizareaunuilichid deimersiecarenuseusucuorilipsitdeproprietateadefluorescen(ex.glicerintamponat neutr)irespectivlamecugrosimeade1milimetru.Estepreferabilutilizareaunuidispozitiv monocular.

Examinareafolosindmicroscopulcufluorescen
Preparatelemicroscopice(carepotincludebacterii)sunttratatecuflurocromi(colorani fluoresceni).Fluorocromiisuntcompuiorganicicare,dupiradierecuradiaiiultravioleteabsorb radiaiaexcitant,intrnstaredeexcitaieiaratuncicndrevinnstareanormalpierdenergia acumulatemindradiaiiluminoase.DintrefluorocromiamputeaamintiauraminaO,rhodaminaB, acridinoranjRsautripaflavina.Luminavizibilemisdepindedefluorocromulutilizat(spreexemplu culoareaestegalbenpentruauraminaO,galbenportocaliepentrucombinaiadeauraminO rhodaminBetc). Suntdemenionatnmodspecialacelesubstanecaresepotlegacovalentdeanticorpi, marcndastfelcomplexeleantigenanticorpcaredevinfluorescente.Atuncicndmarcajulse realizeazcuizotiocianatdefluoresceinluminaemisvaaveaculoareverdeiardacmarcajulse realizeazculisaminrhodamin,luminaemisvaaveaculoareportocalie. Dreptexempluprivindutilizareamicroscopieicufluorescenvommenionaexaminarea

frotiurilorcoloratefluorescentsauimunofluorescentndiagnosticulbacteriologicaltuberculozeisau alleprei.Alteexemplevorfiprezentatencadrulcapitolului20.

9. Medii de cultur
Populaia=omultitudinedeindiviziaiuneispeciicarehabiteazntrunanumitbiotop.Clona reprezintpopulaiacarerezultdintrosingurcelulprinnmulirevegetativ.Tulpina=populaia microbianalcatuitdindescendeniiuneisingureizolrinculturpur. nfunciedetemperaturadedezvoltare,microorganismelepotfimezofile,psichrofilesau termofile.Bacteriilestudiatedemicrobiologiamedicalsuntnimensalormajoritatemezofile(au temperaturaoptimdedezvoltarecuprinsntre3037C).Pentrufungi,temperaturaoptimde dezvoltareestenjurde28C. Pentruaidentificaagentuletiologicaluneiinfeciitrebuiecadintrunprodusrecoltatdela pacientsobinemmaintirespectivulmicroorganismnculturpur,pentrucaulteriorsise poatstudiacaracterelefenotipicesaugenotipice.Cultivareaesteesenialipentrudeterminarea sensibilitiilaantibioticeichimioterapice. Metodeledecultivareabacteriilorsaufungilorurmresctreiobiective:obinereauneipopulaii microbienesuficientecantitativpentruinvestigaiilepropuse,prevenireacontaminriiprodusului cercetatcuunmicroorganismstriniizolareafiecreitulpinimicrobieneurmritencazulunui produsplurimicrobiannculturimonomicrobienedenumiteculturipure.Nuexistunmediuunic, valabilpentrucultivareaoricruimicroorganism. Termenulnsmnaredefineteoperaiadeintroducereauneicantitaidegermenintrun mediudeculturartificial,ntimpcepentruculturilecelulare,ouembrionateimaialesanimale deexperienfolosimtermenulinoculare. Cultivareaserealizeazprinnsmnareamicroorganismelorpemediidecultur.Mediile solidesaulichidecareasigurnutrieniiicondiiilefizicochimicenecesarecreteriiimultiplicrii senumescmediidecultur.Totalitateamicroorganismeloracumulateprinmultiplicareantrun mediudeculturpoartnumeledecultur(bacterian,fungicetc). *** Existofoartemarevarietatedemediidecultur. Mediiledecultursepotclasificadupmaimultecriterii.nprimulrnd,nfunciedeconinutul

nceluleviiavemladispoziie: 1.Mediinecelulare(artificiale,mediidecultur) 2.Mediicelulare(careincludcelulevii)ianumeanimaledelaborator,oudegin embrionatesauculturidecelule. Existanumitemicroorganisme(ex.virusuri,Rickettsii,Chlamydii)carenupotficultivatedect pesubstraturicareincludcelulevii.Majoritateabacteriilor,fungiiiuneleprotozoaresepotcultiva ipemediidecultur(necelulare,artificiale).

Gazdelevii(mediicelulare)
Animaleledeexperien Fiensituaiamicroorganismelorcarenusedezvoltpemediiartificiale,fiencazulncarese studiazcaractereledepatogenitate,sepotutilizanfunciedespeciamicrobianiscopul urmrit:oarecelealb,cobaiul,obolanul,hamsteruliiepurele.Pentruproducereadeseruriimune suntfolosiicai.Animaleledelaboratornecesitcondiiispecialedentreinereiarbiobazatrebuie srespecteoseriedenormecaresgarantezecalitateaacestorgazdevii.Astfelseexplic costurileridicatenceeacepriveteacesttipdemedii. Avndnvederemicroorganismulinoculat,susceptibilitateagazdeiiscopulurmritsepot inoculaanimalecuvrstediferite(embrioni,nounscui,animaletinere,aduli)pecidiferitede inoculare(percutanat,prinscarificare,subcutanat,instilarelanivelulanumitormucoase,peros, intramuscular,intravenos,intratesticularetc). Aacum,spreexemplu,virulenaMycobacteriumtuberculosisscadepemsurde microorganismulestecultivatpeanumitemediidecultur(aspectdoveditiprinobinereatulpinii vaccinaleBCGdeM.tuberculosisvariantabovis),nsensinvers,estenecesaruneoriexacerbarea virulenei,prinpasajerepetaterealizatepegazdesusceptibile.Alteexemplevorfidiscutaten capitolelereferitoarelaStreptococcuspneumoniae,Shigellaspp.,Klebsiella pneumoniae,Treponemapallidum,Rickettsiaspp.,ChlamydiasppiCandidaspp. Ouldeginembrionat Areavantajulunuipremaisczut,estenmodnormalsteril(ncondiiileproduceriiacestor gazdeviinunitispecializate),nuprezintfactoriantimicrobieninperioadancareserealizeaz nmodobinuitinocularea(la614ziledeincubaie). Ouldeginestentiexaminatlaovoscoppentruevaluareaembrionuluiiprezeneiunor eventualemodificrinedorite.ncondiiidestrictasepsieouldeginembrionatsepoateinocula intraembrionar(intramuscular,intracerebraletc),lanivelulmembraneichorioalantoidian,nsacul alantoidiansaunsaculamniotic.Oulinoculatseintroducenincubator,la37Cncondiiidebun ventilaieaaeruluiiumiditatecorespunztoare,pentru1saumaimultezile.Sepoateutiliza aceastmetodpentruizolareaiidentificareatulpinilorrickettsiene(utilizndmetodeimunologice, ex.reaciademicroaglutinare). Culturidecelule Existposibilitateautilizriiunorculturideorgansauaculturilordeceluledispersate.Acestea dinurmsepotclasificanculturiprimare,tulpinicelulareiliniicelulare. Culturileprimarederivdindispersiaenzimatic(deex.cutripsinEDTA)acelulelorunui organproasptrecoltatipotfimeninuteinvitropentru35pasaje.Tulpinilecelularereprezint

culturicuunsingurtipdecelule(culturiomogene)ipotfimeninuteinvitropentru5060pasaje. Liniilecelularecontinue(stabile)suntpopulaiicelularecarederivdinesutnormalsaumaligni potfisubcultivate(respectndindicaiiledinprotocol)nmodnelimitat.Aufostpuselapunctfoarte multeliniicelularespreexemplu: liniicelularederivatedinrinichidemaimu(Vero,BSC1,BGMKetc),oarece(McCoy), ovardehamster(CHO) liniicelularederivatedincarcinomdecoluterin(HeLa),laringe(HEp2) liniicelularelimfoblastoide(MT4,H9etc)etc. PentruChlamydiatrachomatissepotutilizaliniilecelulareBGMK,HeLa,McCoy, pentruChlamydiapneumoniaesepotutilizatliniilecelulareHeLa,HEp2,pentruChlamydia psittacisepoateutilizaliniacelularMcCoyetc.Liniilecelularepotfiutileinvedereastudierii efectuluiunorexotoxine,spreexempluncazultoxinelorprodusedeE.coliO157:H7irespectiv deShigellashigasepoateutilizaliniacelularVerontimpcepentrutoxineleprodusedeVibrio choleraeiE.colienterotoxigensepoateutilizaliniacelularCHO.

Mediiartificiale(necelulare)
Mediiledeculturartificialesuntmaiieftine,sepotpreparamaiuor(folosindreetefoarte asemntoarecelordebuctriesaualtevariantedesprecarevomdiscutapescurtncontinuare) i,frafiideale,suntcelmaifrecventutilizatenpracticatmicrobiologic. Condiiiimpusemediilordeculturartificiale: sfiesterile, sfienutritive(sconinfactoriidecreterenecesari), saibunanumitpH(celmaiadeseantre7,27,6), saiboanumitpresiuneosmotic, saibumiditateafavorabilmultiplicriigermenilor altecondiii. Clasificareamediilordeculturartificiale Mediiledeculturartificialesepotclasificaduposeriedecriterii. Dupstareadeagregare,mediiledeculturartificialepotfi: solide(agar/geloz,agarsnge,AABTL,ADCL,BordetGengou,Chapman,Lffler, Lwenstein,MuellerHinton,Sabouraud,TCBS,TSIetc) lichide(appeptonatalcalin,bulionMuellerHinton,bulionnutritiv,bulionsnge,bulion selenit,buliontioglicolat,Middlebrook7H9,O.C.S.T.etc) semisolide(CaryBlair,MIU,Stuartetc) Dupcomplexitateaingredientelor,mediilepotfi: simple(agar,bulionsimpluetc) complexe(agarsnge,gelozchocolat,agarcufactoriXiV,BordetGengou, MuellerHintonetc) Dupscopulurmritmediiledeculturartificialepotfi: detransport(appeptonatalcalin,CaryBlair,Stuartetc) deizolare(agarsnge,BordetGengou,Lffler,Lwenstein,Sabouraudetc)

deidentificare(TSI,MIU,truseAPIetc) deconservare(agarnutritivncoloanetc) Dupconinutulnap,mediilepotfi: cuumiditateobinuit mediiuscate(deshidratate)nscopulconservrii Mediispeciale: elective(Lffleretc) selective(agarsngeaziddesodiu,BSA,Chapman,MacConkey,Tinsdalecuteluritde potasiu,mediicuantibioticeetc) dembogire(appeptonatalcalin,bulionselenit,O.C.S.T.etc) difereniale(AABTL,ADCL,agarsnge,MIU,TSI,TCBSetc) Existialtecriteriideclasificare. Mediulelectivconineingredientelecareconvincelmaibinedezvoltriiuneianumitebacterii (deexemplumediulLffler,cusercoagulatdebou,pentrubaciluldifteric). Princoninutulsunsubstaneantimicrobiene,mediulselectivinhibdezvoltareaaltorbacterii dectceaacreiizolareseurmrete.Deexemplu,mediulcuteluritdepotasiupentruizolarea baciluluidiftericsaumediincareincludemantibiotice(fadecarebacteriacaresedoreteafi izolatesterezistent). Mediuldembogirefavorizeaznmulireaanumitorbacteriipatogene,inhibnddezvoltarea floreideasociaiedintrunproduspatologic.Funcioneazconcomitentcamediuselectivica mediuelectiv. MediuldiferenialconineunindicatordepHiunanumitsubstrat(deexempluunzahar)care poatefisaunumetabolizat,determinndmodificareapHuluiiaculoriiindicatoruluisau modificareaaspectuluiculturii.Deexemplu,agarulcualbastrudebromtimollactozat(AABTL) permitedifereniereabacteriilorlactozopozitive(cumesteE.coli)debacteriilelactozonegative (Shigella,Salmonellaetc).Alteexemple:ADCL(agardezoxicolatcitratlactoz),TSI(3zaharurii fier),MIU(mobilitateindoluree). Iniial,toatemediiledecultureraupreparatenlaborator,diningredientelestabiliteconform reetei.Etapelegeneralepentruproducereaunuimediusuntasemntoare: cntrireaingredientelor dizolvareanapdistilatsauapdeionizat verificareapHuluiiajustarealapHulcorect filtrarea sterilizarea(deregulprinautoclavare) repartizareantuburi,flacoaneetc. nmomentuldefafoartefrecventserecurgelacumpraredemediideshidratate,situaien careestenecesardoaradugareaapeidistilate,demineralizatesaudistilateidemineralizate (conformrecomandrilorproductorului),condiionareaisterilizareaprinautoclavaresaumetoda recomandatpentrumediulrespectiv.

Existdeasemeneamediigatapentruutilizare,condiionatenplciPetrisautuburi. Indiferentdeformadecondiionareamediilordeculturprecumiindiferentdemodulde procurarealacestora,laboratorulcareleutilizeaztrebuieslesupuncontroluluidecalitate. Spreexemplu,pentruatestasterilitateamediuluiagarsnge,incubm2plcila37Ctimpde 48deorenutrebuiesaparmodificrimacroscopice.Pentruatestaperformanamediului (eficienabiologic)utilizmpeoaltplac,ipecteojumtatedeplac,vomcultivaotulpinde coleciedeStreptococcuspyogenesirespectivotulpindecolecieStreptococcuspneumoniae incubmplacaPetripentru1824orela37Ciapoianalizmdezvoltareaculturii,caracterele coloniilorirespectivcaracterelehemolizeiproduse. ngeneral,mediiledeculturdupproducereipnnmomentulutilizriisuntconservatela adpostdeluminasolar,+4C,nfoliedeplasticnchisermetic.Mediilepentruanaerobi(bulion tioglicolat,altemedii)sepstreazndulapuri,lantunericitemperaturacamerei. Descrieresuccintpentruunelemediimaifrecventfolosite Agarsnge Includeagarnutritivbazcaresedizolvlatemperaturridicatiprinagitarenapdistilat autoclavm(15minutela121C)iapoircimpnla50C.Laaceasttemperaturadaugmn proporiede5%sngeledefibrinat(sngedeberbec,cal,bousaudeiepuresngeledeomar puteafiutilizatnumaidacnuexistoaltposibilitate,folosinddeexemplusngecareadepit limitadevalabilitatentrobancdesnge).Distribuimmediulncondiiiaseptice,nplciPetri. Poatefimeninutla+4Cpnla4sptmni. Agarchocolat Procedmcamaisus,pnlaobinereaamesteculuideagarsnge.Introducemflaconulcu mediunbaiedeapimeninemtimpde10minutela80Castfeleritrocitelevoreliberafactorii nutritivinecesaridezvoltriiunorbacteriimaipretenioasedinpunctdevederenutritiv.Cnd temperaturarevinela50CturnmmediulnplciPetri.Sepoateconservalatemperatura frigideruluipentrunumaimultde4sptmni. Amies Includeagar,tioglicolatdesodiu,crbunefarmaceuticneutru(pentruafacilitasupravieuirea microorganismelorfragile,deex.Neisseriagonorrhoeae)iosoluietamponatdesruri anorganice.Nuconineindicatorredox.Estesterilizatprinautoclavareipoatefimeninutla+4C timpde12luni. Esteunmediudetransportcarelimiteazimultiplicareaunoreventualicoliformide contaminare(ceeacenuserealizeazprinfolosireamediuluiStuart). Appeptonatalcalin EsteunmediuutilizatpentrutransportulprobelorncaresesuspecteazprezenaVibrio cholerae.Includepeptoniclorurdesodiudizolvateprinnclzirenapdistilat,cuajustarea pHuluilaovaloarede8,69,0.Mediulesterepartizatntuburi.Sterilizmprinautoclavare(15 minute,121C).Valabilitateaestedecirca6luni(latemperaturade4C). Bulionselenit Esteunmediudembogire,utilizatpentruizolareaSalmonellaspp.Includeprintrealte componenteselenitaciddesodiu.Datoritriscuriloracestmediunuvafipregtitdefemei nsrcinateiarceicarenproducvoraveagrijsnuinhalezesaunghitaceastsubstan. Sterilizareamediuluiturnatntuburisefacenbaiadeaplatemperaturadefierbereinuprin

autoclavare.Sepoateconservalatemperaturafrigideruluitimpde6luni. CaryBlair Includeagar,tioglicolatdesodiuiosoluietamponatdesrurianorganicedizolvate(prin nclzireiagitare)napdistilat.Estesterilizatprinautoclavareipoateficonservatla temperaturafrigideruluimaimulteluni. CaryBlairesteunmediudetransportnspecialpentrugermenigramnegativi. LwensteinJensen Reprezintmediulclasicutilizatnmycobacteriologie.Include3componenteprincipale:o soluiedesruriiamidon,soluiadeverdemalachitiomogenizatuldeou(proaspeteibine antiseptizate).Dupfiltrareprodusulserepartizeazntuburi(cucapacnurubat,inndcontde timpullungdeincubare,28sptmni).Mediulestecoagulatnpant,la85Ciduprcirese poatemeninelatemperaturafrigideruluictevaluni,pnlautilizare. MacConkey Esteunmediuslabselectivodiferenialcareincludehidrolizatdegelatin,hidrolizatde cazein,lactoz,sruribiliare,clorurdesodiu,rouneutru(indicatordepH),cristalvioletiagar, dizolvatenapdistilatiautoclavatetimpde15minutela121C.Poatefimeninutla+4Cpn la4sptmni. Mediipentruanaerobi Existmaimultetehnicipentruaasiguracondiiiledeanaerobioz.Relativfrecventse utilizeazmontareaplciiPetri,careconinedejamediuldeculturrcitinsmnat,rsturnat pecapaculpropriu,pecaresegseteunpliculecareconineamestecreductor(pirogalol,talc, carbonatdepotasiu).Utilizmparafinnclzitpentruaetaneizaplaca.Dupsolidificarea parafinei,mediuldeculturesteincubatnvedereaobineriicoloniilor. Mediipentrufungi Vomdiscutapescurtdoarunmediumaifrecventutilizat,respectivmediulSabouraud.Acesta includeglucoz,digestiepancreaticdecazeiniagarcaresedizolvprinuoaragitare,lacald, napdistilat.DupajustareapHuluila5,6urmeazfierbereaifiltrareamediului,lacald.Apoi arelocrepartizareanplciPetrisauntuburiiacesteaseautoclaveaztimpde15minutela 121C.naintedeutilizare,plcilecumediuSabouraudpotfistocatelatemperaturafrigiderului pentrucirca2luni.Demulteoriacestmediudevineselectivprinadugaredeantibiotice (cloramfenicol,gentamincinetc). DespremediilemultitestTSI(triplesugariron)iMIU(mobilitateindoluree)vomdiscutan cadrulcapitolelor12i28. Stuart Includeagar,tioglicolatdesodiu,glicerofosfatdesodiu,clorurdecalciuialbastrudemetilen, dizolvateprinnclzirelatemperaturadefierberenapdistilat.Estesterilizatprinautoclavarei poatefimeninutla+4Ctimpde23luni. Esteunmediudetransportuniversalbacteriilepotsupravieui13zile.

10. Tehnici de cultivare

Tehniciledecultivaresefolosescpentruobinereadecoloniiizolateprinnsmnarea produsuluipatologicpemediisolideipentrurepicareacoloniilorizolatenvedereaobineriide culturpur,precuminaltesituaii. Pentruacorelanoiunilepecarelevomprezentacuceeaceafostprezentatncapitolele anterioare,facemurmtoarelemeniuni: ncapitolul5amdiscutatschemageneraladiagnosticuluimicrobiologic acestdiagnosticnupoatefirealizatnlipsacunotinelorprivind conduitanlaboratorianormelordeprotecieamuncii(capitolul2) echipamentuliaparaturanecesare(capitolul3) dezinfeciaisterilizarea(capitolul4). Toateacesteatrebuienelesencontextuluneiactiviticaresprevinerorile,srealizeze proteciapacienilor,spermitcompararearezultatelorlanivelnaionaliinternaional,s contribuielarealizareauneistandardizrinmicrobiologiaclinicromneasciscreasc ncredereatuturorpartenerilordinsistemulsanitardinaranoastr(capitolul1). Porninddelaacestenoiunidebaz,ncapitoleleurmtoareamdiscutat: primaetapadiagnosticuluidirect(bacteriologicsaumicologic),ncapitolul6 utilizareaexamenuluimicroscopicnadouairespectivnapatraetap(deidentificare) adiagnosticuluidirect(capitolele7i8) substraturilepecaresepoaterealizaatreiairespectivapatraetap(ctevadintre caractereleexaminate),ncapitolul9. ncapitoluldefavomaveanvedereopartedintretehnicileindispensabilediagnosticului microbiologicngeneral,subliniindutilizareaacestoranatreiaiapatraetapdediagnostic ncapitoleleurmtoare(1113)vomprezentaopartedinelementelecaredefinesc complexitateaetapeideidentificareamicroorganismeloriarncapitolul14vomdiscutaoparte dintremodalitiledestabilireasensibilitiilaantibioticeichimioterapice(antibacterienesau antifungice)cuajutorulcrora,dupncheiereaunuidiagnosticcorectmicrobiologic,putemstabilin modtiinifictratamentulantimicrobiancetrebuieprescrisunuianumitpacientcareprezintoboal infecioasdeetiologiebacteriansaufungic. Aacumammenionatincapitolul9,tehniciledecultivareurmresctreiobiective: obinereauneipopulaiimicrobienesuficientecantitativpentruscopulpropus prevenireacontaminriiprodusuluicercetatcualtemicroorganismei izolareafiecreitulpinimicrobieneurmritencazulunuiprodusplurimicrobiannculturi monomicrobienedenumiteculturipure. Nuexistunmediuunic,valabilpentrucultivareaoricruimicroorganism. Esteesenialsseneleagnecesitateaobineriicoloniilorizolateprecumiaculturilorpuren diagnosticuldelaboratorbacteriologicimicologic(direct).ncazulncarecoloniileizolate

reprezintoculturpur(formatdinacelaitipdemicroorganism),aceastavafiutilizatn vedereaidentificriiagentuluietiologic(bacteriaizolatdelaunpacientcuopresupusboal infecioas)precumilaefectuareaantibiogrameinvedereastabiliriitratamentuluiintit (antibioticullacarebacteriaizolatestesensibil).nsituaiancarenusareuitobinereaculturii pure,porninddelacoloniileobinutesevorfacerepicripemediideculturneselective. Obinereadecoloniibacterieneizolatedintrunproduspatologicsepoaterealizaprinepuizarea inocululuipemediiledeculturfolosind: ansabacteriologic pipetaPasteur tamponuldevatmontatpeotij baghetadesticlnformdeL altetehnicidensmnare. Ansabacteriologictrebuiesterilizatnainteidupfiecareutilizareasaprinnclzireapn laincandescen(larou)abucleiifiruluiurmatdeflambareaportansei,pecndcelelalte ustensilepentrunsmnarevorfisterilizateprinaltemetode(vezicapitolul4).

Obinerea coloniilor izolate prin epuizarea inoculului cu ansabacteriologic

nsmnareanpentagondeschisamediuluisolidaflatntroplacPetrifolosindansa bacteriologic,pentruobinereadecoloniibacterieneizolate,porninddelaunproduspatologic recoltatitransportatctrelaboratorntroeprubet/tubnchiscudopdevatincludeurmtoarele etape: atenie:toateactivitilesedesfoarnstrictavecintateabeculuidegaz! atenie:pesuprafaamediuluideculturpoateexistalichiddecondenscarearputea facilitacontaminareaculturiibacterieneestenecesarcaplacaPetricumediudeculturpecare dorimsfacemcultivareasfiemeninutntermostat,cumediulnsus,ntredeschis,pentru evaporareacondensului! sesterilizeazansabacteriologiclaflacrabeculuidegazprinaducereala incandescenabucleiifiruluianseiurmatdeflambareaportansei(trecereprinflacrde23ori) senoteazpeplacacumediudeculturdatainoculrii,numruldeidentificareitipul produsului(tipulprodusuluipoatefiinclusprintrunsimbolnnumrulunicdeidentificare) seiaeprubetacuproduspatologicnmnastng(ncazulncarefiinddreptaci,ansa bacteriologicesteinutnmnadreapt,cauncreion),sescoatedopuleprubeteiutilizndn acestscopdegetele45delamnadreapt atenie:snusescapedopuldinmn=pericoldecontaminareameseidelucru! atenie:dopulnutrebuiestrnsnpodulpalmei=pericoldecontaminare! seflambeazguraeprubetei(trecereprinflacrde23ori,imprimndouoarmicare derotirenambelesensuri) seintroduceansaneprubetfrsseatinggurasaupereiiacesteianpartea superioar,sercetebuclapepereiieprubeteinvecintateaprodusuluipatologicisencarc

buclaanseidinprofunzimeaprodusuluipatologic,recoltndfragmentecarearputeaincludecuo maimareprobabilitatebacteriiimplicatenprocesulinfecios(ex.poriunicuaspectpurulent) sescoateansafrsaatingempereiisauguraeprubetei atenie:contaminareapereiloreprubeteinporiuneancaresevamontadopul,va ducelacontaminareadopuluiirespectivlaomareprobabilitatedecontaminareaaceluicareva utilizaulterioreprubeta/tubulcuproduspatologic seflambeazguraeprubetei semonteazdopullaeprubetprintromicaredersucirecearecascopfixarealui atenie:guraeprubeteipoatefifierbintedupflambare! atenie:ntoataceastperioadsecontraindicefectuareaunormicribrutecu ansancrcatcuproduspatologicmicrilebruteinecontrolatepotdeterminacontaminareacu produspatologicameseidelucru,amediuluidelucrusauaceluicaremanipuleazprodusul patologic! dupceeprubetaafostaezatnstativ,mnastngeliberatvaluaoplacPetripe careovaaezapemascucapaculnjosimediulnsus totcumnastngsevadeschideplacaiarcuansancrcatcuproduspatologicse vortrasalinii(striuri)aproximativparalelentreele,caunzigzag(fraseridicaansadepe mediuldecultur)reprezentndoprimlaturaunuipentagondeschis senchideplacaPetri ansasesterilizeazlaflacr,portansaseflambeaz serceteansa(sepoatencercarcireaeiprinatingerepesuprafaamediuluisolid steril,nensmnat,lngpereteleexterioralplciiPetri) frssemaincarceansacuproduspatologicsetraseazadoualatura pentagonuluiintersectndopeprima,totcaliniiparalele,dupcareansasevasterilizadinnou sevaprocedalafelcamaisusipentruurmtoarelelaturiavndgrijsnuseuneasc ultimalaturcuprimalatur nmomentulinteresectriicuansaalaturiiprecedenteapoligonului,ansaeste rencrcatcumicroorganisme,darncantitatedincencemaimic,pncesevaajungela ctevacelulemicrobieneizolatecare,diseminatepeplacvordanaterelacoloniimicrobiene izolate seintroduceplacaPetripecareafostrealizatcultivareantermostat,rsturnat(cu mediulnsusicapaculnjos),latemperaturaoptimmultiplicriimicroorganismuluisuspectat (pentrucelemaimultebacteriitermostatulvafireglatpentruotemperaturde3537C,pentrufungi la28C) dupoperioaddeincubarede1824ore(pentrucelemaimultedintre microorganismelestudiate),peprimalatursevaobineceamaiimportantcantitatedecultur (culturmicrobianconfluent),peurmtoarelelaturisevaremarcascdereacantitativaculturii iarcelpuinpeultimalaturapentagonuluideschissevorobinecoloniiizolate. Dacmediuldeculturpecaresarealizatcultivareanpentagondeschisesteneselectiv, coloniileizolateobinutepotfiutilizatenetapeleulterioare(identificareprindiferitemetode,testarea sensibilitiilaantibioticeichimioterapice).ncazulncareculturaprimaresteobinutpeun mediuselectiv,esteobligatorierepicareacoloniilorizolatedeoarececoloniileizolatevizibilepotfi asociatecumicroorganismeinhibatedatoritselectivitiimediului,carenusevdcuochiulliber

sauculupaicaresevormultiplicapemediiledeidentificarefcndimposibilinterpretarea rezultatelor. Tehnicadescrisesteotehnicdebazicuanumitemodificrisepoateutilizainalte situaii(spreexempluatuncicndprodusulpatologicesterecoltatnaltetipuriderecipiente).

Altetehnicidecultivare(nsmnare)
Amalespentruoprezentareamnunittehnicaobineriicoloniilorizolateprinepuizarea inocululuicuansabacteriologic(nsmnareanpentagondeschis)deoarececonsidermc aceastreprezintotehnicesenial,carepoatefireinutncdinaldoileaandestudiu).n continuarevomprezentaaltetehnicidecultivare,fraepuizatoatevarianteleposibile.

nsmnareacuansacalibrat
sepoateutilizapentruuroculturainaltescopurincareaproximareanumruluide microorganismedezvoltatepemediuldeculturesteutil putemutilizaansedeplatinsauansedeunicfolosinpentru0,01saupentru0,001 ml/calibrulanselordeplatintrebuieverificatnfiecarelun urinarecoltatcorespunztor(vezicapitolele6i29)seomogenizeazprinrsturnarea dectevaoriarecipientuluiderecoltare(nchisetan) respectndregulilelucruluiaseptic,nclinmrecipientuldecolectarenaafelncts putemspunembuclaansei,paralelpesuprafaaurineiisprelevmp.p. peoplacPetricumediuldecultursedescarcurinanstriu,peunuldintrediametre apoiepuizminocululpetoatsuprafaaplciinstriuriperpendicularepestriuldedescrcare,cu micridezigzag dupincubare,nziuaurmtoarevomnumracoloniileapruteispreexempluvom nmulinumruldecoloniicu1000dacamutilizatpentrunsmnareansade0,001ml dinmotiveeconomiceputemsrealizmnsmnareanmodasemntoraurineipeo jumtatesauchiarpeoptrimedeplac.

nsmnareacutamponulsaucubaghetadesticlnL
acestetehnicisepotfolosiattporninddelaproduspatologic(metodpreferatn unelelaboratoare)ctidelacoloniicaresuntutilizatepentruobinereadeculturpur nsmnareacutamponulpoatefifolositipentrurealizareaantibiogramei difuzimetrice vomprezentancontinuarevariantancareseutilizeaztamponulpentrucultivareaunui produspatologic(exsudatfaringianetc),presupunndcsuntemdreptaci notmpeplacacumediudeculturdatainoculrii,numruldeidentificareitipul produsului(tipulprodusuluipoatefiinclusprintrunsimbolnnumrulunicdeidentificare)nuvom mainotaaceastetaplaprezentareaurmtoarelortehnicidarmenionmacumfaptulceste obligatorie,defiecaredataltelucruricuimportangeneral,menionatelatehnicaobinerii coloniilorizolateprinepuizareainoculuicuansabacteriologicrmnvalabile scoatemtamponuldintubulprotectorcuprimeletreidegetedelamnadreapt flambmguratubuluiprotectorilaezmpeunstativ cumnastnglumoplacPetri(carenumaiprezintlichiddecondensinterior)pe

careoaezmpemascucapaculnjosimediulnsus totcumnastngdeschidemplacaiarcudreaptadescrcmtamponulncrcatcu produspatologic(existmaimultemodalitidedescrcareatamponului,dintrecarevomprezenta dou) descrcmtamponulprinrulare,petoatefeelepeorazaplcii,urmndcasdispersm produsulcuobaghetdesticlnL,steril,petoatsuprafaaplcii descrcmtamponulprinrulare,petoatefeelepeuncadranalplcii,urmndcas dispersmprodusulcuansabacteriologicncelelaltecadrane,canmetodapentagonului deschis(dupnsuireatehnicii,pentrueconomie,sepoaterealizacultivareapejumtateaunei plci).

Tehnicadiluiilorsuccesivenlichiduldecondensalmediilorsolide
mediuldeculturesteturnatneprubetesautuburiutilizmmaimulteeprubete prelevmcuansap.p.ildescrcmnpicturadelichiddecondensalprimuluitub frsncrcmdinnouansacup.p.odescrcmnpicturadecondensaceluideal doileatub.a.m.d dupnsmnare,nclinmeprubetelepentruascldasuprafaamediuluinclinat,cu picturarespectivdelichiddecondens,realizndnacestmoddispersiamicroorganismelordin picturadeinocul,pesuprafaamediului.

Tehnicaepuizriianseipemediisolide
constnefectuareauneiseriidensmnricuansabacteriologicncrcatosingur datcuamesteculdemicroorganisme,ntrunirdeeprubetecugeloznclinat,frasteriliza sauarencrcaansabacteriologicpeparcurs nsmnmporninddelabazaeprubetei,atingndmediuliurcndprindescrierea unorstriurinzigzag,pentrufiecareeprubetnparte realizmastfeloepuizareaconinutuluiansei,nfinal,ajungndsnsmnmnumai ctevacelulemicrobiene,dincarevorapreadupincubarecoloniiizolate.

nsmnareaprinnepareamediuluiturnatntuburisaueprubete
metodasepoateutilizapentruconservareaculturilorpurealeunortulpiniconsiderate reprezentative,atulpinilordecolecie,atulpinilordereferin,pentrunsmnareaunormedii multitest(TSI,MIUetc)etc sepreferutilizareauneiansefir,sauauneiansecuobuclmic(dupcaz) nfunciedescopulurmritexistanumitevariantealeacesteitehnici,iartuburile (eprubetele)utilizateaudimensiunidiferiteiocantitatedemediucaredifer(respectndprotocolul delucrucorespunztor) spreexempluncazulnsmnriimediuluiTSI seutilizeaztuburidedimensiunimici,cantitateademediuutilizatpentruuntubfiind de3ml iniialsensmneazparteadreaptprinnepare,fraseatingebazatubului ulteriorsensmneazparteanclinatprinrealizareaunorstriurinzigzag,atingnd suprafaamediului.

nsmnareacuseringa
produselelichide(nspecialsnge,pentruhemoculturdarialtep.p.)sepot nsmnadirectcuseringacucaresafcutrecoltarea

nsmnareacupipeta(Pasteursaupipetagradat,dupcaz)
ladeschidereainchiderearecipientelorflambmgurafiecruianparte,aacumam prezentatmaisus naintedeafolosipipeta,deisterilizatnprealabil,ovomflambaprintrecerepetoat lungimeaprinflacr pentruaprelevap.p.dinrecipientuldetransportprecumipentrunsmnarenmediul lichidsausolid,folosimundispozitivctdesimplu(estecontraindicataspirareacugura) dupncheiereansmnriieliminmlichidulrmaseventualnpipetnflaconulcu amestecsulfocromic,introducempipetanamesteculsulfocromiciaspirmsoluiadezinfectant pnaproapededopuldevatalpipetei toatepipetrileserealizeazcuajutoruldispozitivuluiadaptatlapipet pipetavafimeninuttimpde24orenamesteculsulfocromic.

nsmnareacupipeta,prininundare
reprezintovariantatehniciiprezentatemaisus sepoatefolosipentrudepunereainocululuinvederearealizriiantibiogramei difuzimetrice,pentruverificareasensibilitiilabacteriofag(lizotipie)etc dupncrcareapipeteicuculturapur,inocululsedescarcpesuprafaamediuluisolid dinplacaPetri,apoisenclinnmodrepetatplacapentrunsmnareauniformasuprafeei mediului excesuldeinoculseaspircupipetaPasteurisedescarcnsoluiadezinfectant placaselasapoilngflacrpentruuscare,cucapaculntredeschis.

Tehnicadiluiilorsuccesivenmediilichide
poatefifolositpentrudiluareunorsuspensiiantigenice,seruri,fagietc nacestscopfolosimunirdeeprubetentoateeprubetelerepartizmcuaceeai pipetocantitateconstantsoluiesalinfiziologic(0,9mlnfiecareeprubet) pipetelegradatesterileimpachetatenhrtiesedesfacnmomentulutilizriinmodul urmtor:rupemhrtiachiarlamijloculpipetei,printromicaredersucirensensopusacelor douminitragemparteadehrtiecaresetermincuuncaptrsucitliber(corespundeporiunii superioareapipetei),decarevominepipetantimpullucruluiscoatemadouajumtateahrtiei fraatingeparteaefilatapipeteiiastfelpipetarmnesterilpentrulucru cuoaltpipetprelevm0,1mldincantitateadesuspensiemicrobianiintroducem inocululnprimaeprubetaspirmieliminmlichiduldinpipetdectevaoripentru omogenizareasuspensieiapoipunempipetasepunenamestecsulfocromic lumonoupipetcucareaspirm0,1mllichiddintubul1iintroducemacestlichidn tubul2,aacumammenionatmaisusschimbmpipetairepetmmanevrapnlaultimultub dinultimultubscoatem0,1mlpecareieliminmnamesteculdezinfectant

Ctevatehnicideizolarespeciale
1.Metodefizice nclzireanbaiedeap,timpde10minutela80Cap.p.recoltatnmodcorespunztor isuspensionatnbulionVF(mediuanaerob)dincaresedoreteizolareaunorgermeniisporulai anaerobi 2.Metodechimice utilizareamediilorselectivesauamediilordembogire

adugareala1mldep.p.recoltatnmodcorespunztor(isuspensionatnbulionVF)a 1mldealcooletilicde95urmatdeagitareatubuluitimpdeoorlatemperaturacamerei produsulrezultatsensmneazpemediianaerobe,pentruizolareaunorgermenisporulai 3.Metodebiologice inoculareasputeincaresesuspecteazprezenaS.pneumoniaelaoarecelealb dup14ziledelainoculare,oarecelefaceoinfeciesepticemiccupneumococ sepoateizolaoculturpurdepneumococdinsnge,cord,splin,ficatetc. Aplicareaacestortehnicivafidiscutatncapitolelorurmtoare,iaruneledintretehnicivor puteafiexecutatesauprezentatedemonstrativncadrullucrrilorpractice.

11. Examinarea caracterelor de cultur, metabolice precum i a altor caractere fenotipice utile n identificarea microorganismelor
ncapitolul5amprezentatSchemageneraladiagnosticuluidelaboratormicrobiologicipe aceastschemamncercatsevolum,adugndtreptatnoidateteoreticeipractice.nacest capitolvomcontinuadiscutareaceleidea4aetapeadiagnosticuluidirect(careincludei verificareadinpunctdevederemicroscopicacoloniilorizolate),strictnecesarpentruidentificarea microorganismelorizolatedelapacieniicubolitransmisibile. Iniialvomreluactevadefiniiiielementeteoreticeurmndcamaidepartesprezentm principalelecaracterestudiatenuneledintresubetapeleacestuimomentdiagnostic,maiprecis caractereledecultur,ctevanoiuniprivindcaracterelebiochimice,metabolice,depatogenitaten cursullucrrilorpracticesevadiscutaidesprealtecaracteremicrobiene.

Definiiiialteaspecteteoretice
Coloniaizolat Pemediisolide,germeniinsmnainsuprafaproduccolonii.Coloniaestetotalitatea bacteriilorrezultatedinmultiplicareauneisingurecelulebacteriene.Ocolonieesteoclon bacterian.Coloniileizolatesepotobinedeexempluprintehnicansmnriiprindispersie(cu ansabacteriologicsaucutamponul),aacumafostprezentatncapitolul10. Incubareaconstnmeninereamediilordeculturnsmnate,ncondiiilenecesarepentru

dezvoltareaculturii.Majoritateaspeciilorbacterienesedezvoltiduclaapariiauneiculturincirca 1824deoredeincubarelatemperaturaoptimdedezvoltareasiguratntermostat(deregul 3537C).Pentrubacteriilecarenecesitoatmosferde35%CO2(carboxifile),plcilecultivatese vorpunenexsicator,mpreuncuolumnareaprins.Pentrubacteriilestrictanaerobeeste necesarincubareananaerobioz.Omarepartedintrefungi,nspeciallevuri,autemperatura optimdedezvoltareanjurula2830C. Dezvoltareamicroorganismelorpemediideculturpoatepermiteevaluareaanumitoraspecte macroscopicesaumicroscopice(ex.coloniileprodusedeMycoplasmaspp.)carepotreprezenta, dupcaz,modalitideidentificaresaudeorientarenalegereaalgoritmuluideidentificare. Caractereledeculturinclud: necesitilespecificenvedereacultivrii bacteriinepretenioase(caresepotcultivapemediisimpleex.E.coli) bacteriipretenioase(carenecesitmediicomplexe,mbogitesau/iadugarean mediiaunorfactoridecretereex.Haemophilusinfluenzae) bacteriistrictaerobe(Bordetellapertussis),aerobefacultativanaerobe(E.coli,S. aureus,S.pyogenesetc),carboxifile(S.pneumoniaeetc),microaerofile(Campylobacterspp.,etc), strictanaerobe(Clostridiumspp.) temperaturaoptimdecultivare(2030CpentruListeriamonocytogenes,42C pentruCampylobacterjejuni,3537Cpentrumajoritateabacteriilor,2830pentruunelelevurietc) intervaluldetimppentruapariiacoloniilorizolate,nfunciedetimpuldegeneraie 1824orepentrumajoritateabacteriilor 2448orepentrumajoritateafungilor sptmnipentruMycobacteriumtuberculosisetc aspectul,consistenaiaderenacoloniilor/culturii modificrileaprutepemediunvecintateacoloniilor/culturiietc. Examinareaculturilor/coloniilorizolateesteunprocesfoarteimportant,necesitcunoaterea teoriei,multexerciiu,atenieiexperien.Pentruaobinecelemaibunerezultateestenecesaro buniluminare(preferabilluminanatural)iariluminareamediuluicareurmeazaficititsevaface celpuininincidenoblic.Examinareasepoatefacecuochiulliber(celpuininiial)darar trebuicompletatcuexaminareafcutcuajutoruluneilupesauaunuistereomicroscoppentrua puteanregistratoateaspecteleimportanteipentruaputeasesizaapariiacoloniilordedimensiuni micisaufoartemici.

Aspectulculturilorpemediilichide
Bacteriileifungiifacultativanaerobisedezvoltntoatmasadelichid,tulburndul.Bacteriile strictaerobesedezvoltpreponderentlasuprafaamediului. SeacceptcdeobiceitulpinilecarepemediilesolideformeazcoloniidetipStulbur omogenmediul(majoritateabacteriilor)ntimpcetulpinilecareformeazcoloniidetipR realizeazotulburaremaipuinomogen.VarianteleRpotlsamediullimpede,formndflocoane caresedepunsauunstrat(vl)lasuprafaamediului(deexemplubaciluldiftericsaubacilul tuberculos).

nurmadezvoltriimicroorganismelornmediideculturlichidesemaipotremarcai pigmentogeneza(ex.Pseudomonasaeruginosa)sauutilizndsimulolfactivsepoateconstata apariiaunuimiroscaracteristic(ex.unmirosdecornarsncazulclostridiilor). Vomprezentactevaexemple,menionndcexistivariaiidelaregul: mediulestetulburatomogen(ex.Staphylococcusspp.) mediulesteclar,cudepozitgrunjospepereiilabazatubului(ex.S.pyogenes) mediulesteclar,cuvllasuprafa(V.choleraenappeptonatalcalin) dezvoltareaculturiiserealizeazcaunineladerentdepereiitubului,lasuprafaa mediului(ex.E.coli) mediulesteclarcudezvoltareauneimembraneuscate,lasuprafa(ex.Bacillus subtilis) mediulesteclarcuapariiaunuidepozitfloconosaderentlabazatubului(B.anthracis) mediulesteclar,iarlasuprafasedezvoltomembrangroas,plisat(M. tuberculosis).

Aspectulculturilorpemediisolide
Condiiiledecultivareiaspectulculturiisuntcaracterecheienidentificareabacteriilor. Aspectulcoloniilorvariaznfunciedemicroorganismulimplicat,frapermitediferenieride speciedefinitive(darauutilitatencontextulstudieriituturorcaracterelor)nanumitecazuri sugereazdiagnosticul,darntotdeaunaorienteazsprealtetestrinecesare. Trebuiesexaminmurmtoareleelemente: dimensiunea(coloniilepotfimari,depeste2mmaacumseformeazn cazulStaphylococcusspp.,K.pneumoniaeetcsauncazullevurilormedii,decirca12mmpentru multedintrebacteriilestudiatemici,sub1mm,spreexempluncazulStreptococcusviridans,etc ifoartemici,caresepotexaminacuajutorulstereomicroscopului,aacumsentmpln cazulMycoplasmaspp.sauUreaplasmaspp.) marginile(regulate,neregulate,ntregi,circulare,erodate,zimate,ondulate,lobate, filamentoase,acoperitecumiceliupufos,invadndmediulnvalurietc) forma(punctiform,circular,neregulat,dendritic,filamentoas,lenticular) relieful(plat,acuminat,convex,bombat,ombilicat,papilat) suprafaa(neted,umed,lucioas,mat,uscat,granular,rugoas,papilat, zbrcit,mucoid,pufoasetc) culoarea(pigmentate,pigmentareaestelanivelulcolonieisaualmediului, nepigmentateacestcaracterdepindedepigmeniiproduisau/ideindicatorideculoaredin mediu) opacitatea(transparente,semitransparente,opace) consistena,aderenalamediu(examinatedeex.cuajutorulanseibacteriologice) altecaractere,carevorfiprezentatencontinuare. Tipuridecolonii ColoniaS(smooth)aresuprafabombatineted,umed,marginicirculareiadesea aspectstrlucitor.Germeniipstreazstructuraantigenicinuaglutineazspontancusoluie salinfiziologic.Germeniicapsulaiipstreazcapsula.Virulenaesteconservat.Majoritatea

bacteriilorstudiateprecumilevurileformeazcoloniidetipS(S.aureus,S.pyogenes,E. coli,Candidaalbicansetc). ColoniaR(rough)esteplat,mat,uscat,suprafaaeiprezintrugoziti,marginilesunt crenelate(zimate).Structuraantigenicnuestecaracteristic.Nupstreazcapsula.Virulenanu esteconservat(excepiiB.anthracis,M.tuberculosis,C.diphteriae). ColoniaM(mucoid)estemare,strlucitoare,umed,mucoas.Estedatdeexemplude bacteriilecareprezintcapsul(exempluKlebsiellapneumoniae). Aspecteparticulare fenomenuldeinvazie,reprezintuncaracterdeidentificarepreliminar pentruProteusspp.,obacteriefoartemobildacnsmnmotulpincareaparineacestuigen laperiferiauneiplciPetricumediusimplu(agarizat2%),delaloculnsmnriiculturase dezvoltnvaluriconcentrice(sentindedinaproapenaproape)petoatsuprafaamediuluipe anumitemediiselective,invaziaesteinhibatisepotobinecoloniiizolate(adugmlamediulde culturacizisausruribiliare,tiosulfatdesodiuetc) fenomenullinieidedemarcaie,reprezintuncaracterutilnstudii epidemiologice,ncazulncaretulpinileimplicateaparingenuluiProteusdacpeoplaccu mediusolidcultivm2tulpinidiferite,n2puncteopuse,tulpinilesevordezvoltainvadndpnla unpunctnapropierealinieidentlnire,undesevacreaoliniededemarcaientrecele2tulpini (distande12milimetri)dactulpinilenusuntdiferitevaavealoccretereanvalurifr demarcaiecudezvoltareauneipnzecontinuedecultur fenomenuldecrare,reprezintovariantdeizolarenculturpurauneitulpini deProteuscultivareaunuiproduspatologicnlichiduldecondensalunuitubcugeloznclinat incubatnpoziieverticalvaconduce(ncazulncarenp.p.existotulpindeProteusspp.)la obinerean24oreauneiculturipuredeProteus,caresevadezvoltanvalurisuprapusepnla parteasuperioaramediuluidecultur apariiacoloniilorncapdemeduz/coamdeleu,aspectcarepoatefi caracteristicncazulizolriiuneitulpinideBacillusanthraciscoloniilesuntmari,albcenuii,detip R,iarlaperiferiacoloniei,cuajutoruluneilupe,sepotobservaprelungiriondulatecareaudusla denumirilemenionatemaisus apariiacoloniilorpufoase,spreexemplupemediulSabouraud,la2830C,dup circa7zile,coloniiledeCoccidioidesimmitisdezvoltunmiceliuaerian,devinpufoase,cresci acopernctevazilesuprafaamediuluiiniialalbe,devinntimpgalbenmaroniicoloniipufoase potapreaincursuldezvoltriinanaerobiozauneitulpinideClostridiumtetanietc.

Caracteremetabolice
Existnumeroasetestecarepermitinvestigareaacestorcaracterealemicroorganismelor.n continuarevomprezentadoarctevadintreacesteteste(veziicapitolul12precumidiferite capitoledinparteaspecial).ncapitolul11vommaidiscutaidesprectevadintretestelecare evideniazcaracteredepatogenitatealebacteriilorsaufungilor.Estederemarcatfaptulcunele dintretestelecarevorfidiscutatearputeafiincluseattngrupulcaracterelormetabolicectin grupulcaracterelordepatogenitate(ex.hemolizancazulanumitormicroorganisme,producerea

unorenzimecucaracterdetoxineetc).

1.Pigmentogeneza
Pigmentogenezaestecaracteristicbacteriilorcromogeneiestedependentdecondiiilede cultivare.Poatereprezentaunelementutilpentruidentificare(deexemplupentruPseudomonas aeruginosasaupentruStaphylococcusspp.). Duplocalizareapigmentului,bacteriilepotficromofore(pigmentulestelegatncitoplasm) paracromofore(pigmentulesteprezentnperetesaunstratulmucos,deexemplupigmentulauriu laS.aureus,pigmentulgalbencitrinlaS.saprophyticus)cromopare(pigmentulalbastru,sau galbenverzui,saudealtculoareestedifuzibilnmediu,deexemplulaPseudomonasaeruginosa). Fungiipotproduceoseriedepigmeni,spreexemplucoloniiledeCandidaalbicansauculoare alb.Mucegaiurileproducovarietatemultmaimaredepigmeni(ex.Aspergillusdeflectuscolonii cenuiicuperiferiarozsaucupetegalbene,Aspergillusflavuscoloniigalbenverzuipnlaverde nchisiarprivitepeparteacealaltaplciisuntroiibrune,Aspergillusfumigatuscoloniiiniial albecaredevinalbastreverzuisaualbastreiarprivitepecealalaltparteaplciisuntcoloratebrun saunalteculori,Aspergillusnigercoloniiiniialalbecaredevinbrunnegrepstrndoculoare albpecircumferiniarprivitepecealalaltparteaplciisuntcoloratengalbenetc).

2.Producereaunorhemolizine
Unelemicroorganismeproducenzime(hemolizine)carelizeazhematiiledinmediiledecultur cusnge.Hemolizaarediferiteaspectenfunciedemecanismuldeaciuneispeciadeoriginea hematiilor(cal,berbec,iepureetc).Ctevaexempledehemolizine: 1.ahemolizinaproduceolizincompletahematiilor,zonaavndoculoareverzuie (ex.Streptococcusviridans,Streptococcuspneumoniae) 2.ahemolizinaproducelizahematiilorn2zone,napropiereacolonieiexistunhaloude hemolizincompletnconjuratdeozondehemolizcomplet(ex.uneletulpinideStreptococcus spp.) 3.bhemolizinaproducelizacompletahematiilor,zonadehemolizesteclar (ex.Streptococcuspyogenes,Bacilluscereus,Listeriamonocytogenes,Haemophilusducreyi) 4.bhemolizinacareproduceohemolizdetipcaldrece(zonedehemolizincompletla 37Ccare,dupmeninereaculturiila+4Ctimpdectevaore,devinecompletex.anumitetulpini deStaphylococcusaureus) 5.ghemolizinaprodusdeStaphylococcusspp.lizeazdeiepure,om,oaie,darnuproduce zonedehemolizpeagarsngencazulstreptococilor,ghemolizaindicabsenahemolizei.

3.Producereaaltorenzime
catalaz(ex.Mycobacteriumspp.,Staphylococcusspp.) carbohidraze(evideniatepemediidifereniale,vezicapitolele12i2834) gelatinaz(culturamicrobianlichefiazgelatina,ex.Clostridiumperfringens) lecitinaz(ex.Bacillusanthracis,Clostridiumspp.) nitratreductaz(ex.Mycobacteriumspp.) oxidaz(ex.Neisseriameningitidis,N.gonorrhoeae,Pseudomonasaeruginosa,Vibrio cholerae) termonucleaz(ex.Staphylococcusaureus)etc. 4.Altecaracteremetabolice aciuneareductoare(evideniatdeex.laC.diphteriaecultivatpemediucuteluritdeK)

sensibilitatealadiferitetemperaturi toleranalaunanumitpH(ex.V.choleraesemultipliclapHalcalin) toleranalaoanumitconcentraiedeNaCl(ex.Staphylococcusaureus) sensibilitatealaoptochin(ex.S.pneumoniae)saulabacitracin(ex.S.pyogenes)etc.

Caracteredepatogenitate
Patogenitateareprezintcapacitateaunuigermendeadeclananorganismulgazd fenomenemorbide,patogene,modificrilocale,generaleifunctiolaesa.Patogenitateaesteun atributdespecieiestedeterminatgenetic.Virulenareprezintgraduldiferitdepatogenitate exprimatncadruluneispecii.Esteunatributaltulpiniimicrobieneimplicate. Caractereledepatogenitatepotfievideniateinvitrosauinvivo.

Testeefectuateinvitro
examinareaaspectuluicoloniilor(majoritateaspeciilorbacterienesuntpatogenenforma S,cuexcepiabacililorantraxului,diftericituberculos)areaspectorientativ ,cuefectuareaanumitortestebiochimice/metaboliceaspectorientativ(examinarea pigmentogenezei,fermentareamanitei,testulcoagulazei,testulfibrinolizei,producereade hemoliziteetc)dintretestelemenionateestedeluatnconsideraienprimulrndtestul coagulazei evideniereaproduceriiunortoxine endotoxine(testulLimulusprezenaendotoxineiproducegelificareaunuilizat deLimuluspolyphemus) exotoxine(testulELEK/vezicapitolul16,ELISA,efectecitopatice,testulproduceriide lecitinaz,testulplcilorsemineutralizateetc).

Testeefectuateinvivo
nacestscopseutilizeazanimaledelaboratorsensibilefadeinfeciaexperimentalcu diferitemicroorganismesaufadeanumitetoxinemicrobiene(ex.oarecialbi,cobai,iepuri,pisici etc.,nfunciedespeciamicrobianpentrucareseefectueaztestul/speciadeanimalceamai sensibilicaleadeinoculareceamaipotrivit).Animaleledelaboratortrebuiesfiesntoase, verificareasefaceprinexaminareaacestoranaintedeefectuareatestrii,peparcursula1014zile. Dupinoculare,animalelesuntmarcateiinutesubobservaie(feritedeoricecontaminare) observaiaesteclinicurmrinduseevoluiacurbeifebrileiapariiasemnelordeboal.Pentruorice testserecomandutilizareaunuilotdeanimalepentruacelaitipdeinoculare,ceeacecrete suplimentarcostulacestuitipdetestare.ncontinuarevomprezentactevaexemple: identificareaBacillusanthracis:pregtimosuspensieatulpiniicareurmeazafitestat nsoluiesalinfiziologiciinjectmsubcutanat,cte0,2mlpentrufiecareanimal,launlotde oarecialbiurmrimevoluiatimpde23zileiefectumfrotiuridinsngelerecoltatprin puncionareacorduluisauamprentedesplin testareatoxigenezeiuneitulpinideCorynebacteriumdiphteriae:obinemoculturde24 oreatulpiniideidentificatinoculmsubcutanat,nregiuneaabdominalcte25mldecultur pentrufiecareanimal,la2loturidecobai(unlotneprotejat,aldoilealotprotejatcucte1000UIde

serantidiftericpentrufiecareanimal)ncazulncaretulpinaestetoxigen,animaleleneprotejate vormurin14zile,cusemnedeintoxicaiedifteric(congestiacapsulelorsuprarenale,lichidseros, serofibrinossaufibrinosnpleur,pericard,peritoneuiedemgelatinoslaloculdeinoculare)ntimp ceanimaleleprotejatenuprezintnicioreacie toxinotipiancazulsuspicionriiuneitoxiinfeciialimentarecuClostridiumbotulinum:se obinesupernatantdupcentrifugareaunorprodusepatologicesaualimentelorincriminatei trituratelacareseadaugantibioticepentruainhibamultiplicareafloreideasociaiesevautiliza supernatantcaatareisupernatantdupmenineretimpde15minutela100C(ircire)toxina botulinicfiindtermolabilsevorinocula4loturideoareci(0,5ml/oarece)saucobai(1ml/ cobai)dupcumurmeaz supernatantcaatare supernatantinactivat 0,1mlserantitoxinAurmatla30minutedesupernatant 0,1mlserantitoxinBurmatla30minutedesupernatant spreexemplu,ncazulncareanimaleledinloturile1i4mor,iaranimaleledinloturile 2i3supravieuiesc,np.p.existtoxinbotulinicdetipA identificareainfecieipulmonarecuStreptoccuspneumoniaesaucuKlebsiella pneumoniae:realizmunamestecdesputisoluiesalinfiziologicsteriliinoculm subcutanatsauintraperitonealcte5mldep.p.pentruunanimal,launlotdeoarecialbiprezena microorganismuluivaproducen2448deoreosepticemiemortalfacemfrotiuriiculturidin sngelerecoltatprinpunciecardiac,lichidperitonealiamprentdesplinpentrudeterminarea tipuluicapsularputemfacereaciadeumflareacapsulei(vezicapitolul12) identificareaetiologieistafilocociceauneitoxiinfeciialimentare(producerea enterotoxinei):dupceseobinenculturtulpinadestafilococ(porninddelamateriifecale,lichid devrstur,alimente)serepicnagar0,5%iseincubeaz48orenatmosferdeCO2se filtreazmediuliarlichidulobinutsemeninelatemperaturadefierberetimpde30minute (enterotoxinaestetermostabil)testulDolmansefacelapisoide23lunilacareseinoculeaz intraperitoneal13mldinfiltratulrcitdup20120minute,ncazulprezeneienterotoxineiapareo staredenelinite,agitaieurmatedediaree,vrsturiisomnolendup12zileanimalele inoculateirevin cercetareapatogenitiiuneitulpinidestafilococsefacelaiepure,careesteanimalulde laboratorcelmaisensibillainfeciaexperimentalcuStaphylococcusaureus testareapatogenitiiunorlevuri(ex.Candidaalbicans):porninddelaoculturde24de orenmediulSabouraudlichidseparmsedimentulirealizmosuspensie0,2%aacestuian soluiesalinfiziologicsterilinoculmnvenelecoziilaunlotdeoareci(cte0,20,8mlpentru fiecareanimal)suspensiaobinutiurmrimevoluiaanimalelortimpde410ziledacestevorba deotulpindeC.albicanspatogen,animalelevormuridupcirca1sptmn (anatomopatologicvomputeaevideniaabcesemiliarerenale,splenice,hepatice)etc.

12. Teste de identificare avnd la baz diferite caractere biochimice ale bacteriilor i fungilor
Existnumeroasetesteutilenidentificareabacteriilorifungilor,avndlabazdiferite proprietibiochimicealeacestoractevadintretestevorfiprezentatencontinuare. Acestetestedeidentificareauoimportandiferitladiferitelegenuriispeciibacterienei respectivfungiceifacpartedinetapaapatraadiagnosticuluidelaboratorbacteriologicsau micologic.Schemadeprezentareestensasemntoare.

12.1.Utilizareaunuicarbohidratcaunicsursdecarbon Auxanograma
Principiu: Diferitelelevuriprezintunanumitechipamentenzimaticcuajutorulcruiapot,spreexemplu, sutilizezeunanumitcarbohidratcaunicsursdecarbon.Dezvoltareauneilevuripeunmediun careesteinclusunsingurcarbohidratdemonstreazutilizareaacestuiacaunicsursdecarbon (asimilareacarbohidratuluirespectiv).nmodasemntorsepoatetestacapacitateaasimilriiunor substaneazotatedectrelevuri. Materialenecesare: culturapuralevuriideidentificat,pepantdeagarSabouraud mediupentruasimilareacarbonuluidectrelevuri soluiedevitamine soluii5%alecarbohidrailor(ex.glucoz,maltoz,zaharoz,lactoz,galactoz, trehalozetc)napdistilat,sterilizateprinfiltrare rondeledinhrtiedefiltru,sterile(diametru6milimetri) Tehnicadelucru: Culturafungicestesuspensionatn5mldeapdistilatsteril.Mediuldeculturpentru asimilareacarbonuluiestenclzitpnlatopireiapoircitla50C.ntruntubsterilcu capacitateade30mlintroducemaseptic20mldemediu,2mlsoluiedevitaminei0,25mldin suspensiafungic(levuric)dupcareamesteculesteturnatntroplacPetristeriliseateapt solidificareamediuluimpreuncucelelaltecomponente. Depunemaseptic5rondeledinhrtiedefiltru,unancentrui4spreperiferiafiecruicadranal plciiiimediat,utilizndoanscudiametrulbucleide3mm,depunempefiecaredintrerondele ceeacevomprelevadindiferite(5)soluiidecarbohidrai obligatoriuvomprelevadinsoluiadeglucoz dacdorimstestmpentru9carbohidraidiferiiavemnevoiede2plciPetri. Incubmla2830Cpentru2448ore,apoiurmrimapariiaculturiinjurulrondelelor.

Existialtemodalititehnicenrealizareaauxanogramei. Interpretare: trebuiesexistemultiplicarelevuric(culturprezent)njurulrondeleipecaream depusoansdinsoluia5%deglucoztoatelevurilepotfolosiglucozadreptunicsursdeC senoteazdezvoltareaculturiinjurulrondelelorundeaceastaesteevideniati utilizndrezultateleobinute,ncontextulcelorlaltedatedelaborator,sestabiletespecialevuric Controldecalitate: tulpinadereferindeCryptococcuslaurentii tulpinadereferindeCandidapseudotropicalis

12.2.Testulsensibilitiilabacitracin
Principiu: MultiplicareastreptococilordegrupAesteinhibatdebacitracin(antibioticprodusdeBacillus licheniformis).SeapreciazcdintretulpiniledeStreptococcuspyogenes,maipuinde1%sunt rezistentelabacitracin. Materialenecesare: coloniihemoliticeizolatepegelozsnge microcomprimatedebacitracincu0,04Uicu0,1U(inucu10U/microcomprimat)

Tehnicadelucru: Sepreleveaz34coloniihemoliticeisensmneaznstriurifoarteapropiate,suprapuse n3direcii,peojumtatedeplacPetricugelozsnge(dinmotivedeeconomiesepoateutiliza iunsectordeplac). Plasmncentrularieinsmnateunmicrocomprimatcubacitraciniincubmpentru1824 orela3537C. Interpretare: Testulestepozitiv(bacteriaestesensibillabacitracin)ncazulncare rezultoinhibiieacreteriibacteriene,indiferentdediametru,njurul microcomprimatuluicu0,04Ubacitracin rezultoinhibiieacreteriibacterienecudiametrul11mm,njurul microcomprimatuluicu0,1Ubacitracin. Controldecalitate: MartorpozitivStreptococcuspyogenes MartornegativStreptococcusagalactiae

12.3.Testulbilolizei(Neufeld)
Principiu:

Pneumococii(Streptococcuspneumoniae)capsulaisuntlizainprezenabileisausrurilor biliare(uneletulpininecapsulatenusuferacestproces)prinactivareauneienzimeautolitice. Materialenecesare: coloniiizolate,ahemolitice soluiededezoxicolatdesodiu10% soluiesalinizoton apdistilat Tehnicadelucru: Sepreparnsoluiesalinfiziologicosuspensieporninddelacoloniileahemoliticeizolate. TurbiditateasuspensieitrebuiesfieasemntoarecuturbiditateaetalonuluiMcFarland0,5sau1. Repartizmcte0,5mldinsuspensien2eprubetedesticl. nprimultubadugm0,5mldezoxicolatdesodiuiarnaldoileatubadugm0,5mlap distilat.Incubmtimpde2orela3537C. Interpretare: Testulestepozitiv(bacteriileaufostlizatenprezenadezoxicolatuluidesodiuisunt pneumococi)dacsuspensiasaclarificatntubulncareamadugatdezoxicolatinusa clarificatntubulncareamadugatapdistilat Testulestenegativdacambeletuburiaurmasopace. Controldecalitate: MartorpozitivStreptococcuspneumoniae MartornegativStreptococcusviridans.

12.4.TestulCAMP
Principiu: StreptocociidegrupBproducosubstanextracelulardenaturproteicdenumitfactorul CAMP(dupiniialelecercettorilorcareaupuslapuncttestul/Christie,Atkins,MunchPetersen), careacioneazsinergiccublizinaprodusdeuneletulpinideStaphylococcusaureus.Dac aceste2microorganismesuntcultivaten2striuriperpendiculare(frsseating),acolounde cele2striurisenvecineaz,lizahematiilor(deberbecsaudebou)aparemrit,nformdevrf desgeat. Materialenecesare: coloniidestreptococihemoliticisaunehemolitici(dacunanumitcontextsauanumite testesugereazprezenaunuistreptococdegrupB) plciPetricugelozsngedeberbecsaudebou tulpinadeS.aureusproductoaredeblizin(ATCC25923)/alternativamputeautiliza fiidinhrtiedefiltruimpregnatecublizinstafilococic ATCC=AmericanTypeCultureCollection tulpinidecercetat Tehnicadelucru: InoculmnstriuotulpindeS.aureusproductoaredeblizin,peunuldindiametreleplcii

cuagarsnge.Perpendicularpeaceststriuvominocula(frsatingemstriuldestafilococ)o tulpinCAMPpozitiv,otulpinCAMPnegativitulpinidecercetat. Incubmla3537Caerobpnadouazisautimpde6orenatmosferde510%CO2. Interpretare: apariiauneizonedehemolizlrgite,nvrfdesgeat(vrfulspretulpinade stafilococ)reprezintuntestpozitiv(confirmatdemartorulpozitiv) hemoliznemodificattestnegativ(confirmatdemartorulnegativ) Controldecalitate: MartorpozitivStreptococcusagalactiae MartornegativStreptococcuspyogenessauunstreptococdegrupD

12.5.Testulproduceriidecatalaz
Principiu: Catalazadescompuneperoxiduldehidrogennapioxigen.

12.5.A.pentrumycobacterii
Materialenecesare: culturapuramicroorganismuluicareurmeazafitestat,pemediuLwenstein soluiedeperoxiddehidrogennTween80iapdistilat Tehnicadelucru: Pesteculturabacterianseadaug1mldesoluiedeperoxiddehidrogeniselastubulla temperaturacamerei. Semsoarnlimeacoloaneidebuledeoxigenisenregistreazvaloareanmm. Interpretare: Acestaesteuntestsemicantitativ,careajutladifereniereaspeciilordemycobacteriin funciedecantitateadecatalazprodus.nvedereauneidiferenierisuplimentare,sepoateutiliza testultermosensibilitiicatalazei(Mycobacteriumtuberculosis,spreexemplu,produceocatalaz termosensibil). Notificareasepoatefacenmodulurmtor peste20mm+++ 1020mm++ 510mm+ <5mm Controldecalitate: MartorpozitivM.fortuitum Martormaislabpozitiv(testsemicantitativ)M.tuberculosis/ncazultestuluipentru termosensibilitateacatalazeirezultatulvafinegativdupnclzire20minutela68C Martornegativmediuneinoculatpestecareseadaugsoluiedeperoxiddehidrogen

12.5.B.pentrualtemicroorganisme(spreexempludiferenierea

stafilococilordealtemicroorganisme)
Existmaimultetehnicidintrecarevomprezentatestulrealizatpeosuspensiebacteriani respectivtestulcatalazeiprinsuspensionareaculturiipelam Materialenecesare: coloniiizolatedezvoltatepemediifrsnge/ncazulncareurmeazstestmo bacteriecaresadezvoltatpegelozsnge,deoarecepotapreareaciifalspozitivedatorit catalazeieritrocitare,urmeazsprelevmculturabacterianfraatingemediuldeculturn acestsensurmeazsutilizmoansfirisprelevmculturdinporiuneaceamaibombata colonieideidentificat soluiedeperoxiddehidrogen3% apdistilat Tehnicadelucru: B1. Realizmosuspensiebacteriandensn12mldeapdistilatlacareadugm12picturi desoluiedeperoxiddehidrogen3%. Observmimediatiduptrecereaa5minuteapariiabulelordeoxigen. B2. Peolamdesticlpunemopicturdinsoluiedeperoxiddehidrogen.Suspensionmcultura npicturadeH2O2iurmrimtimpde30desecundeapariiabulelordeoxigen. Interpretare: apariiabulelordegazsemnificuntestpozitiv,bacteriaproducecatalaz absenabulelordegazsemnificuntestnegativ. Controldecalitate: MartorpozitivStaphylococcusaureus MartornegativStreptococcuspyogenes

12.6.Testulutilizriicitratuluicaunicsursdecarbon (Simmons)
Principiu: Uneledintreenterobacteriideinunechipamentenzimaticcarepermiteasimilareaiutilizarea citratuluicaunicsursdecarbon.UtilizndunmediucareconinecitratiunindicatordepH, putemindentificaalcalinizareamediuluiirespectivaceaenterobacteriecarepoateutilizacitratul caunicsursdecarbon. Materialenecesare: osuspensierelativdensobinutdincolonia(culturpur)bacterieipecaredorimso identificm mediulcareconineacidcitric0,2%(Simmons),turnatnpantneprubetemicin prezenaindicatoruluidepHilapHneutru,mediulnensmnatareoculoareverde Tehnicadelucru: cuajutoruluneianse,prelevmsuspensiebacterianpecareonsmnmntrun singurstriupesuprafaamediuluiSimmons

incubmla37Ciexaminmdezvoltareaculturiiieventualamodificareaculorii mediului Interpretare: apariiauneiculturibacterienedealungulstriului,nsoitdemodificareculoriicare devinealbastr,semnificuntestpozitiv=bacteriautilizeazcitratulcaunicsursdecarbon nprezenaunuitubfrdezvoltareaculturii,culoareamediuluifiindverdeputemnotifica unrezultatnegativ Controldecalitate: MartorpozitivKlebsiellapneumoniae/Enterobactercloacae MartornegativEscherichiacoli

12.7.Testulcoagulazei
Principiu: Stafilocociicoagulazopozitiviproducoenzimcareactiveazcoagulareaplasmei.Exist2 tipuridecoagulaz:coagulazalibericoagulazalegatdeperetelecelular(clumpingfactor). Coagulazaliberacioneazpeprotrombin.Coagulazalegatacioneazdirectpefibrinogenul plasmatic.StafilocociicoagulazopozitivisuntconsideraiStaphylococcusaureus. Materialenecesare: coloniiizolatepemediuneselectivaletulpiniicareurmeazsfietestat plasmdeiepure(depreferat)/ncazulncareplasmadeiepurenuestedisponibilse poatefolosiplasmuman(cusensibilitatemaimarelacoagulazaprodusdeS.schleiferiiS. lugdunensis) lame,tuburi

Tehnicadelucru: a.Testulcoagulazeipelam Verificprezenacoagulazeilegate.Pelamsedepuneopicturdeapdistilat(nusoluie salinfiziologic).Suspensionmiomogenizm12coloniinpicturadeapdistilat(suspensia trebuiesfietulbureomogen). Ateptmcirca10secundeiurmrimapariiauneieventualeautoaglutinri(cazncarenu puteminterpretarezultatultestuluitrecemlaefectuareatestuluicoagulriintub).Dacpictura rmnetulbureomogen,adugm1picturdeplasmiurmrimapariiacoagulilortimpde 1015secunde. Alternativsepotutilizatrusecomerciale. Interpretare: apariiacoagulilorn1015secundesemnificuntestpozitiv absenacoagulilorsemnificuntestnegativ/5%dinS.aureusdaureaciifalsnegative latestulpelam,fiindnecesarrealizareatestuluicoagulazeintub b.Testulcoagulazeintuburi

Verificprezenacoagulazeilibere.Pipetmaseptic0,5mldeplasmntruntubsteril. Prelevmocolonieiodescrcmnplasmadintub(alternativputemnsmnaocoloniede testatn0,5mlbulionglucozat,incubm1824orela3537Civomamestecaplasmacu suspensiamicrobianrezultatdupcultivare). Incubmtubultimpde4orela3537C(pentruuneletulpinireaciapoatefipozitivchiarimai repedede4ore).Rezultatulreacieiesteexaminatprinnclinareatubului.Dacreaciaeste negativla4ore,reincubmpnla24ore. Atenie,cheagulpoatefilizatdestulderapiddupmomentulformrii(uneletulpinideS. aureusproducfibrinolizin).Dinacestmotiv,uniiautorirecomandexaminaretubuluitestdin30n 30minute,nprimele4ore. Interpretare: formareaunuicheag,semnificunrezultatpozitiv absenacheaguluisemnificunrezultatnegativ Controldecalitate: MartorpozitivS.aureus MartornegativS.epidermidis

12.8.Testulfilamentrii,pentruCandidaalbicans
Principiu: Dupcultivarenseruman,serbovin,serdeberbecetctimpde24ore,la3537C, blastoconidiileindividualedeC.albicansproducfilamentescurte(tubigerminativi). Materialenecesare: coloniiizolate,nscopulidentificrii seruman,serbovin,serdeberbec,serfetaldeviel,serumalbuminbovinetc aplicatoaredelemnsausterilepipetePasteurcuvrfulefilat,lameilamele,tuburimici

Tehnicadelucru: ntruntubdedimensiunimici(ex.12/75mm)introducemaseptic0,51mldeserumansau alttipdeser.Cuunaplicatorsteril(caunbeiga)atingemcoloniacaretrebuieidentificatiapoil introducemntub.Incubmtimpde24ore,la3537C. Realizmunpreparatntrelamilameliexaminmlamicroscopuloptic. Interpretare: prezenaunortubigerminativicuuncalibrumaingustdarcuolungimede34orimai maredectdiametrulceluleideorigine,carecontinudirect,frniciostrangularesausept blastoconidia,semnificuntestpozitiv absenaaspectuluimenionatmaisussauprezenaunorpseudotubigerminativicare suntdelimitaiprintrostrangulareiunseptdeblastoconidiesemnificuntestnegativ Controldecalitate: MartorpozitivC.albicans MartornegativC.tropicalis

12.9.A.MediulmultitestMIU(mobilitateindoluree)
Principiu: Mediulconineuree,triptofan,roufenol(indicatordepH)iestecondiionatntuburide dimensiunimici.Gelozaestemoalepermindmobilitateamicroorganismuluinsmnathidroliza ureeivaducelaalcalinizaremediului(culoareavireazdelagalbenlarou)producereadeindoldin triptofanvafiindicatdenroireareactivuluiEhrlich Materialenecesare: tuburidedimensiunimicicumediulMIU hrtiueindicatorcureactivEhrlich(sepoatefolosiireactivKovacs)saureactivEhrlich /Kovacscondiionatnsticluedeculoarebrun coloniideidentificat(coloniiizolate,culturpur) ansfiretc Tehnicadelucru: Utilizmpentrunsmnareoansfir.Prelevmdincoloniaizolatpemediuneselectiv(dac pentrucultivareaufostutilizatemediiselectivetrebuiesprelevmcugrij,frsatingemmediul decultur)insmnmmediulprinneparencercndsrealizmonsmnarenlinie dreapt.Fixmdedophrtiuaindicatornaafelnctsajungdeasupracoloaneidemediu,fr slatingem.Incubmla3537Ctimpde24ore.ncazulncarenuarelocvirareaculoriimediului, incubmpnla48deore. Interpretare: dinpunctuldevederealmobilitii opacifiereaaparenumaipetraiectuldensmnarebacteriaesteimobil opacifiereaesteuniformncoloanademediubacteriaestemobil dinpunctuldevederealproduceriiureazei culoareacoloaneirmnegalbenbacteriaesteureazonegativ culoareadevineroiebacteriaesteureazopozitiv apariiaunuiineldeculoareroielasuprafaamediuluinureprezintuntestpozitiv dinpunctuldevederealtransformriitriptofanuluinindol schimbareaculoriihrtieilarouvioletbacteriaesteindolpozitiv culoareahrtieirmnealbbacteriaesteindolnegativ alternativ,nlipsahrtiuelorindicatorsepoatepicurareactivEhrlichlasuprafaa mediuluiiinterpretamodificarea/lipsamodificriiculorii Controldecalitate: MartorpozitivProteusmirabilisM+U+I+ MartornegativShigellaspp.MUI

12.9.B.MediulmultitestMILF(mobilitateindol lizindecarboxilazfenilalanindezaminaz)
Principiu: Mediulconineocantitatesczutdeglucoz,peptoncuDLtriptofan,Llizin,

DLfenilalanin,bromcrezolpurpursoluie2%(indicatordepH)iestecondiionatntuburide dimensiunimici.Gelozaestemoalepermindmobilitateamicroorganismuluinsmnat. ProducereadeindoldintriptofanvafiindicatdenroireareactivuluiEhrlich.Decarboxilarealizinei vaducelaalcalinizaremediului(nabsenalizindecarboxilazeirezultouoaracidifiereamediului datoritfermentriiglucozei).Dezaminareafenilalanineiducelaapariiadeacidfenilpiruvici amoniacadugndclorurfericrezultoculoareverde. Materialenecesare: tuburidedimensiunimicicumediulMILF hrtiueindicatorcureactivEhrlich(sepoatefolosiireactivKovacs)saureactivEhrlich /Kovacscondiionatnsticluedeculoarebrun coloniideidentificat(coloniiizolate,culturpur) ansfiretc Tehnicadelucru: Tehnicadelucruesteasemntoarecuceaexpuslapunctul12.9.A. Interpretare: dinpunctuldevederealmobilitii opacifiereaaparenumaipetraiectuldensmnarebacteriaesteimobil opacifiereaesteuniformncoloanademediubacteriaestemobil dinpunctuldevederealtransformriitriptofanuluinindol schimbareaculoriihrtieilarouvioletbacteriaesteindolpozitiv culoareahrtieirmnealbbacteriaesteindolnegativ dinpunctuldevederealproduceriilizindecarboxilazei alcalinizareacoloaneitraduceprezenaenzimei acidifiereauoaracoloaneitraduceabsenaenzimei dinpunctuldevederealproduceriifenilalanindezaminazei apariiaunuiineldeculoareverdelasuprafaamediuluiilanivelultraiectuluide nsmnaredupadugareauneipicturideclorurferic10%traduceprezenaenzimei Controldecalitate: MartorpozitivProteusmirabilisM+I+FDaz+LDaz MartornegativKlebsiellapneumoniaeMIFDazLDaz+

12.10.MediulmultitestTSI(triplesugariron)
Principiu: Mediulesteagarizat,condiionatndouzone(ncoloanlabazinpant)iconine glucoz(nraportde1/10fadecelelaltezaharuri),lactoz,zaharoz,citratfericiunindicatorde pH(rouneutru).Parteadreapt(coloana)nuvinencontactcuaeruliofercondiiirelativede anaerobioz.Parteanclinat(panta)ofercondiiidemultiplicarenaerobioz. Concentraiaglucozeiestemaimic,pentrucafermentareaacestuizaharspoatfidetectat chiardacestesingurulzaharmetabolizat.Dacobacteriesedezvoltnparteadreaptvorfi eliberaiaminoacizi,carenzonaaerobvorfidecarboxilaioxidativivormodificapHulspre alcalin.ncazulncarelactozai/sauzaharozanusuntfermentate,cantitateadeacidprodus prinfermentareaglucozei(toateenterobacteriilefermenteazglucoza)estesuficientdemicpentru

capHuldelanivelulpanteisrevinrapidlaneutru.nacelaitimp,pHulrmneacid(iculoarea mediuluirmnegalben)lanivelulcoloaneipentrucncondiiiderelativanaerobioznuareloc decarboxilareaoxidativ.Daczaharuriledelanivelulpanteisuntfermentate,cantitateadeacid produsestesuficientdemarepentrucapHuldelaacestnivelsrmnacidirespectiv culoareapanteisrmngalben. Prezenacitratuluiferic,ncazulncarebacteriaproduceH2Sducelaapariiauneiculorinegre (seformeazsulfitferos). Lanivelulcoloaneisemainregistreaziproducereadegaz(delaapariiaunorbulefinepe traseuldensmnare,pnlafragmentareasaurupereacoloanei). Materialenecesare: tuburidedimensiunimicicumediulTSI coloniideidentificat(coloniiizolate,culturpur) ansfiretc Tehnicadelucru: Utilizmpentrunsmnareoansfir.Prelevmdincoloniaizolatpemediuneselectiv(dac pentrucultivareaufostutilizatemediiselectivetrebuiesprelevmcugrij,frsatingemmediul decultur)insmnmcoloanaprinnepare,apoiretragemansaiatingndsuprafaacoloanei descriemunstriunzigzag.Incubmla3537Ctimpde24ore. Interpretare: nceeaceprivetefermentareaglucozei culoareacoloaneiestegalbenglucozaestefermentat culoareacoloaneirmneroieglucozanuestefermentat(nuesteenterobacterie) fermentareaglucozeipoatefisaununsoitdeproduceredegaz interpretareasefacesimilarpentrufermentarealactozei/zaharozei,lanivelulpantei ncazulncareseproduceH2S,remarcmapariiauneiculorinegrelanivelulcoloanei alteelementeprivindinterpretareaacestorrezultatevorfiprezentatencapitolul28 Controldecalitate: MartorpentrupHacidlanivelulcoloaneiipantei,frproduceredeH2SE.coli MartorpentrupHacidlanivelulcoloanei,pHneutrulanivelulpanteiiproduceredeH2S Salmonellatyphimurium esteposibiliutilizareaaltortulpinimartor.

12.11.Testulproduceriideniacin
Principiu: Mycobacteriileproducntimpulmultiplicriiniacin(acidnicotinic)pecareoutilizeazn sintezaNADiNADP.Majoritateamycobacteriilorposedoenzimcarepoatetransformaniacina libernacidnicotinicmononucleotid.Dacmicroorganismelenuprezintaceastenzim(ex.M. tuberculosis),nmediuldecultursevaacumulaniacin.Niacinaestesolubilnapipoatefi extrasdinmediu(deex.nsoluiesalinfiziologic)iarnreaciecubromuradecianogen(atenie lautilizare!)nprezenaanilineirezultnduncompusdeculoaregalben. Materialenecesare: soluiedeanilin4%(conservatnsticldeculoarebrunla28C)

soluiedebromurdecianogen10%(arfidepreferatdatoritriscurilorfiidehrtie indicatorimpregnatensoluiedebromurdecianogen,produsecomercial) folosimculturi(realizatepemediulLwensteinJensen),nvrstdeminim3sptmni Tehnicadelucru: Folosimosubculturmycobacteriancucretereconfluent.Adugmcuajutoruluneipipete Pasteurapdistilatsterilsausoluiesalinfiziologic.cuajutorulpipeteiPasteur(saucuajutorul uneianse)raclmcoloniilepentruapermiteextracianiacineidinmediu.Tuburilermn1orla temperaturacamerei. Transfermcte0,5mlnfiecaredintrentuburiledetestare.Adugmsuccesiv0,5mlanilin 4%irespectiv0,5mlbromurdecianogen.Examinmdup5minutepentruaobservaapariia culoriigalbenencazulreacieipozitive.naintedeeliminare,vomneutralizatuburileprin adugareaunuivolumegal(aproximativ3ml)deNaOH10%nfiecaretub. Interpretare: apariiauneiculorigalbene,reprezintuntestpozitiv absenaculoriigalbene,reprezintuntestnegativ Controldecalitate: MartorpozitivMycobacteriumtuberculosis MartornegativMycobacteriumavium.

12.12.Testulproduceriidecitocromoxidaz
Principiu: Unelebacteriiproduccitocromoxidaz,enzimcarelipsetelabacteriilestrictanaerobe. Aceasthemoproteinacioneaziasuprauneisubstane,tetrametilpfenilendiaminrezultnd uncompusdeculoarepurpurie DintrebacteriileoxidazopozitiveamintimVibriospp.,majoritateaspeciilor dePseudomonas,Alcaligenesspp,Neisseriaspp.(dintregermeniigramnegativi)iMicrococcus spp.(dintregermeniigrampozitivi) Materialenecesare: soluieapoasdetetrametilpfenilendiamin1%conservatnsticldeculoarebrun latemperaturafrigideruluisaufiidehrtieindicatorimpregnatnreactiv(preparatecomercial) hrtiedefiltru anscufirdeplatinsaupipetPasteur(cudat) coloniiizolatedezvoltatepeagarsnge,agarchocolatsauagarMuellerHinton Tehnicadelucru: Existmaimultevariantetehnice,darvomdiscutadoarunadintreacestea.Punemntrocutie Petriunfragmentdehrtiedefiltrupecaredepunem12picturidesoluieapoasdetetrametil pfenilendiamin1%.Dupsterilizareaircireaansei,prelevmdintrocolonieizolati descrcmculturapehrtiadefiltruprinmicricircularedemicamplitudine. Urmrimapariiauneireaciideculoarenintervalde10secunde Interpretare: apariiauneizonedeculoarepurpurien10secunde,reprezintuntestpozitiv

absenaculoriipurpurie,semnificuntestnegativ apariiazoneicoloratemaitardivnupermiteinterpretareatestului,nprincipiuestevorba despreunrezultatnegativ Controldecalitate: MartorpozitivPseudomonasaeruginosa MartornegativEscherichiacoli

12.13.Testulsensibilitiilaoptochin
Principiu: Majoritateatulpinilordepneumococi(Streptococcuspneumoniae)suntsensibilelaconcentraii sczute(<5g/ml)deoptochin(hidrocloriddeetilhidrocuprein).Uneletulpinialealtorstreptoci careproduchemolizviridanspotfisensibile,darlaconcentraiimaimarialesubstaneiactive,n timpcealtetulpinisuntrezistente. Materialenecesare: discuricuoptochin(5g/disc),cudiametrulde6milimetri plcicuagarsnge tampoanesterile coloniihemoliticeizolate,careurmeazafitestate Tehnicadelucru: Prelevmcuuntamponsterildepreferat23coloniiirealizmonsmnarepejumtatea uneiplcicuagarsnge,naafelnctsrezulteoculturconfluent(dinmotivedeeconomie, nsmnareasarputearealizaipeoptrimedeplacPetri).Plasmundisccuoptochinn centrulzoneinsmnateipresmuorpentrucadisculsadereuniform.Incubmtimpde1824 orela3537Cnatmosferde5%CO2. Interpretare: apariiauneizonedeinhibiiecudiametrulmaimarede14mm,semnificuntestpozitiv absenainhibiieinjuruldisculuisemnificuntestnegativ interpretareaestediferitdacsefolosescdiscurideoptochincualtedimensiuni(ex.cu diametrulde10mm) Controldecalitate: MartorpozitivStreptococcuspneumoniae MartornegativStreptococcusviridans. Frndoialcacestetestereprezintdoarctevaexempledinmultitudineatestelorutilizate nlaboratoruldemicrobiologie.Numainvedereaidentificriidiferitelorspeciimycobacterienesepot utiliza,spreexemplu,peste130detestefenotipice. nelegerealordinpunctdevedereteoreticprecumiutilizarealornmodpracticsuntutileatt pentrustudeni,mediciirezideniaflailadebutulpregtiriinspecialitateademedicindelaborator, pentruviitoriimedicidinaltespecialitictipentrumediciiibiologiiimplicaindiagnosticulde laboratorlanivelclinicsauninteresulsntiipublice. Avndlabaznoiunileteoreticenvate,diferiteleexempleprecumimanualelecareprezint dinpunctdevederepracticdiagnosticulmicrobiologic,fiecaredintreceiimplicaivaputeasaplice

acesteelemente,deprinzndartaacestuidiagnosticattdeutilnpracticamedicallanivel individualsaupopulaional. Ultimultestpecarelvomprezentanfinalulacestuicapitolnusebazeazpeproprietile biochimiceciarelabazcaractereleantigenice(structuraantigenic)alemicroorganismelordin speciaStreptococcuspneumoniae. Datoritfaptuluicnuexistuncapitolspecialaltehnicilorimunologiceundearputeafi integrat,precumidatoritfaptuluicnpaginileprecedenteamprezentattestulbilolizeii respectivtestulsensibilitiilaoptochin(ambeletestefiindnecesarendifereniereaStreptococcus pneumoniaedeStreptococcusviridans)amdecissincludemaici,acesttest.

12.14.Testulumflriicapsulei(Neufeld,Quellungtest)
Principiu: Complexulantigenanticorpformatnurmacuplriiantigenuluicapsularpneumocociccu anticorpiianticapsulariareorefringensuperioarmediuluinconjurtoriapare,laexaminareacu microscopuloptic,caunhalouclardispusnjurulbacteriilor,haloucarearedimensiunimaimari decthaloulidentificatprinmicroscopie(preparatcoloratcualbastrudemetilen)nlipsaserului anticapsular. Materialenecesare: culturauneibacteriicaresepresupunecaparinespecieiS.pneumoniae sepotutilizaiprodusepatologice(ex.LCR) seranticapsularpolivalentserurianticapsularemonovalente(detip) soluiedealbastrudemetilen(1%) soluiesalinfiziologic lameilamele microscopoptic Tehnicadelucru: A.examinareapreparatuluimartor realizmosuspensieomogenopalescentdinculturabacteriann0,5mlsoluiesalin fiziologiciadaugm0,5mlsoluiedealbastrudemetilen depunemopicturdinsuspensiepeolamdemicroscop,acoperimcuolameli examinmdimensiuneahalouluicareaparedatoritprezeneicapsulei B.examinareapreparatuluitest depunempeoaltlamdemicroscopopicturdinsuspensiabacterianinstricta vecintateaacesteiadepunemopicturdinserulpolivalentanticapsular amestecmprinmicricircularecele2picturi ateptm10minute(preparatulsemeninencamerumed) Interpretare: identificareaunorcocicolorainalbastru,dispuiizolatsaunpereche,nconjuraideun halouclar,maibinedefinitidedimensiunimaimaridecthaloulvizualizatprinexaminarea preparatuluimartorsemnificuntestpozitiv,respectivprezenapneumococilor ncazulncarenuestesesizatniciodiferenntrepreparatultestipreparatulmartor

neaflmnsituaiaunuitestnegativ dupidentificareaunuitestpozitivfadeserulpolivalent,putemutilizaseruri monovalente,specificedetippentruaindentificatipulcapsular testulumflriicapsuleisepoaterealizaipornindpeproduspatologic Controldecalitate: MartorpozitivtulpincapsulatdeStreptococcuspneumoniae MartornegativStreptococcusviridans.

15. Reacii antigen-anticorp utilizate n microbiologie

BazelemolecularealeinteraciuniiAgAc
Reaciadintreantigen(Ag)ianticorp(Ac)necesitinteraciuneadeterminantuluiantigenic (epitop)cusitusuldecombinarealanticorpului(paratop). FactoriicarecondiioneazinteraciuneaAgAcsunt: complementaritateastructuraldintreepitopiparatop(reaciaestespecific) complementaritateapresupuneadaptareaconformaionalacelordougrupri,detipulcheien broasc complementaritateaelectrochimicagruprilorcareintrnreacieesteoconsecina complementaritiistructuralepentrustabilizarealegturiiintrnaciuneforeintermoleculare,care suntlegturinecovalente,forenespecificecuvaloaremic,spreexemplu legturidehidrogen/energiedelegare37kcal/mol foreelectrostatice(coulombienesauionice)/energiedelegare5kcal/mol legturivanderWaals/energiadelegare12kcal/mol legturihidrofobe. Complementaritateastructuralsauforeleintermolecularenusunt,suficientefiecarenparte, pentruaformalegturistabileestenecesarndeplinireaambelorcondiii.Cuctenergiadelegare areactanilorestemaimare,cuattcomplexeleAgAcsuntmaistabile. Interaciuneadintreepitopiparatopestedefinitde2parametri(afinitateaiaviditatea anticorpilor). Afinitateamsoarforadelegaredintreepitopiparatop.Afinitateaesterezultanta forelordeatracieiderespingerecaremediazinteraciuneacelordoireactani.Ointeraciunecu afinitatenaltpresupunestructuricomplementareperfecte,ntimpcecomplementaritatea imperfectagruprilorreactantedeterminoafinitatesczut,deoareceforeledeatraciesunt activenumaipedistanefoartemiciisuntdiminuatedeforelederespingere.Afinitateaanticorpilor sepoatemsuraprindializalaechilibru.

AviditateaesteunparametrualinteraciuniiAgAccarerezultdinmultivalenaAg.Cele maimulteAg.posedmaimultdectunepitop.Deexemplu,bacteriile,polizaharideleetc,aupe suprafaunnumrmaredeepitopirepetitivi.Ag.proteiceauepitopimultipli,dardiferii.Antigenele multivalenteleagunnumrechivalentdemoleculedeanticorpi.Energiatotaldelegarea epitopilormultipliaiunuiAg,cuparatopiispecificiestemultsuperioarncomparaiecuenergia separatafiecreiinteraciunidintreepitopiparatop.Aviditateacaracterizeazenergiamediede legareaunuiAgmultivalentcuAcspecificiimsoarforarezultantaafinitiidintreepitopii multipliaiunuiAgiparatopiicomplementari.ComplexeleAgAcformatedeantigenelemultivalente suntstabile,disocierealorfiinddificil,deoareceestenecesarrupereatuturorlegturilorexistente.

Reaciincruciate
nanumitecazuripotavealocreaciincruciateunAgreacioneazcuunAccareafost sintetizatfadeunaltAg(acestereaciipotapreadeex.datoritfaptuluicanumiteAgposed anumitegruprideterminantecomune).Spreexemplu,serulimunantipolizaharidcapsular deStreptococcuspneumoniaeaglutineazeritrociteleumanedegrupA(cuspecificitateantigenic conferitdeNacetilgalactozamin),iarserulimunantiEscherichiacoliaglutineazeritrocitele umanedegrupB(cuspecificitateantigenicconferitdegalactoz).Nuvomdetaliaaceste aspectenmaterialuldefa.

Stadiilereaciilorantigenanticorp
InteraciuneaprimarsedatoreazlegriiefectiveaAcdeAgidepindenmoddirect decantitateaiafinitateaAc.Dinpunctdevederediagnostic,reaciileAgAcncarereactaniise aflninteraciuneprimarpotfipusenevidenprinnefelometrie.ncazultipurilordereaciicare vorfidiscutatencapitoleleurmtoare,interaciuneaprimarnudevinevizibil(complexeleAgAc suntdedimensiunimici,solubileisepotdesprindeuor).Invivoacesteinteraciunisuntspre exemplunecesareisuficientenvedereaneutralizriiunorexotoxinecirculante(difteric,botulinic etc),pentruinhibareaactivitiiunorbacteriisauvirusuri,saundeclanareaunorreaciide hipersensibilitate(ex.nreaciadehipersensibilitatedetipI). Interaciunilesecundareaparlacirca30deminutedupinteraciunileprimare.Datorit faptuluicAgpoateaveamaimuliepitopiiarAcareminim2paratopicomplexeleprimaremici, solubile,interacioneazntreeleformndcomplexesecundare,produsulfinalfiinduncomplex AgAccaoreeatridimensional,insolubil,multmaistabildectcomplexeleprimare.Dinpunctde vederediagnostic,reaciileAgAcncarereactaniiseaflninteraciunesecundarpotfipusen evidenprintehnicicarevorfienumeratenfinalulacestuicapitolidiscutatencapitolele urmtoare.Invivo,manifestrileinteraciunilorsecundaresuntdependentedenaturareactanilori decondiiiledereacie. InteraciunileteriaredefinescmanifestrileinvivoalereaciilorAgAcidepindnspecial deanumitevariabilecaresuntcaracteristicegazdei.Interaciunileteriarepotconducelaunrezultat pozitiv(proteciagazdei)saunegativ(degradaretisular).

TipuridereaciiAgAc
nfunciedenaturaantigenului,metodeleaplicatepentruvizualizare,scopulurmritexistmai multetipuridereaciiAgAc,dupcumurmeaz: reaciideprecipitare potavealocngel(imunodifuziaradialsimplMancini,dubladifuzieOuchterlonyetc)

sau potavealocnmediulichid(reaciaRamon,precipitareaninelAscolietc) reaciideaglutinare sepotfolosindiagnosticulbacteriologic(ex.reaciaHuddleson)sau sepotfolosindiagnosticulserologic(ex.reaciaWright) reaciadefixareacomplementului(RFC) ndiagnosticulserologicalsifilisului,leptospirozeietc ndiagnosticulserologicalinfeciilorviraleetc reaciideseroneutralizare reaciaASLO(ndiagnosticulserologicalinfeciilorstreptococice) diferiteintradermoreaciicumecanismimunumoraletc reaciincarecomponentelesuntmarcate izotopic(radioimmunoassay,RIA) enzimatic(enyzmelinkedimmunoassay,ELISA) fluorescent(fluorescentimmunoassay,FIA) chemiluminiscent(chemiluminiscentassay,CLA).

16. Reacii antigen-anticorp: reacia de precipitare

ReaciaAgAcdeprecipitarepoateavealocnmediulichidsausolidiconstnunirea AgsolubilecuAcspecifici,rezultndcomplexeantigenanticorp,carenudevininsolubileistabile dectncazulformriiuneireeletridimensionale,conformteorieireeleicarepresupune:unAgcel puintrivalentpentruamplasareaAc,unAcbivalenticondiiifizicefavorabileprecipitrii(ex.Ac puinglicozilai,detipIgGcu3%glucide,superioriAcdetipIgMcu10%glucide). ReaciadeprecipitareestesensibilispecificnevideniereaprezeneiAg(pentrurealizarea reeleiAgAcestenecesarcanreaciesintreoanumitcantitatedeAgiAc,caresse gseascntrunanumitraport/proporie,iarAgcareparticiplaformareaagregatelorsuntntro cantitateproporionalmaimic,nraportcuAc).ncadrulcursuluisediscutdiferitelesituaiilegate deprezon(excesdeAc),excesrelativdeAc,zonadeechivalen(AgiAcsegsescn totalitatenprecipitat),excesrelativdeAgirespectivpostzon(excesdeAg).Pentruanumite sistemeAgAcvafidefinitinoiuneadeproporieoptim.

Clasificareareaciilordeprecipitare
Reaciiledeprecipitaresepotclasificadupcumurmeaz. Reaciideprecipitarenmediulichid Reaciideprecipitarenamestec,reaciidefloculare

titrareatoxineidifterice(metodaRamon),determinareatitruluiAcantitoxicietc VDRL(VeneralDiseaseResearchLaboratory),USR(UnheatedSerumReagin),RPR (RapidPlasmaReagin)etc,ndiagnosticulserologicalsifilisului Reaciideprecipitareninel reaciaAscoli,determinareagrupuluistreptococicetc Reaciideprecipitarentubcapilar determinareaprezeneiproteineiCreactive determinareaprezeneitipuluiMstreptococic(streptococidegrupA)etc Dozajulnefelometricetc Reaciideprecipitarenmediugelifiat Imunodifuziaradialsimpl(ex.metodaMancini) Difuziadubl metodaElek difuziadublradial(Ouchterlony) Reaciideprecipitarencaredifuziangelestecombinatcumigrareancmpelectric Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza Electroforezaurmatdeimunofixare Electroimunodifuzia.

Reaciideprecipitarenmediulichid
AulabazunireaAgcuAcnmediullichid,formndusecomplexeAgAc,carevorprecipita atuncicndAgiAcsegsescnanumiteproporii. Reaciideprecipitarenamestec ReaciadeprecipitarentreAgiAcsepoatecuantificaiestefoarteutilpentruademonstra prezenairespectivabsenaprecipitatuluinfunciedeconcentraiilerelativedeAgiAc.Spre exemplupentrutitrareatoxineidifterice(Ramon)sepunncontact,namestecntuburi, cantitiegaledincomponentacaretrebuietitrat(toxinadifteric,Ag)cucantitivariabiledeAcla caretitrulestecunoscut.Cantitateamaximdeprecipitatsegsetentubulundeexistraportul deechivalen.Pentrusistemultoxindiftericanticorpiantitoxindifteric(caincazul sistemuluitoxintetanicanticorpiantitoxintetanic),raportuldeechivalensesuprapune pesteproporiaoptim,astfelnctsepoateobservarelativuortubulncareaparecantitateacea maiimportantdeprecipitat.Cunoscndtitrulanticorpilor,seaflimediattitrultoxinei(1Lf= 1limesfloculans=cantitateadetoxincaresecombincuounitatedeantitoxin=1UA=1 unitateantitoxic).Dacspreexempluprecipitareamaximaparentubulncaretitrulanticorpilor estede10UA,titrultoxineiestede10Lf. nmodasemntor,prinmetodaDeaniWebsepoatedeterminatitrulanticorpilor antitoxici,cunoscndtitrultoxinei. Reaciideprecipitareninel Reaciadeprecipitareninel,constnpunereancontactaAgiAcastfelnctsnuse amestecereaciacareaparelainterfaadintreAgiAcseconcretizeazprintruninelde precipitarealbicios.Seutilizeazpentruidentificareaoriginiipetelordesnge(reaciaUhlenhut,n medicinalegal)ipentruidentificareaprovenieneiunorpreparatepebazdecarne(nindustria

alimentar). Demonstrativ,ncursullucrrilorpractice,reaciadeprecipitareninel(reaciaAscoli)sepoate utilizapentruidentificareaprezeneiantigenuluicrbunos(AgobinutdelaBacillusanthracis). Istoric,soluiadeantigensepreparaporninddelaorgane(deex.splin)recoltatedelaunanimal careadecedatipentrucaresesuspectacdecesulafostprodusdeoinfeciegeneralizat cuBacillusanthracis.Fragmentuldeorgansemojaransoluiedeclorurdesodiusteril, adugnduseulteriorctevapicturideacidacetic,apoisemeninealatemperaturadefierbere timpde510minute.DupdecantareaialcalinizareacuNaOH,urmafiltrareairezultasoluia antigenic.Dinpunctdevederetehnicvomutiliza3tuburi,1pentrureaciei2tuburimartor.n primultubmartorvompipeta0,5mlseranticrbunosi0,5mlsoluiesalinfiziologiciarnal doileatubmartorvompipeta0,5mlsernormaldecali0,5mlsoluiedeantigen.nceeace privetetubuldereacietrebuiespipetmnti0,5mldinserulanticrbunos,urmndcasoluiade antigen(ncantitatede0,5ml)sfiepipetatfoartelent,eventualprinscurgerepicturcu picturpepereteleinterioraltubului,naafelnctcele2soluiisnuseamestece.ncazul reacieipozitive(prezenaAgcrbunosnsoluiaantigenic),dupcirca5minute,lainterfaadintre cei2reactiviapareunineldeprecipitare.

Reaciideprecipitarenmediugelifiat
Utilizareagelozei,ncarepotsmigrezeceidoireactivi(sevautilizaoanumitconcentraiede agarnsoluiedetamponveronal,naafelnctporiigeluluispermitmigrarea),vaducela vizualizareareacieiAgAcprintrunarc/liniedeprecipitare. Imunodifuziaradialsimpl(IDRSMancini) Imunodifuziaradialsimpl(Mancini)sebazeazpedifuziaspontaniradialaAgdinproba decercetat,ntrungelcareconineocantitateconstantdeanticorpi,determinndapariiaunui cercdeprecipitarealcruidiametruestedirectproporionalcuconcentraiadeantigendinprob. Pentruaobineuncercdeprecipitaredemrimeconvenabil,concentraiaAcnglobaingel trebuiesfiealeasnfunciedetitrulacestoraideconcentraiaAgcareurmeazafitestat. Metodapermitedeterminareacantitativaimunoglobulinelor(IgG,IgM,IgA),fraciuniiC3a complementului,alfa1antitripsinei,siderofilineietc. Suntnecesareplcue(deex.cudiametrulde5cm)ncaresetoarnungelcareincludeAc fadestructuraacreiconcentraiedorimsodeterminm.Existuncodalculorilorispre exemplu,plcuelecarevorfiutilizatepentrudeterminareaconcentraieideIgGauculoareroie, pentruIgAculoareaestealbastr,pentrusiderofilinculoareaesteportocalieetc.ngelsunt perforatemicigodeuri(3mmdiametru).Suntnecesareseruridecercetatiunserdereferinn caresecunoateconcentraiadiferitelorcomponente(spreex.cte100UI/mlpentrufiecaredintre cele3imunoglobuline).naintedepipetareaserurilorngodeuriserealizeazdiluareaacestora, diluiafiindpentruIgG,IgAisiderofilinirespectivpentruIgM,complementC3i alfa1antitripsin.Diluiaseruluidereferinsefacenfunciedeproteinacareurmeazafi determinat.Cantitateadeserintrodusnfiecaregodeuestede5ml(ungodeupentruserulde referinirestulpentruseruriledecercetat). Dup10minutedemeninereaplcueipemasadelucruaceastaseincubeazla37C,cu stratuldegelpoziionatnsus,timpde48orepentruIgAiIgMirespectiv24deorepentru celelaltecomponente.Citireaserealizeazcuajutoruluneiriglegradate,dinplastic,origl

specialpentruaceastanaliz(demonstratncursullucrrilorpractice).Sevamsurainiial diametrulcerculuideprecipitaredinjurulgodeuluincareseaflseruldereferiniarrezultatul obinuttrebuiescorespundateptrilor(deex.6mmpentruIgGcareafostdiluatiastfelare concentraiade25UI/ml).ncazulcrezultatulestecelateptat,sepoatefacedirectcitirea diametrelorcercurilordeprecipitarepentruseruriledecercetatncazcontrarestenecesaro corecie(dacspreexempludiametruleste6,5mmnlocde6mm,dinvaloareaobinutpentru seruriledecercetatsescad0,5mm).Dupcitireadiametrelor,secomparrezultatelecucelepuse ladispoziientabeleiarcifraobinutsenmuletecudiluiaprobei(spreex.dacobinemo valoarede50UI/mlpentruIgG,vomnmulicu4pentruaobinerezultatulreal). Imunodifuziadublradial(Ouchterlony) ImunodifuziadublsebazeazpedifuziaAgiAc(unulsprecellalt)ntrungel.Deoarece mrimeamoleculelordeAgiAcestemaimicdectdiametrulporilorgeluluiiardistanaparcurs dereactantntrunanumittimpestedirectproporionalcugradientulconcentraieisaleiinvers proporionalcugreutateasamolecular,migrareareactanilorunulsprecellaltdeterminformarea unorliniideprecipitarelaloculdentlnireAgAc.ngelultransparentvoraprealiniiopace, numrullorcorespunzndnumruluisistemelorAgAcstudiate. Metodacertificprezenasauabsenaproteineicercetate.Sepotevideniaalfafetoproteina, proteinaCreactiv,beta2microglobulina,proteineBenceJonestipkappailambda,produide degragareaifibrinogenuluietc.nmicologie,prinimunodifuziesepoateidentificaprezena exoantigenelorfungice(Histoplasmacapsulatum,Blastomycesdermatidis,Coccidioides immitisetc)sauprezenaAcfadeAgfungice,spreexemplundiagnosticulserologicalunei aspergilozeinvazive.Aceastmetodestencfrecventutilizatpentrudeterminareaspecificitii anticorpilorantinuclearisauaaltoranticorpinpatologiauman. Suntnecesarelamedemicroscoppecaresetoarnungeldeagar1%,lamaputndfifolosit peparcursuluneizile(dacacestlucrunusepoatendeplini,lamatrebuiepstratncamer umed,latemperaturafrigiderului,pentrumaximosptmn).ngeluldepelamseperforeaz3 grupedegodeuri,cte7godeurinfiecaregrup(1godeucentrali6godeuriperiferice,fiecarecu diametrulde3mm).DacspreexempludorimsdeterminmprezenaproteineiCreactiv(CRP) nseruridecercetat,avemnevoiedeunsercuAcantiCRP,seruridecercetatiunserdereferin careconineCRP.Numerotndgodeurileperiferice,pipetmAcantiCRPngodeulcentraliserde referincuCRPngodeurile1i4.ncelelaltegodeuripipetmseruriledecercetat.Incubmla 37C,timpde24deore,ncamerumed(ntrocutiePetriputempuneobucatdevatmbibat nsoluiesalinfiziologic,alturidelamarespectiv).Liniiledeprecipitarepotdevenivizibiledup 24oredarsuntmultmaiclaredup24deore. Pentrucitirepoatefinecesarolupiosursdelumin.ntregodeulcentraligodeurile1i 4(martoripozitivi)voraprealinii(arcuri)deprecipitare.ncazulncaredeex.ngodeul2exist CRP,vaapreaunarcdeprecipitareintregodeulcentraligodeulnr.2.Estecertificatprezena CRPncazulncarecele2liniideprecipitare(dintregodeulcentraligodeurile1i2)suntunan continuareaceleilalte(imaginedegenunchindoit). DubladifuzieElek Aceastmetodpermitedepistareacapacitiitoxigeneauneitulpini deCorynebacteriumdiphteriae.ncazulncaretulpinaestetoxigen,toxinavadifuzanmediuiar dupunireacuAcantitoxin,complexeleAgAcvordanatereunorliniideprecipitare.

ntrocutiePetriturnmmediulElekidupcemediulsantrit,decupmunanpeunuldin diametre.nanulrespectivpipetm0,5mlserantidifteric,sercareconineAcantitoxindifteric nconcentraiede1.000UI/ml.Acantitoxindiftericvordifuzanmediu.Dupcirca2ore nsmnmperpendicularpeanulcuAcantitoxin,defiecareparteaanului,otulpin deCorynebacteriumdiphteriaetoxigen(martorpozitiv),otulpin deCorynebacteriumdiphteriaenetoxigen(martornegativ)itulpinidecercetat,cteunstriu(de fiecareparteaanului)pentrufiecaretulpin.Incubmla37Cpentru48ore,darurmrimzilnic apariiaculturiiiprecipitatului(liniilordeprecipitare).Dealungulliniilordensmnareapare culturbacterian.DinculturadeCorynebacteriumdiphteriaetoxigen,toxina(Ag)difuzeazn mediu.UnireadintreAgiAcducelaformareaunorcomplexeAgAccareprecipit,iarnmediuvor aprealiniideprecipitarenunghiuriledintreculturianulcuAcantitoxin.ncazulncareapar liniideprecipitarenunghiuldintreunadintretulpiniledecercetatianulcuAcantitoxin, respectivatulpinestetoxigen.Reaciavafinegativpentrumartorulnegativipentrutulpinilede cercetatnetoxigene.

Reaciideprecipitarencaredifuziangelestecombinat cumigrareancmpelectric
Electroforezaproteicngel Electroforezaproteicngelestefolositnlaboratoruldeimunochimiepentrudecelareaunor proteinepatologice.Deplasareaproteinelorntrunstratdegelcareestesupusaciuniiunuicmp electricsevarealizadifereniat,pentrufiecarestructurproteicnparte,nfunciedegreutatea molecularincrcturaelectricaproteinelor.Pentruvizualizareestenecesarfixarea,uscarea icolorarealiniilordeprecipitarecarecorespundfraciunilorproteicedinserulnormalsauunor eventualeproteinepatologice(ex.ocomponentmonoclonal). Imunoelectroforeza Seasociazelectroforezangelcuimunodifuziadubl(realiznduseseparareaprin electroforezaproteinelornmediugelozat,urmatdeoimunodifuziedublutilizndunantiser corespunztor).ReaciaAgAcsevavizualizaprinapariiaunorarcurideprecipitare.Esteometod foarteutilnstudiereapuritiiunuiAg(sauAc),nsnmodcurentareindicaiididactice.Datorit faptuluicnboalapneumococicprinurinseelimincantitidestuldeimportantedeAgK, prezenaacestuiapoatefievideniatdeex.prinimunoelectroforez. Contraimunoelectroforeza ContraimunoelectroforezareprezintodubldifuziencaredeplasareaunulfadecellaltaAg iAcesteacceleratdeuncmpelectric.Peolamdemicroscopsetoarnungeldeagar1%i seperforeaz3grupedeperechidegodeuri,fanfa.Metodapoatefiutilizatpentruacele structuriantigenicecarencmpelectricmigreazctreanod.Lundndiscuiespreexempludoar unadintrecele3grupedeperechidegodeuri,ngodeurilecarevorfipoziionatesprecatod(polul negativ)pipetmAgiarngodeurilecarevorfipoziionatespreanod(polulpozitiv)pipetmAc cunoscui,specificiAgpecaredorimslidentificm.Reaciaestemairapidimaisensibil dectdubladifuziedeoarecemigrareacelordoireactaniunulctrecellaltesteamplificatde cmpulelectric.Reacia(apariiauneiliniideprecipitarentregodeuri,ncazulncarengodeul catodicsegseteAgpresupus)poateficititdupnumai3090minutenlocde24deoreaa cumsentmplndubladifuzieOuchterlony.Metodaafostutilizatdinpunctdevedereistoric

pentruidentificareaprezeneiAgHBs.Sepoateutilizapentruidentificareaantigenelorcapsularen lichidulcefalorahidianlapacienicumeningitacut(Haemophilusinfluenzae,Neisseria meningitidis,Streptococcuspneumoniae). Electroimunodifuzia Electroimunodifuziaarelabazelectroforezaprobelorcareconinproteinaantigen,ntrunstrat degel,careconineocantitateconstantdeanticorpimonospecifici(antiproteinantigen), rezultndzonedeprecipitarenformderachetsauconuri,acrorarieestedirectproporional cuconcentraiaantigenului.MetodaareosensibilitatemaimaredectIDRS.

17. Reacii antigen-anticorp: reacia de aglutinare

nreaciadeaglutinareantigenelesuntdenaturcorpuscular.Reaciadeaglutinareconstn reaciaAccuAg(naturalsauartificial)depesuprafaaunorparticule(bacterii,hematii,latex, cristaledecolesteroletc),determinndaglutinareaacestoraprinscdereaforelorelectrostaticede repulsiedintreparticuleiformareaunorpunidelegtur. Aglutinareaestemaisensibildectprecipitarea,Agfiindoparticulinuomolecul solubil.AnticorpiidetipIgMsuntmaiaglutinanidectAcdetipIgG(pentrucaumaimulte valene).ExistiAcneaglutinani(incomplei/blocani)saucareaglutineaznumailarece.

Ctevatipurideaglutinare
Existmaimultevariantetehnicedeaglutinare.Dintreacesteavomprezentancontinuare,pe scurt,aglutinareadirect,aglutinareaindirect,inhibareaaglutinrii,aglutinareancoloani aglutinareamediatdeAcantiimunoglobuline.Ulteriorvomdiscutareaciiledeaglutinareutilizate nbacteriologieimicologie. Aglutinareadirect AglutinareadirectreprezintaglutinareaAgnaturalealeunorparticule(bacterii,celule)de ctreAcspecifici.Sepoateutilizandiagnosticulbacteriologic,deex.pentruidentificarea enterobacteriilor(Shigella,Salmonella,E.colietc)pebazastructuriiantigenice,ndiagnosticul serologicalunorboliinfecioase(febrtifoid,brucelozetc),pentrudeterminareagrupelor sanguine(ABO)etc. Aglutinareaindirectsaupasiv Esteoreaciencareparticuleartificiale(globuleroiiformolate,particuledelatex,cristalede colesterol,colodiuetc)saunaturalesuntncrcateinvitrocuAgsauAcisuntaglutinatede ctreAcsauAgcorespondentedinprobadecercetat.Seutilizeaznprincipalpentrudecelarea factoruluireumatoid,determinareaCRP,determinareagrupuluistreptococicetc. Inhibareaaglutinrii ReaciaconstninhibareaaglutinriiparticulelorncrcatecuAg,dupcenprealabilAc

reacioneazcuAgcorespondent.Seutilizeazdeex.pentrudecelareamioglobineisaun diagnosticulimunologicalsarcinii. Aglutinareancoloan Metodapermiteomaibunvizualizareareaciei.Dispozitivulutilizatare2compartimente, parteancareseintroducreactivii(situatsuperior)iocoloansituatinferior,plincu microparticuledesticl.Dupintroducereahematiiloriaseruluidecercetatiincubarea acestora,dispozitivulestecentrifugat.ncazuluneireaciipozitivecomplexulAgAcsevaputea vizualizalanivelulcoloanei,ntimpcencazuluneireaciinegative,hematiilesedepunnporiunea inferioaracoloanei. AglutinareamediatdeAcantiimunoglobuline AnticorpiiantiIgsevorcuplacuparticulencrcatecuAcivorducelaapariiaunor aglutinate(prinapariiacomplexuluiimun).Seutilizeazspreexemplundecelareafactorului reumatoid(tehnicaWaalerRose).

Utilizareareacieideaglutinarenmicrobiologie
Vomprezentaattexempledeutilizareareacieideaglutinarendiagnosticuldirectctin diagnosticulindirect(serologic).Reamintimfaptulcncadruldiagnosticuluidelaboratorserologic sevadeterminaprezena(sausevadovediabsena)Acnecunoscui,nserulpacientuluirespectiv, utilizndAgcunoscute.ndiagnosticulserologic,deregul,trebuiesputemrspundelaminim treintrebrieseniale:existanticorpinserulpacientuluiinvestigat?careestetitrulanticorpilor? cumevolueazndinamic(ntimp)acesttitru?nacestscopvomrealizaminimdoudeterminri diferitelaunintervalde710zile(pentrumajoritateainfeciilorcarepotfidiagnosticateastfel).n acestcapitolvomdiscutaattreaciiserologicecalitativectireaciiserologicecantitative.

Reaciideaglutinareutilizatendiagnosticuldelaborator microbiologicdirect
Tehnicadeaglutinareseexecutnapatraetapadiagnosticuluidelaborator,respectivn etapadeidentificare,pebazacaracerelorantigenice.nmomentulaplicriiacesteireaciiavemo seriededateporninddelainformaiileclinice,paraclinice,epidemiologice,saprelevatunanumit p.p.,caresaexaminatdinpunctdevederemicroscopiciafostcultivat.Aacumammenionat anterior,nvedereaidentificriiestenecesarsavemcoloniiizolate,culturpur.

1.Aglutinareapelam
Spreexemplu,ncursulidentificriiuneitulpinienterobacteriene(Shigella spp.,Salmonellaspp.,E.colietc),dupcultivareap.p.pemediiselectivodiferenialeseobin coloniiizolateidinporiuneasuperioar(bombat)acoloniilorizolatefacemtreceripemedii multitest(ex.TSI,MIU).nziuaurmtoare,avemdejamaimulteelementepentruncadrareatulpinii izolatentrospecie,dar,folosindspreexempluculturabacteriandezvoltatpemediulTSI,putem facereaciadeaglutinare.nniciuncaznusevorutilizapentruidentificareapebazdecaractere antigenicetulpinimaivechide1824ore. Pentrurealizareareacieideaglutinaresuntnecesareurmtoarele:culturadeidentificat(colonii detipS,de1824ore),soluiesalinfiziologic,AccunoscuifadeAgpecaredorimsle identificm(Acpolivaleni,Acmonovalenidegrup,Acmonovalenidetip,dupcaz),lamede microscopcurate,paharBerzeliuscuamestecdezinfectantetc. Iniial,peolamdemicroscopcuratidegresatpunemlaunadintreextremitilelameio

picturdesoluiesalinfiziologic,ncaresuspendmunfragmentdincoloniadeidentificatnaa felnctsobinemosuspensieomogen,opalescent.ncazulncaresuspensiarmne omogen,putemtrecelaetapeleurmtoarencazulncarepicturaselimpezeteiapargrunji, tulpinaestenetipabilprinaceastmetod(apareaglutinareanespecific),arputeafivorbadeo tulpincareprovinedintrocoloniedetipR.nurmtoareaetap,lacealaltextremitatealamei, punemopicturdesercuAccunoscui,deex.polivaleniirealizmosuspensieomogen, opalescent,acolonieideidentificat.nclinmlamadectevaori,uor,ntoatedireciile,pentrua favorizacontactuldintrecei2reactaniiunireacomplexelorAgAcmici,solubile,pentruaforma reeledecomplexeAgAc.ncazulreacieipozitive(corespondenntreAccunoscuiiAgpecare dorimslidentificm)picturaselimpezeteiapargrunjideaglutinare.Esteindicatscitim reaciapefondnegru.Decelemaimulteoricitireasefacecuochiullibernsncazulunor aglutinatededimensiunifoartemicipoatefinecesarsfolosimolup,unmicroscopsauun aglutinoscop.Pentruidentificareadiferitelormicroorganismeexistschemecareorienteazetapele deurmat(tabeleleischemelerespectiveselivreazdectreproductorimpreuncuserurilecu Acspecifici).Lamelepecaresefacreaciiledeaglutinare,dupterminareareaciilorseintroducn amesteculdezinfectant. ncadrullucrrilorpracticevorfidiscutateaglutinrilepentruidentificareaE.coli,Salmonella spp.pnlaniveldespecie(conformclasificriiKauffmannWhite)irespectivagrupurilor deShigellaspp.TotprinaglutinaredirectsemaipotidentificatulpinideVibrio cholerae,Haemophilusinfluenzaetipb,tulpinideBrucellaspp.,tulpinideE.colienteropatogen, iarncazulleptospireloriunorrickettsiiapariiaaglutinriitrebuieverificatcuajutorul microscopului. Reaciideaglutinareindirectsepotutilizapentrudetectareanp.p.astreptococilordegrupA sauB,pneumococilor,meningococilor,E.colitipcapsularK1,H.influenzaetipcapsularb,pentru detectareaunorenterotoxine(stafilococice,clostridieneetc),pentrudetectareaunorfungi (Cryptococcusneoformans,Candidaalbicans,Aspergillusspp.)sauaunorvirusuri.Totprintehnica deaglutinareindirectsepotidentificaexotoxinenfiltratuldecultur,streptocociidegrupAD,E. coliO:157,Legionellapneumophila,Listeriamonocytogenesetc.

2.Aglutinareantuburi
Tehnicadeaglutinarentuburisepoatefolosipentruconfirmareaunuirezultatpozitivla aglutinareapelamsauatuncicndrezultatuluneiaglutinripelamnuestesuficientdeclar. Vomavealadispoziieculturapurdeidentificatcaresevapreparadifereniatnfunciedetipulde Agpecaredorimslidentificm.Spreexemplu,dacncercmsidentificmAgdetipOiar bacteriaarputeasprezinteiAgHsauAgK(carearputeainhibaaglutinareacuAgO)culturase vamenine12orela100CpentruinactivareaAgdenveli,dupcaresevatrecelarealizarea aglutinriintuburi(oprocedurasemntoarepoatefinecesarincazultehniciideaglutinarepe lam).VomutilizaunirdeeprubetencarevomintroduceAccunoscui,caresevordilua succesiv,binar,cusoluiesalinfiziologic.ntuburilerespectivevomadugaocantitate echivalentdesuspensieAg(spreex.,la0,5mlAcvomaduga0,5mlsuspensieAg).Incubarea sevafacedifereniat,nfunciedetipuldeAgpecaredorimslidentificm(ex.20orela52C pentruidentificareaAgO). Reaciaestepozitivncazulapariieiaglutinatelor(grunjoasencazulprezeneiAgO, floconoasencazulprezeneiAgHetc).Reaciadeaglutinarentuburipermiteiverificaretitrului

lacarearelocformareacomplexelorAgAc.

Reaciideaglutinareutilizatendiagnosticulserologic
ndiagnosticulserologic,nmodobinuit,reaciileutilizatepermitdetectareaprezeneiAcn seruldecercetatdaristabilireatitrului.Totuiexistictevaexempledereaciideaglutinare calitative.

1.Aglutinareapelam
ReaciiledeaglutinarepelamHuddleson(ndiagnosticulbrucelozei)irespectiv KudicksSteuer(ndiagnosticultifosuluiexantematic)auintratnistoriamedicinei.Primadintre reaciioutilizmdemonstrativncadrullucrrilorpractice,apariiaaglutinatelorfiindclariartehnica delucrufoartesimpl.Suntnecesareurmtoarelemateriale:lamedemicroscopcurate,Ag brucelosinactivat(coloratnviolet),serdecercetat.Peolamdemicroscopdepunemopictur dinsoluiadeAgbrucelosinimediatavecintateaacesteia,opicturdeserdecercetat.Cu coluluneialtelameamestecmiomogenizmcei2reactani.Prinmicridenclinarealamein toatedireciilefacilitmformareacomplexelorAgAc,ncazulncarenseruldepacientsunt prezeniAcantiBrucellaspp.Reaciaestepozitivncazulncareseremarcprezena aglutinatelor.Chiarinperioadancareaceastseutilizandiagnostic,oreaciepozitivpelam trebuiasfieconfirmatprinaglutinarentuburi. Tehnicadeaglutinareindirectpoatefiutilizatndiagnosticulserologicalinfeciilorproduse deHelicobacterpylori,Treponemapallidum(hemaglutinarepasiv)etc.

2.Aglutinareantuburi
Tehnicadeaglutinarentuburisepoatefolosindiagnosticulserologicalbrucelozei(reacia Wright),diagnosticulserologicalinfeciilorprodusedeCryptococcusneoformans,diagnosticul serologicalfebreitifoideetc.DenumireadereacieWidalpentrudiagnosticulserologicalfebrei tifoideaintratnistoriamedicinei. Lundndiscuiediagnosticulserologicalfebrelorenterice,inclusivfebratifoid,suntnecesare urmtoarele:serurirecoltate(ndinamic)delapacieniilacaresesuspicioneazacestdiagnostic, tamponfosfatsalin,baiedeapcutemperaturreglabil,Agcunoscute(AgOiAgH).Sevalucra cu2rndurideeprubete,unrndpentrudetectareaprezeneiititruluiAcantiO,aldoileapentru detectareaprezeneiititruluiAcantiH(pentrupersoanelenconvalescensauncazul suspicionriistriidepurttorvomncercasidentificmnseruldecercetatAcititrulAcantiVi, deex.prinhemaglutinarepasiv). Seruldecercetat,pentrufiecarernddetuburi,vafidiluatcutamponfosfatsalin,ndiluii binare.Dacamesteculdeserdecercetatidiluantvafincantitatede0,5ml,vomadugao cantitatesimilardeAg,cte0,5mlAgOnprimulrnddetuburiirespectivcte0,5mlAgHn aldoilearnddetuburi.Vomprocedanaafelnctsobinemnprimultubodiluiede1/20,nal doileatub1/40etc.UntubvaconinedoarunamestecdetamponfosfatsalinisoluieAg(tub martor).Dupceomogenizmconinutultuburilor,vomincubatuburilecuAgOtimpde20orela 52CiartuburilecuAgHvorfiincubatetimpde2orela52Curmatde10minutelatemperatura camerei. Citireasevarealizadupincubare,comparndrezultatuldinfiecaretubcumartorulpentruAg. Pentruevideniereareacieivomagitauortuburile.AglutinareaHdiferdeaglutinareaO.

AglutinatulOestemaidens,maigrunjos,ntimpceaglutinatulHestemaifloconosiuorde disociatprinagitare.Ultimultubcaremaiprezintaglutinarevizibilpermitestabilireatitrului reaciei.ncapitolul31vomreluaacesttipdediagnosticivomdiscutamodalitiledeinterpretare.

18. Reacii antigen-anticorp: reacia de fixare a complementului

Sistemulcomplement Complementulreprezintunconstituentfoarteimportantalaprriinaturaleirespectivo componentnormalaserului.Sistemulcomplement(C)cuprindecirca30decomponente celularesauplasmatice.SistemulCsepoateactivapetreici,repectivcaleaclasic,calea lectinicicaleaaltern.Activareapecaleaclasicestedeclanatnprimulrnddeformarea complexelorimune(AgAc)darideapariiacelulelorapoptotice,anumitevirusurisaudeproteinaC reactivcuplatcuanumiiliganzi.Calealectinicpoatefiactivatdemicroorganismecareprezint nstructurgrupurimanozterminale.Caleaalternpoatefiactivatdebacterii,fungi,virusurisau deceluletumoraleetc. SistemulCprezintnumeroaseactivitibiologicefiindimplicatninflamaie(componentele C3a,C4a,C2b,C5a,complexulC5b7,C3e),naprareaantiinfecioas(opsonizare,facilitarea fagocitozei,lizamicroorganismuluiimplicat),nmetabolismulcomplexelorimune,clearanceul celulelorapoptoticesaunreglarearspunsuluiimun.Cutoatecnmodobinuitareunrol benefic,sistemulCpoateaveaiefecteduntoare. Reaciadefixareacomplementului(RFC) Facepartedintrereaciilealcrorrezultatnupoatefivizualizatfrunartificiutehnic,nacest cazutilizareaunuisistemhemoliticindicator.Motivulpentrucareestenecesaracestsistem indicatorsedatoreazfaptuluicAgestefiesubformmacromolecularfieestereprezentatde corpimicrobienidedimensiunifoartemici,iarcomplexulAgAcformatnudevinevizibilcuochiul liber.RFCafostimaginatncdinanul1901dectreJulesBordetisaperfecionatdestulde multdealungultimpului.Aceastreacieesteutilizatnpeste100desistemeAgAc,printehnici clasicesautehnicicareausuferitmodificri,inclusivintroducereamicrometodelorRFC. ReaciadefixareacomplementuluisepoatefolosiattpentruidentificareaAgctin diagnosticulserologic.Pentrucnuurmeazsdiscutmpelargprimavariant,vomenumera doarctevadintreexemple,RFCpermindidentificareaunorAgrickettsiene,chlamydiene,virale etc.ndiagnosticulserologic,ceamaicunoscutmetodrmnencRFCBordetWasserman, utilizatndiagnosticulserologicalsifilisului. SubliniemfaptulcRFCesteometodlaborioas,ncarenuseadmiteroritehnice,darfiind

executatcorectestefoarteexact,areomaresensibilitateispecificitate.Estedeasemenea unadintremetodelecuunmaregraddereproductibilitate. Principiu RFCsebazeazpeproprietateasistemuluiCdeasefixapecomplexulimunAgAc.nprima fazareacieiseintroduceseruldecercetatiardacacestserconineAcspecificifadeAg cunoscutsevaformauncomplexAgAc,urmatdefixareaC,caresevaactivapecaleaclasici nuvamaifidisponibilpentruasefixapesistemulhemoliticindicator(hematii+Acantihematie). ncazulncareseruldecercetatnuconineAcspecificifadeAgcunoscut,nuvaavealoc formareaunuicomplexAgAcnprimaetapaRFC.Dupintroducereanreacieasistemului hemoliticindicator,hematiileiAcantihematiesevorcupla,vorformauncompleximuniarCliber sevafixapeacesta.DupfixarevaurmaactivareaCirespectivlizahematiilor,hemolizaputndfi examinatcuochiulliber. Materialeireactivinecesari: seruldecercetatrecoltatdelapacientulsuspectsauoperechedeseruri,obinuten dinamic seruridereferin(martorpozitivinegativ) Agcunoscut(suspensiecorpuscularsausoluiecoloidal,dupcaz) sistemulCobinutdinserproasptsauconservatrecoltatdelacobai sistemulhemoliticindicatorformatdin hematiideberbec,soluie4%,valabiltimpdeosptmnla4C serhemoliticantihematiideberbec(obinutprininjectrirepetatedehematiideoaiela iepureledelaborator,splatecusoluiesalinfiziologic)titraticonservatla4C baiedeapcutemperaturreglabil plcicugodeuri,tuburidehemoliz,pipetediferiteetc. Tehnicadelucru: Aacumammenionat,tehnicadelucruestelaborioasinuvafiprezentatntotalitate,n celeceurmeaz. seruldecercetatsevamenine30minutela56C,nbaiadeap,pentru inactivareaCpropriu principial,RFCarelocn2etape nprimaetapsepunnreacieC,seruldecercetatiAgcunoscutexist2 posibiliti:a.nseruldecercetatexistAcspecifici,rezultnduncomplexAgAcpecareseva fixaCb.nseruldecercetatnuexistAcspecifici,nuseformeazcomplexAgAc,Crmne liber nadouaetapseintroducenreaciesistemulhemoliticindicator(hematii+Ac antihematie)exist2posibiliti:a.Cnuesteliber,nuarelochemoliza,b.Csefixeazpe sistemulhemolitic,lizeazhematiileiobservmapariiahemolizei toireactiviiutilizaitrebuiestandardizai,respectivsevorrealiza omogenizareasuspensieidehematiicueventualetalonareprinspectrofotometrie titrareaseruluihemolitic titrareaCnprezenaAg titrareabidimensionalaAgiaseruluidereferin nRFCfinalsevaprocedaastfel

sedilueazconformindicaiilordinprotocoluldelucrureactiviiutilizai(serulhemolitic, seruriledecercetat,Ag,seruriledereferin,C) serepartizeazngodeurilecorespunztoareseruriledecercetat,AgiC peoplacseparatsepreparmartorii(martorpentrusistemulhemolitic,martor pentruC,martorpentruAg,2martoripentruseruldereferin,martorsigurnegativ) plcileseintroducpnadouazila4C adouazi,plcilesemeninla37Ctimpde30minute seadaugntoategodeurilesistemhemolitic plcilesemeninla37Ctimpde30minute sepunplcilela4C,pnlasedimentareahematiilor existanumitediferenentretehnicilecantitativeicelecalitative,darprincipiilesunt aceleai nRFCBordetWasserman,metodcalitativ,reaciaserealizeazneprubete,2pentru reaciapropriuzis(unacuserdiluat1/8,celaltcuserdiluat1/16,2pentrumartorisigurpozitivi sigurnegativicteunapentrufiecaredinceilalimartori,respectivmartorpentruseruldecercetat, martorpentruAg,martorpentruC,martorpentruserulhemolitic) Interpretare: Iniialseverificrezultateleaprutepentrumartori(fiecestevorbadeometodcantitativsau calitativ)spreex.ncazulmetodeicalitative,ntubulmartorpentruseruldecercetattrebuiesfie hemoliz,lafelcaintuburilemartorpentruAg,Cisersigurnegativ.ntuburilemartorsigur pozitivimartorpentrusistemulhemolitic,nutrebuiesfiehemoliz. ntuburilecuseruldecercetat,dacaparehemoliza,nseamncnuexistAciartestul estenegativ(lichiduldintubvaaveaunaspectrou,limpede). Testulestepozitivatuncicndntuburilecuserdecercetatnuaparehemoliz,hematiilese depunformndunbutonnparteainferioaratubului(nseruldecercetatexistAc).Pentrua stabilidiagnosticulfinal,estenecesarcaRFCBWsfieconfirmatprinreaciispecifice(vezi capitolul45). Controldecalitate: Cuprivirelacontroluldecalitateammenionatutilizareamartorilor,pentrufiecarereacie. nRFCutilizatndiagnosticulserologic,Agcunoscutvafialesnfunciedesuspiciuneade diagnostic.RFCcantitativsepoateutilizapentrudiagnosticulserologicalinfeciilorproduse deMycoplasmapneumoniae,Chlamydiaspp.,Rickettsiaspp.,Treponemapallidum,Leptospira spp.,Borreliaspp.,Brucellaspp.,diferitevirusurietc. nscopulcreteriisensibilitiiispecificitiisealegproprietileAgcunoscut,oanumit temperaturdeincubare(deex.4Cnlocde37CnRFCKolmer)etc.AcfixatorideCapar precocencursulboliiastfelnctidentificareaprezeneilorpoatesemnificaoinfecieacutsau recent.

19. Reacii antigen-anticorp: reacia de

neutralizare (seroneutralizare)
LafelcaiRFC,nreaciadeseroneutralizare(RSN)estenecesarunartificiutehnicpentrua permitevizualizarearezultatelor.ncazulRSN,Agareoanumitproprietatebiologic(toxic, enzimatic)carepoatefiblocatprincuplareacuAcspecific.Neutralizareaefectuluibiologic respectivsepoaterealizadoarncazulncaredeterminantulpentrutoxicitatesaupentruactivitatea enzimaticrespectivesteacelaicudeterminantulantigenic(epitop). Reaciiledeseroneutralizarearputeafiutilizatenmaimultemprejurri,spreexemplun: diagnosticulmicrobiologicdirect identificareaClostridiumperfringensprinmetodaplcilorsemineutralizate(vezicap.44) testareatoxigenezeiuneitulpinideCorynebacteriumdiphteriae(testdeseroprotecie, vezicap.11) toxinotipiancazulsuspicionriiuneitoxiinfeciialimentarecuClostridium botulinum(vezicap.11i45) diagnosticulserologic reaciaASLO(veziicap.25) prevenireaunorboliinfecioaseprevenibileprinvaccinareievaluareaeficacitiivaccinale vaccinareacuanatoxine(DTP,DT,ATPA,ADPAveziicap.22) titrareaprezeneiAcantitoxine(difteric,tetanicetc) testareaprinIDR(intradermoreacie)asusceptibilitiifadeoanumitboal infecioascarearelabazdreptmecanismpatogenicefectuluneiexotoxine tratamentul/profilaxiaunorboliinfecioaseprinutilizareadeimunoglobulinespecificeomologe sauutilizareaunorserurihiperimuneheterologe.

ReaciaASLO
Aceastreaciepoatefiutilizatndiagnosticulretrospectivaluneiinfeciistreptococicesau pentruconfirmareaetiologieiuneibolipoststreptococice(mpreuncucriteriileminoreimajorede diagnostic).ReaciaASLOdetermintitrulAcantistreptolizinO(SLO). Principiu: TitrareaAcantiSLOsebazeazpefaptulcSLOareefecthemoliticasuprahematiilorde iepuresaudeberbec.ncazulncarenseruldecercetatexistAcantiSLO,aciuneahemolitica SLOesteneutralizat.CombinnddiluiidinseruldecercetatcuocantitateconstantdeSLOvom puteadeterminatitrulASLO. Materialeireactivinecesari: serdecercetat(sauseruripereche,recoltatelaintervalde2sptmni) SLOliofilizat(standardizatdectreproductor) sngedefibrinatdeiepure/berbec soluiesalinizoton,soluiederivanol0,3% eprubete,pipetegradatefoartecurate baiedeap,centrifugetc Tehnicadelucru: Trebuieurmatetoateindicaiiledinprotocoluldelucru,respectiv

seomogenizeazsuspensiadehematii sendeprteazinhitoriiSLOdinseruldecercetat(utilizmsoluiederivanolisuspensiede crbuneactiv,realizmodiluiede1/10aseruluicaresevamenine30minutela56C) serealizeazdiluiiledeseriserepartizeazntuburiledereacie(serndiluiisuccesive) mpreuncuSLO(ncantitateconstant,cte0,5ml/tub)combinareaseruluidecercetatcuSLO reprezintprimaetapareaciei seagittuburilepentruomogenizareisemenintimpde15minutela37C urmeazadouaetapareacieiASLO,respectivadugareasuspensiedehematii(5%),cte 0,5mlnfiecaretub seagitpentruomogenizareiseincubeaztimpde45minutela37C secentrifugheaztuburiletimpde1minut(1.500rotaii/minut)isemeninpnadouazila 4C(temperaturafrigiderului). Interpretare: Porninddelaodiluieiniialaseruluide1/10,dupadugareatuturorreactivilortitrul(numrul deunitiASLO)vafi12,50ntubulurmtor,100,125,166,250,333etcntuburileurmtoare. TitrulreacieiASLOestedatdeceamaimarediluiedeserlacarelipsetecomplethemoliza. Pentruzonanoastrgeograficseacceptcanormaluntitrude200(maxim250)unitiASLO. Existtesteserologiceipentruevideniereaprezeneiititruluianticorpilorfadealtestructuri antigenice(deexemplustreptodornaz,hialuronidaz,streptokinaz). Controldecalitate: Ultimele2tuburisuntreprezentatedetubulmartorpentruhematii,ncareseverificrezistena hematiilorirespectivtubulmartorpentruSLOncaresepunSLOisuspensiadehematii. ExistiposibilitateadearealizaomicrometodASLO,reaciaefectundusenplcide materialplasticcugodeuri. UtilizareaRSNnprofilaxiaitratamentulunorboliinfecioase Vaccinareanscopulobineriiuneiproteciiprinseroneutralizare VaccinulDTPincludeosuspensiedegermeni(Bordetellapertussis)nfazaI,combinatcu anatoxinadiftericitetanic.Primovaccinareasencepevrstade2lunianounscutului, administrnduse3dozelaintervalde2luni(la2,4,6luni).Pentrumeninereaimunitiisepractic revaccinareaIla6lunidelaprimovaccinareiarrevaccinareaaIIasepracticla36delunidevia acopiluluirespectiv.Datoritposibilelorreaciiadverse(fadecomponentapertussis)se recomandeliminareaacesteialanounscuiicuproblemealesistemuluinervos,laceipredispui laboalilaceicareauavutoreacieadverssemnificativlaoadministrareanterioaraDTPului. Sestudiazposibilitateautilizriipescarlargaunuivaccinacelularncaresfieinclustoxina pertussisinactivat. Evaluareaeficacitiivaccinurilor Serecomandtestareastriideimunitateindusprinvaccinare,conformnormativelorelaborate deautoritiledesntatepublicmetodeleaulabaztitrareaAcantitoxin(difteric,tetanic etc)nseruriprelevatedelacopiivaccinai,prindiferitetehnici.Spreexempluseconsidercun copilesteprotejat(prezintrezistenspecificncazuluneiinfeciidifterice)dactitrulAcanti toxindiftericestemaimarede0,03UAI/ml Sepotfacetestedesusceptibilitate,invivo,pentruaverificadacpersoanainvestigateste saunuprotejatfadeoeventualinfecie.nacestscopsepracticIDR.nistoriamedicineiau

intratIDRDick,carepermitetestareasusceptibilitiifadescarlatin(toxinaesteelaboratde ctrestreptococuldegrupAlizogenizat)irespectivIDRSchick,carepermitetestarea susceptibilitiifadedifterie(toxinaesteelaboratdectrebaciluldiftericlizogenizat). ambeleIDRserealizeazsimilardinpunctdevederetehnic spreex.ncazulIDRSchickseinjecteazntreimeamedieaantebraului,strict intradermicocantitatede0,1mltoxindiftericdiluatcorespunztor.ncazulncarensngele persoaneitestatesegseteocantitatedeAcantitoxinmaimarede0,03UAI/ml,toxina inoculatvafineutralizatinuvaapreaniciomodificarelaloculinoculrii(lipsaeritemului semnificfaptulcpersoanatestatnuestesusceptibilsfacdifterie,ncazulncarese infecteazcuunbacildifterictoxigen).ncazulncarepersoanarespectivnuprezintAc antitoxindifteric,Aginoculatvaconducelaapariiaunuieritemlaloculdeinoculare UAI=unitateantitoxicinternaional Terapiasauprofilaxiaspecific(imunoterapiepasiv) Administrareadeimunoglobulinespecificeomologe,obinutedelapersoaneimunizate(natural sauartificial)fadeoanumitmaladieinfecioas,deex.nimunoterapiainfecieicuClostridium tetani(tetanos)sepotadministraintramuscular36.000UAI Administrareadeseruriimuneheterologe,obinuteprinhiperimunizareacailor,ntratamentul tetanosului,difteriei,botulismuluietc. Terapiabolilorncaremecanismulpatogenicimplicexotoxinetrebuieinstituitctmairapid, deoareceexotoxinelepotfineutralizatenumaiatuncicndsegsescncirculaie.

20. Reacii antigen-anticorp: reacii n care componentele sunt marcate

Reamintimc,nfunciedenaturaantigenului,metodeleaplicatepentruvizualizare,scopul urmritexistmaimultetipuridereaciiAgAc,ianume: 1.reaciideprecipitare 2.reaciideaglutinare 3.reaciadefixareacomplementului(RFC) 4.reaciideseroneutralizare. Dacncazulprimelor2tipuridereaciivizualizareasepoatefacedirect(cuochiulliber,cu ajutoruluneilupeetc)ncazulRFCiRSNestenecesarutilizareaunorsistemeindicator.n continuarevomdiscutadesprereaciileAgAcncarepentruinterpretareestenecesarmarcarea reactanilor,ceeacesepoateface: izotopic(radioimmunoassay,RIA) enzimatic(enyzmelinkedimmunoassay,ELISA) fluorescent(fluorescentimmunoassay,FIA) chemiluminiscent(chemiluminiscentassay,CLA)etc.

Radioimunoanaliza(RIA)
Posibilitateautilizriiizotopilorradioactivinmedicinaconduslamultedescopeririimportante ndomeniu.IntroducereaRIA,pentrudeterminareacantitativaprezeneiunuimarenumrde substaneprezentencantitifoartemicinlichidelebiologice,aconstituitunrealsucces.RIAa fostincmaiesteutilizatnmultedintrespecialitilemedicale. PentrumarcareaAgsepotutiliza3H,125I,14Cetc.Seintroducnreacieocantitatecunoscut deAgmarcatradioactiv,AgnemarcatpecaredorimsldozmiAccunoscuicuspecificitate fadeAg.SevarealizaocompetiiepentrucuplareacuAcntreAgmarcatiAgnemarcat radioactiv.Duprespectareatimpilordinprotocoluldelucrusemsoarradioactivitateacomplexului AgAciaplicndformuledecalculcorespunztoaresepoateaflacantitateadeAgnemarcat. RIAesteotehnicobiectiv,cufoartemaresensibilitate,permitecuantificareaunorcantiti foartemicideAgsaudehaptenedar,datoritproblemelorlegislative,costuluiaparaturiii reactivilor,riscurilorimplicate,estenlocuitdincencemaimultcutehnicidetipELISA.

Analizaimunoenzimatic(ELISA,EIA)
Marcareaenzimaticafostintroduspentruprimaoarnhistochimie,n1966,dup5ani devenindunmarkerincazulreaciilorAgAc.PrezenacomplexelorAgAcvaputeafivizualizat icuantificatdeoareceunuldintrereactiviesteconjugatcuoenzim,iardupadugareanmediul dereacieaunuisubstratcromogenspecificenzimeimarker,densitateaopticamediuluide reaciesevamodificaiarvaloareadensitiiopticesepoatenregistra. Reaciileimunoenzimaticepotavealornsistemomogensauheterogen(activitateamarkerului enzimaticnuesteinfluenatdectrereaciaAgAc).ncontinuarenuvomdiscutadectdespreal doileatipdereacii,caresuntmaifrecventutilizatenmicrobiologie. TehnicileELISApotfiutilizateattpentruidentificareaAgctipentruidentificareai/sau titrareaAc.ngeneral,reaciileimunoenzimaticeserealizeaznurmtoareasuccesiune: primulreactiv(AgsauAc,nfunciedeceeadorimsdeterminm)estefixatpeun suportsolid(foartefrecventreprezentatdegodeurileunorplcideplastic,darpotfiibile,tuburi etc)deregulaceastfixareserealizeazdectrecompaniileproductoare adugmaldoileareactiv,celnecunoscut(AcsauAg) ncazulncareexistcomplementaritatestructuralielectrochimicntreceidoi reactivi,areloccuplareaiformareacomplexuluiAgAcpentrueliminareareactivilorcarenuau intratncomplexarelocoprimsplare reactivuladugatnurmtoareaetapvariaznfunciedetipuldetehnicELISA(n finalulacestuisubcapitolvomprezentapentruexemplificareunadintrevarianteletehnice)deex.se poateadugaunreactivcaresepoatecuplacuAc,iaracestreactivestelarndulluicuplatcu enzima(conjugatenzimatic)ncontinuareareloconousplare pentruvizualizareareaciei,adugmunsubstratcromogenpecareenzimapoate acionaiconducelaapariiauneiculoricaresepoatevedeaicuochiulliber,darsecitetecu ajutoruluiunuispectrofotometru valorilenregistratepentruprobsecomparcuvalorilenregistratepentrumartorul pozitivimartorulnegativ,seaplicformulaindicatdectreproductor,iarinterpretareaseface aacumesteindicatnprotocolultehniccarensoetetrusaELISA.

Enzimeleutilizatemaifrecventsuntfosfatazaalcaliniperoxidaza.ncazulprimeienzime, substratulcromogenvafipnitrofenilfosfatuliarncazulperoxidazei,substratulcromogenvafi ofenilendiaminansoluiedeapoxigenat. PrintehniciledetipELISAseobineospecificitatebunsaufoartebuniarsensibilitateaeste comparabilcuceaobinutncazulRIA.Tehnicaesteobiectiv,adevenitautomatizat,iarprin extindereaoferteiicretereanumruluicelorcareoutilizeazpreurilesuntcompetitive. Existmaimultemodalitideclasificarepentruacestetehnici,spreexemplu: nfunciedescopulurmrit,sepoatedeterminaprezenaAgndiferiteproduse patologicesauprezenaAcnser,LCR,alteumori nfunciedetipuliordineareactivilorintroduinreacietehnicilepotfinecompetitive saudecompetiie(directesauindirecte) nfunciedecomplexitateatehnicii,putemdiscutadesprevarianteleclasice(aacuma fostdescrismaisusirespectivaacumurmeazsfieprezentatnexemplulconcret)i respectivdesprevariantelesimple/rapide. nanumitesituaii,rezultateleobinuteprinELISAtrebuieconfirmateprinmetodemaispecifice. ncontinuarevomprezentasuccintetapeleELISAncazuldeterminriiprezeneideAc antimycobacterieninser.Nuexistncostandardizareadiagnosticuluiserologicntuberculoz (vezicap.42)daraacumurmeazsdiscutm,pentruapunediagnosticuluneiinfeciicuM. tuberculosis,toatedatelecarepotfiobinutesuntimportanteitrebuieanalizatencontext. Principiu: AnticorpiiprezeninseruldeanalizatseleagspecificdeAgimobilizatepemicroplci KohINorHardmuth.Complexulimunformat,reacioneazprinfragmentulFcalimunoglobulinelor (nspecialIgG)cuconjugatulProteinAstafilococicperoxidazadinhrean(SpAHRPO)care estepusnevidenacuortofenilendiaminHC1(OPD).Reaciaestecuantificatfotometric. Materialeireactivinecesari: Plcisensibilizate(IC) Tampon1(TFSTCH)esteformatdintamponfosfatsalinpH7.2,0.15M,Tween200.05% caseinHammersten0.5%imertiolatdesodiu0,1%.Sepstreazla+4oC.esteutilizatpentru rehidratareidiluri. Tampon2(TFST)de10oriconcentratareaceeaicompoziiecaTamponul1cu excepiacaseineiHammersten.esteutilizatpentrusplri. Tamponcitrat(3)pH5.0,pentrudizolvareaOPD Ortofenilendiamin(pastilede9mg,cntritedeproductor) Serdecercetat Sermartorpozitiv(M+) Sermartornegativ(M) SoluieconcentratdeconjugatSpAHRPO Perhidrol(30%H2O2) Tehnicadelucru ngodeurileplciisensibilizate(InstitutulCantacuzino)seintroduc100mlTampon1i seincubeaz60minutela37oC. Placasegoletedeconinut(automatsauprinrsturnareiscuturarepeunstratde hrtiedefiltru).

Probeledeserdeanalizatiserurilemartor(M+iM)sedilueaz1/25nTampon1 (25mlser+0.6mlTampon1).Serurileserepartizeazcte100mln3godeuriparalele, notndusencaietuldelucrupoziiaserurilor. Incubmplacala37otimpde60min,natmosferaumed. Placasespalde3oricuTampon2ide2oricuapdistilat,pentrunlturarea spumei.Pentruaceastoperaie,ntisedilueazTamponul2concentratprinamestecareaunui volumTampon2cu9volumeapdistilat. ConjugatulSpAHRPOsedilueaz1/500nTampon1(30mlconjugat+15mlTampon 1)iserepartizeazcte100ml/godeu Seincubeaz60minla37oncamerumed. Senlturdingodeuriconjugatulisespalcamaisusde3oricuTampon2ide2 oricuapdistilat. SepreparsoluiadeOPDprinadugareaa15mlTampon3si8mlperhidrol, repartizndusecte100ml/godeu. Seincubeazlatemperaturacamerei,feritdelumindirect,pnanmomentulapariiei ngodeulcorespunztorseruluiM+auneiculorigalbeneintenseiarcorespunztorseruluiMlipsa apariieiculorii.Aceastaserealizeazncirca1030min. Analizasefacecuajutorulunuifotometru(l=450nm)frblocarecuacid. Interpretare: RezultateleseexprimnUnitiImunoEnzimatice(UIE)duparelaia:(ODXODM/ ODM+ODM)100 *ncareODXreprezintdensitateaopticaprobeideanalizat,ODMestedensitateaoptic aseruluimartornegativiarODM+densitateaopticaseruluimartorpozitiv. Valoriledepnla10UIEsuntconsideratenesemnificative,deipotindicaunnceput desintezdeanticorpi,repetareadeterminriidup12luni,putndindicaocretereatitrului. Indiferentdevaloareaobinutrezultatelesevorinterpretancontextulclinic, epidemiologiciparaclinic,inndcontderezultateleexamenuluimicrobiologicdirect.

Imunofluorescena(FIA,IF)
Imunofluorescenapoatefiutilizatattndiagnosticulmicrobiologicdirect(pep.p.recoltatde labolnavsaupeculturapur)ctindiagnosticulserologic.Unuldintrereactivi(Ag,AcsauAc antiAc)estemarcatfluorescent.PosibilitateacuplriistabileaAccufluorocromi,fralterarea specificitiiAc,afostevideniatncdinanul1942. Fluorocromiisuntcompuiorganicicare,dupiradierecuradiaiiultravioleteabsorbradiaia excitant,intrnstaredeexcitaieiaratuncicndrevinnstareanormalpierdenergiaacumulat emindradiaiiluminoase(veziicap.8).DintrefluorocromiamputeaamintiauraminaO, rhodaminaB,acridinoranjRsautripaflavina.Luminavizibilemisdepindedefluorocromulutilizat (spreexempluculoareaestegalbenpentruauraminaO,galbenportocaliepentrucombinaiade auraminOrhodaminBetc). TehnicileIFpotfidetipdirectsaudetipindirect. ncazulIFdirect,Agestenecunoscutisepoateaflantrocultur,etalatpefrotiucaatare sauparazitndanumitecelule(ex.sepoateutilizaoprobrecoltatprinbiopsie).Produsulcare

urmeazafianalizatesteincubatnprezenaAcmarcaifluorescent,cunoscui.Spreex.ncazul frotiuluicoloratfluorescent,duprealizareafrotiuluiacoperimlamacuserulcareconineAc marcaifluorescent,incubmtimpde30minutela37C,splmcutamponfosfatsaliniapoicu apdistilat(pentrundeprtareaAccarenuauintratncomplexulAgAc),ateptmsseusuce iexaminmcumicroscopulcufluorescen.PutemidentificaastfelAgaparinnd speciilorLegionellapneumophila,Bordetellapertussis,Mycobacteriumtuberculosis,Chlamydia trachomatis,Treponemapallidum,Cryptococcusneoformans,Histoplasma capsulatum,Pneumocystiscariniietc.Metodaesterapidiaplicabilpentrufrotiuridinp.p.sau dinculturdarinanatomiapatologicsaunhistochimie.PentrufiecareAgdecercetattrebuie preparatserulcareconineAcspecifici,marcaifluorescent. IFindirectpresupunerealizareaunuifrotiuporninddelaAgcunoscut.Frotiulseacopercu serdecercetatidupoincubaiede30minutela37Csplmcutamponfosfatsalinicuap distilatpentrundeprtareareactivilorcarenuauintratnreaciaAgAc.Pefrotiusepuneunsercu AcantiIgdeom,marcaifluorescentiseincubeaztimpde30minutela37C,sespal,se ateaptuscareafrotiului,urmndexaminarealamicroscopulcufluorescen.nsituaiancaren seruldecercetatexistAcspecificiAgcunoscut,arelocformareacomplexuluiAgAciarnetapa urmtoare,AcantiIgdeomsecupleazpecomplexinmodindirect,prinfluorescen, identificm(inunelevariantetehniceputemtitra)Ac.Metodapoatefiutilizatndiagnosticul serologicalinfeciilorprodusedeLegionellapneumophila,Mycoplasmapneumoniae,Leptospira spp.,Borreliaburgdorferi,Treponemapallidum,Helicobacterpylori,Toxoplasma gondii,Pneumocystiscariniietc.

21. Testarea imunitii de tip cellular

Existoseriedemetodeutilepentruevaluarearspunsuluiimundetipcelular(RIC).Evaluarea RICestenecesarattnsituaiaunorpacienilacaresesuspicioneazprezenauneistride imunodeficien,ctinanumitebolitransmisibilecaresepotnsoidemodificrifiziopatologicea RIC.Datoritfaptuluicnmomentuldefaaufostpuselapunctvarianteterapeuticecarepot influenanmodfavorabilrspunsuluiimun,estenecesarsavemladispoziiemodalitide identificareadeficienelorimune. nvedereastabiliriiunuiastfeldediagnostic,celmaifrecventpornimdelaosuspiciunecare poateficliniciarasociereauneiinfeciicuagenietiologiciconsideraioportunitipoates reprezintesemnalulpentrudeclanareadiferitelorinvestigaii.Spreexemplu,infeciile cuPneumocystiscariniisauCryptococcusneoformanspottrdaoafectarealimfocitelorT, infeciilerepetate,purulentecuStaphylococcusaureus,Pseudomonascepacia,Serratia marcescens,Aspergillusspp.arputeafidatorateunorsuferinealecelulelorfagocitareetc. Avndnvedereceledemaisus,investigareapacientuluilacaresesuspicioneazo imunodeficienartrebuisfierealizatprinurmtoareleactiviti:

Aplicareaanamnezeipeparcursulcreiaartrebuisaflmdateprivindmedicaiaprimit derespectivulpacient,momentuldebutuluisuferineirespective,antecedenteleheredocolaterale, dateprivindvaccinrileefectuate(veziicapitolul22),dateprivindageniietiologiciizolaii identificaiulterioretc.Adeseorianamnezaareoimportancrucial. Examenulclinic,porninddelacunoatereanlimiiigreutiipacientuluiinvestigat comparndcuvalorileconsideratenormalepentruvrstarespectiv,prezenaunorsemneclinice sugestive(lanivelulfeei,dentiieiievoluieiacesteia,lanivelultegumentuluiianexeloracestuia, lanivelulscheletului,organelorinternecarepotfiexaminateclinicetc) Examenedelaborator(numrulelementelorfigurate:hematii,granulocite,trombocite formulaleucocitar,aspectulpefrotiulrealizatdinsngeleperiferic,VSHetc) studiulmaiaprofundatlimfocitelorisubpopulaiilorlimfocitareCD3+,CD4+,CD8+etc (numr,procent)prinmetodeclasiceimoderne(ex.flowcitometrie) studiulfuncieisubpopulaiilorlimfocitare(prinmetodeclasiceimoderne) determinareanumruluideceluleformatoaredeanticorpifadeantigene timodependente(plajehemolitice) studiulfuncieicelulelorfagocitare(aderare,inhibiiaaderrii,inhibiiamigrrii macrofagelorsauleucocitelor,deficienelanivelulgranulaiilor,deficienenmieloperoxidaz, deficienenNADPHoxidaz,eliberarearadicalilordeoxigenactividectrecelulelorfagocitare nestimulatei/saustimulatecuzimosan,lectineetc) evaluareaactivitiicitotoxiceacelulelorNKiK(citotoxicitateanaturalmediat celular,citotoxicitateamediatcelularanticorpdependent/ADCC,citotoxicitateaspecificfade celuletumoralesaunormale/prineliberarede51Cr,induceredelimfociteTCitotoxiceinvitroprin culturistimulatecuantigenetumoraleiIL2etc) studiiprivindreactivitateacelulelorimplicatenrspunsulimundetipcelularapreciat prinincorporareadetimidintritiatdectrelimfocitelestimulatecudiverimitogeni,lectinecare seleagdemembranacelular(fitohemaglutinin,concavalinAetc),substanecareacioneaz directfranecesitaexistenaunorcomponentemembranare,diferiteantigene(PPD,candidin etc),citokine(IL2),celuleallogeniceetc studiulsecreieidecitokine,modalitateindirectdeapreciereafuncieicelulelor implicatenrspunsulimundetipcelularetc Testeimunobiologice,printehnicaintradermoreaciei(IDR),folosindantigenecare stimuleazrspunsulimundetipcelular(ntrziat)nliteraturainternaionalesterecomandato bateriedeantigene,patrucincidintreantigenelemenionatencontinuare Candidin(antigenextrasdinCandidaalbicans,unextractaposrealizatndiluie1/10 antigenulestenumitiDermatophytonO) Coccioidin(antigenextrasdinCoccidioidesimmitis)carenspoateinterferacutestele serologicerealizatepentruhistoplasmoz Histoplasmin(antigenextrasdinHistoplasmacapsulatum)careproduceiocreterea titruluianticorpilorfixatoridecomplement Antigenulextrasdinvirusulurlian Fitohemaglutinin(mairarfolositinvivo) LizatdinculturdeStaphylococcusaureus Ocombinaientrestreptokinazistreptodornaz

Toxoidtetanic,cuconcentraiade10limesfloculans/ml(diluat) Toxoiddifteric,cuconcentraiade30limesfloculans/ml(nediluat)pentruultimele2 antigenepotapreareaciidehipersensibilitatedetipumoralceeacepoatecreaprobleme importantenceeacepriveteevaluarearspunsuluiimundetipcelular Tricofitin(extrasdinTrichophytonspp.) Tuberculin(derivatproteicpurificat,PPD,extrasdinculturadeMycobacterium tuberculosis). nceleceurmeazvomdiscutadespreIDRcuPPD. Principiulmetodei Tuberculinareprezintunamestecrelativbinestandardizatdeantigeneproteice mycobacteriene,utilizatnmodcurentpentrudecelareainfecieituberculoase(TB),individualsau populaional.AcestextractsepoateutilizancadruluneibateriidetesteIDRpentruevaluarea reactivitiidinpunctdevederealrspunsuluiimundetipcelular(RIC).Dupceopersoandatse infecteazcumycobacterii,urmeazsensibilizareaiproliferareaanumitorpopulaiidelimfociteT (LT).InjectareaintradermicatuberculineistimuleazLTideclaneazoseriedeevenimentece conduclaunapariiaunuiRICiaunormanifestridehipersensibilitatedetipIV.Reaciileimplic vasodilataie,edemiinfiltratculimfocite,bazofile,monocite,neutrofile.LTantigenspecifice prolifereazielibereazlimfokinecaremediazacumularealocaladiferiteloraltecelule. Rspunsulmaximseconstituielacirca48oredupinjectare.Ariainduraiei(infiltratuluicelular) reflecthipersensibilitateadetipntrziat.Eritemulreprezintoreacieinflamatorieacut,cauzat devasodilataiacapilariarapariiaeritemuluinuvafiinterpretatdreptoreaciepozitiv.Limfocitele sensibilizateatingunniveladecvatpentruaconducelaapariiaunuirspunsinterpretabildup24 sptmnidelainfeciainiialcuM.tuberculosis.Sensibilitateapoatepersistamaimuliani,dar reactivitateascadederegulodatcuvrsta. Materialeireactivinecesari PorninddelatuberculinapreparatdeKoch(Oldtuberculin,1891),n1901afostrealizat produsulNewtuberculin,iarulteriorderivatulproteicpurificat(PPDS,preparatdeSeibertn anul1941),adoptatcaStandardInternaionalpentruPPD.Metodadeobinereafostreprezentat deprecipitareaproteinelordinfiltratulmediuluideculturconcentratlacald,cusoluie50%sulfat deamoniu.UnitateainternaionalpentruPPDestedefinitdreptactivitateabiologicconinutn 0,000028mgdePPDS(0,00002mgPPD+0,000008mgsruri).PPDRT23reprezintlotulde tuberculinpurificatnanul1958nDanemarcaiasiguromogenitateaprodusuluiantigenicfolosit instudiiepidemiologicenlumeantreag.Dinprodusulrealizatiniialseprepardiluiilenecesare (etalonate)lacareseadaugTween80nscopulreduceriiabsorbieipepereteledesticlalfiolei. nmoduzualseutilizeaz2UI/doz,echivalentula5UIPPDS.nraportcuPPDRT23,n RomniaseutilizeazPPDIC65produsdectreINCDMICantacuzino. Tehnicadelucru naranoastrseutilizeaztehnicainjectriiintradermice(Mantoux). controlmprodusulbiologicpecareurmeazslutilizmdinpunctdevedereal perioadeideeficacitate,conservriincondiiileprevzutedectreproductor utilizmnumaiseringicuvolumuldemaxim1mlicudiviziuniclarmarcate,celpuin pentrufiecare1/10mlprecumiacepentruinjecieintradermic,deunicntrebuinare agitmenergicfiolapentruaomogenizaconcentraiaprodusuluibiologic,tiutfiindc,n

timpuluneiconservrimaindelungate,tuberculinatindesseabsoarbpepereiidesticlaifiolei aspirmnseringocantitatesuficientdesoluiepentruaputeaeliminaintegralorice buldeaeraprutntrepistoniorificiulacului poziionmaculastfelnctbizoulsfiealiniatdiviziunilorseringii antiseptizmcualcool(minim3minute)oariesituatpefaaanterioaraantebraului stng,launireatreimiimediicuceasuperioar cuprindemzonarespectivaantebrauluinpalm,ntinzndpieleactmaiuniformntre extremitateainferioaraeminenteitenareihipotenarepedeoparteicelepatrudegetestrns lipite,pedealtparte ptrundemcuaculaproapetangentlasuprafaaantebraului,cubizoulnsus,pn acestaestesituatnderm elibermtegumentulifixmseringapresndopeantebraulsubiectului,avndgrijs nuseacoperediviziunileseringiipentruaputeaurmriicantitateainjectat injectmstrict0,10mldacinjectareasafcutstrictintradermicapareobuluor denivelat,cumarginirelativabrupte,cuaspectdecoajdeportocalidiametrude58mmn lipsaapariieiacesteibule(ncazulinjectriihipodermicesaucndsepierdesoluientreseringi aculincorectmontat),esterecomandatssereiamanevracumaimultatenie,repetnd injectarealaodistande35cmsaulaantebraulopus. Lapersoaneleinfectateanterior(sensibilizate),laloculinjectriiapareoreacieconstnddin eritemedeminduraiencepnddupcirca6oreiatingndunnivelmaximdupcirca3660ore, careseretragenurmtoarectevazile.Peloculreacieipoatepersistaoperioadndelungato zondehiperpigmentaie. Citirearezultatului Citirearezultatuluisefacedereguldup72ore,asigurndobuniluminareazonei examinate(estedepreferatluminanatural).Recomandmoprimcitirela24ore(pentrua surprindeoeventualhipersensibilitatedetipumoralfadeantigenulinoculatcarearestructur proteic),oadouacitirela48oreicitireafinalla72deore. Identificmexistenauneieventualeariiintenseritematoviolacee,carecircumscriezonancare amfcutinocularea.ncazulexisteneiuneiastfeldereacii,apreciemtactil(prinmicrirepetate, atingndzonarespectiv)cupulpapoliceluisauinelaruluilimitelezoneideinfiltraiedermic (perceputcafiindreliefat)corespunznddinpunctdevederehistopatologicinflamaiei(edem, limfocite,macrofage,PMN)icarereprezintreacianespecificispecificfadeantigenul injectat. Msurmdiametrulmaximalzoneideinfiltraie.Notmisemicantitativintensitateainfiltraiei dermice("tipPalmer"),semnificaiafiindurmtoarea: tipI,induraiefermsauprezenauneiflictene tipII,induraieelastic tipIII,infiltraiedepresibil tipIV,frinfiltraieaparent. Citireareacieituberculinicereprezintoevaluaresubiectiv,existndposibilitateaunor importantevariaiiinteriintraindividualedinparteapersoanelorcareefectueazlectura.Dubla citire"norb"frcunoaterearezultatuluiceleilaltelecturi,poatereducevariaiilegrosiere,cu condiiacaambelepersoanecarecitescrezultatulsaibexperiencuaceasttehnic.

Interpretarearezultatuluitestuluituberculinic(IDRcuPPD). nfunciedeanalizelestatisticeefectuate,existctevarecomandricuprivirelainterpretarea IDRcuPPD. CentruldecontroliprevenireabolilorAtlantaGeorgia(CDC)amodificatrelativrecent clasificareareactivitiilatestulcutanatefectuatcu5UIPPDdupcumurmeaz: 1.Reaciaesteconsideratafipozitivdacdiametrulinduraieieste>5mmnurmtoarele cazuri: persoanecareauavutuncontactrecentcuuncazdeTB persoanecusemneradiologicedeTB persoaneinfectatecuHIV. 2.Reaciaesteconsideratafipozitivdacdiametrulinduraieieste10mmncazul persoanelorcarenuintrincategoriilemenionatemaisusdaraualifactoriderisc,spreexemplu: persoanenscutenrincareprevalenaTBestecrescut(dinAsia,Africa,America Latinetc) persoanecarefolosescdroguriinoculatepecaleinjectabil persoanefradpostsaucarelocuiescnazilesauninstituiicorecionale persoanecareprezintafeciunicarecrescrisculapariieiTB(silicoz,diabetzaharat, bolihematologiceialesistemuluireticuloendotelial,malnutriie)sausunttratatecumedicamente imunosupresive. 3.Reaciaesteconsideratafipozitivdacdiametrulinduraieieste15mmncazulaltor situaiidectcelemenionatemaisus NB.PersoaneleinfectatecualtetipuridemycobacteriipotprezentareaciipozitivedupIDRcu PPD,nsdereguldiametrulinduraiei<10mm,excepiile(diametru>10mm)putndaparen specialladebutulinfeciei. naranoastrseconsiderdreptpozitivereaciileatuncicnddiametruleste9mm.Aceast definiieconvenionalsebazeazperezultateleunortestriefectuatepeeantioanesemnificative statistic,lacareanalizaepidemiologicadistribuieivaloriloraartatcplasarealimiteintre valorilede910mmseparcelmaibinecele2categorii(neinfectaiiinfectai)asigurndcelmai sczutprocentderezultatefalspozitiveirespectivfalsnegative.Clasificareaindivizilordintro populaiennegativiipozitivilatestultuberculinicservetelamsurareaextinderiiinfecieiTBn aceapopulaie(prevalenainfeciei)oferindunplusdeinformaieprinanalizaseparatpegrupede vrst.Dacserepetdeterminareaprevaleneiinfecieipevrstelaintervaledefinitedetimp, dinamicaprevaleneiinfecieinfiecarecohortpermitedeterminarearisculuianualdeinfecie, indicatorfiabilalevoluieiendemieituberculoase. nceeacepriveteinvestigareareactivitiidinpunctuldevederealRICpentruunanumit subiect,lacaresautilizatobateriedeantigene,dacspreexemplurezultatulestenegativ pentrufiecaredintrecele45antigenefolositesepoatepresupunefaptulcsubiectulrespectiveste anergicnceeacepriveteRICiserecomandefectuareaunorinvestigaiisuplimentare.

23. Introducere n diagnosticul de laborator

microbiologic
nprimaparteamanualuluidelucrripracticeamprezentatdateleprivindbazelediagnosticului nmicrobiologie,studiulmicrobiologicdirectirespectivevaluarearspunsuluigazdeifade infecie.Avndlabazacestecunotine,ncapitoleleurmtoarevomdiscutapernddiagnosticul delaboratoralinfeciilorprodusedeprincipalelemicroorganismestudiate. Pentrufiecaredintrecapitolele2452vomutilizaschemadediagnosticprezentatncapitolul 5,schempestructuracreiaamdiscutatdealtfelidiferiteleaspectedinparteageneral. Utilizareanmodrepetatauneischemeclarepermiteomaibunfixareacunotinelorprecumi atingereaobiectivuluistabilit:reinereaunorprincipiidectrestudeniindiferentdespecialitateacare vafialeasulteriorsaudectremedici.Microbiologiaeste,dupprereanoastr,otiincufoarte mareaplicabilitatepractic.Elementeledebazalemicrobiologieisuntnecesareiutilepentrutoi ceiimplicainsistemulsanitarcunoatereaacestorelementedebazarputeaprevenioseriede anomaliiieroricareuneorisuntdezastruoase(aacumsantmplatdeex.ntromaternitaten careoseriedenounscuiaudecedatdatoritunorinfeciidespital). Dacnurmcucirca30deanilanivelinternaionalanceputsseconsidere(nmoderonat) cproblemelelegatedebolileinfecioasesuntdincencemaipuinimportante,eroarecareacreat icreazncmariproblemensntateapubliclanivelinternaional,nultimii56ani(nspecial ncepndcuanul1998)sanelescbolilortransmisibiletrebuieslisereacordeimportana cuvenit.Astfel,inclusivlaniveleuropean,aufostelaboratenumeroaseactenormativenacest domeniuiarfondurilealocateausporitsubstanial,ncercndsseameliorezesituaiacreat datoriteroriloranterioare. inaranoastr,preocupareafadesntateapublicngeneralifademicrobiologian sntateapublicnmodparticularacrescutdupanul1997.Activitateadesfuratndomeniul reformelorpentrusntateapublicnRomniaeste,dinacestpunctdevedere,destuldeaproape dereformacarearelocrestulEuropei.Diferiteleproiecteiprogrameiniiatenspecialnperioada 19972000igsesciastziconcretizareanaplicareaunormsuricumareimportanlanivel naional:reabilitareacentrelordereferinpentrumicrobiologie,reformasistemuluidesupraveghere atuberculozei,adaptarealastandardeinternaionaleasistemuluidediagnostic,prevenireicontrol pentrubolilecutransmiteresexual,meninerealaunnivelcorespunztoraimunizrilorpentrua prevenibolileprevenibileprinvaccinare,includereaRomnieinsistemuldepregtirenscopul supravegheriibolilortransmisibilelaniveleuropeanetc. Dinanul1999Romniafaceparte(camembrufondator)dinReeauadesupraveghereabolilor transmisibilenBalcani.nanul2000,afostorganizatunadintrecelemaiimportantentlniricu scopularmonizriisupravegheriibolilorinfecioasenEuropa(ConsensusMeetingonSurveillanceof InfectiousDiseases,Grottaferrata,Italia,7aprile2000).Prezentareapecareunuldintreautorii prezentuluivolumafcutocuacestprilej,discuiilecareauurmatnatelieredelucru,ntlnirilecu factoridedecizieaiOrganizaieiMondialeaSntii,iniiativaorganizriiuneireelede supraveghereabolilortransmisibilenriledinEuropaCentralideEst(ntlnireplenarpecare amorganizatondecembrie2000,laBucureti)auduslaconstruireaunuiproiectdereformn domeniulsupravegheriibolilortransmisibilecusprijineuropean(PHARE)careafostaprobatde

asemeneananul2000iestencursdedesfurare. Chiardacreprezintomsurpentruprevenireaunormaladiivirale(inubacterienesau fungice)vommaiamintidintremsuriluatenultimiianimbuntireaprogramuluidevaccinare mpotrivainfeciilorcuvirusulhepatiteiB,nanul1999.Vaccinareanounscuiloraveadejao vechimede4ani,darn1999prinpoliticadusndomeniulsntiipubliceafostinclusi vaccinareacopiilordinclasaaIIIa,vaccinareatuturorelevilordinanulIdelacolilesanitare postlicealeirespectivastudenilordinanulIdinfacultiledemedicinistomatologie.Aceast politicvaducecannumaicivaani,unmarenumrdegeneraiidecopiisfievaccinatefade oinfeciecaredeveniseendemiclanivelulanilor90. Fiecaredinaspectelemenionateareostrnslegturattcumicrobiologiacticu sntateapublicimeritaficunoscutedectremediciiiviitoriimedicidinsistemulsanitar romnesc. nbolileinfecioase(transmisibile)diagnosticulareoimportanconsiderabil,deoarecede stabilireacorectiprecoceadiagnosticuluidepindattvindecareabolnavului,ctisuccesul msurilorpreventivecaretrebuieiniiatectmairapidposibil.Spreexemplu,ignorareaprimuluicaz aluneiboliinfecioasegrave(ex.holer)poateaveaconsecineepidemiologicefoarteimportante. Cutoatecnprimiidestudiuesteabordatnmodspecialparteamicrobiologic(bacteriologic, virusologic,parazitologic,micologic)adiagnosticului,estestrictnecesarsmenionmc examenulclinicipstreaziastziodeosebitvaloare.nscopuldiagnosticriibolilor infecioaseaufostpuselapunctnumeroasetehnicidelaborator,metodeparaclinice,precisei obiective,darutilitatealorestemaximatuncicndrezultatelesuntinterpretatencontextulclinic iepidemiologic. ndiagnosticulbolilortransmisibiletrebuierespectateoseriedereguli,dupcumurmeaz. 1.Obinereadatelor(clinice,paracliniceidelaborator)esteurgent.Anamnezatrebuie realizatcurigurozitate.Apreciereastatusuluiimunologicpoatefiesenial.Niciunelementobinut prinexamenulobiectivnutrebuieneglijat. 2.Dateleobinutetrebuieprivitecauntotunitarnupotfiabsolutizateniciposibilitileclinicei nicicelealelaboratorului. 3.Esteindispensabilssestabileascundiagnosticetiologicntoatemaladiileinfecioase, avndnvedereimportanatratamentuluiantimicrobian 4.Folosireacorectalaboratoruluiconstituieoaltregulimportant.Estenecesarcafiecare medicclinicianstieceanalizscear,ceproduseserecolteazdelabolnav,cndicums lerecolteze,cumsleexpediezectrelaborator.Pentruobinereaunordatecorecteprin exameneledelaborator,clinicianulvarespectactevareguli:produseleserecolteaznaintede administrareatratamentuluiantimicrobiansetrimitelaboratoruluiocantitatesuficientdeprodus pentruexaminatprodusulpatologictrimistrebuiesfiereprezentativpentruboalarespectiv(de exemplu,sputinusalivninfeciilerespiratoriiinferioare)produsulexaminatnutrebuie contaminatcualigermenincursulrecoltriisaualtransportului(recoltareaseptic)expedierea ctrelaboratorsefacencondiiiledeconservarecerutepentrufiecaretipdeproduspatologicn partesesolicitexaminareaimediataproduselortransmisectrelaborator. 5.Trebuiesexisteocolaborarestrnsicontinuntreclinicianispecialistulde laborator.Estenecesaroinformareclinicaomuluidelaboratordectreclinicianpentru orientareastudiilornlaboratoripentrualegereacelormaibunemetodedeidentificareaagentului

etiologic.nacelaitimp,laboratorultrebuiesinformezeclinicianulpeparcursnlegturcudatele obinute. ncadrulexamenelordelaborator,unlocprioritaresteocupatdediagnosticulmicrobiologic (bacteriologic,micologici/sauimunologic),carevafiprezentatncontinuare(veziicapitolul 5).Foartepescurtvomdiscutactevadatereferitoarelaalteexameneparaclinice,utilen diagnosticulbolilorinfecioase. Diagnosticulcitologicconstnpunereanevidenaunoraspectecelularecaracteristice, utilizndunprodusprelevatdelabolnav.Spreexemplu,citodiagnosticulrevrsatelorpleuraleial LCRpoateaducedatepreioasepentruelucidareaetiologieiuneipleureziiirespectivaunei meningite.Diagnosticulhistologicimplicbiopsii(recoltateprintehnicchirurgical)sau punciibiopsiialediferitelororgane(ficat,rinichi,plmn,ganglionilimfatici,fragmentevasculare, mucoasdigestivsaurespiratorie)carepermitpunereanevidenaunormodificristructurale caracteristice,determinatedeaciuneaagentuluimicrobian.Dintremetodeledelaborator nespecificesuntutilendiagnosticulbolilorinfecioasehemograma,leucograma(cumodificri caracteristicenuneleboli),vitezadesedimentareahematiilor,testelededisproteinemie,diferite testeenzimatice,determinareaprezeneiproteineiCreactiv(betaglobulincareaparensern afeciuniinflamatorii,neoplaziiinprocesenecrotice),altetestedeinflamaie(reactanidefaz acut)etc. Referitorlaaltemetodeparaclinicevomamintiexamenulradiologiccarepoatefurnizadatede valoarepentrubolileinfecioasecuparticiparepulmonar(pneumoniivirale,febrQ,tuseconvulsiv, pneumoniepneumococicetc).ndiagnosticulbolilorinfecioasesemaipotfolosi rectosigmoidoscopia,electroencefalografia,electrocardiografia,diferitedeterminribiochimice, exameneoftalmologice,scintigrafia,ecografia,tomografiacomputerizat,tehnicaderezonan magneticnuclear. Diagnosticuldelaboratormicrobiologic(ex.bacteriologic) Diagnosticuldelaboratornmicrobiologiepoatefiundiagnosticbacteriologic(direct),un diagnosticimunologic(indirect)sauocombinaieacelordouvariantemenionate.Schema generaladiagnosticuluidelaboratormicrobiologicafostdiscutatncapitolul5ivafiaplicat concretncapitolelecareurmeaz.Pentrufiecaremicroorganism/diagnosticnparte,dinlistap.p. posibildeutilizat,vomalegepentruprezentarecteunulsingur,consideratreprezentativ. Principalelemicroorganismepentrucaresevastudiadiagnosticulmicrobiologic Bacteriilestudiatepotfigrupatedupmaimultecriterii,darovariantutilesteceancare avemnvederestructurapereteluibacterianirespectivafinitateaacestuiafadediferiicolorani. Unprimgrupimportantestecelcareincludecociicuimportanmedical,grampozitivi (stafilococi,streptococi,pneumococietc)irespectivgramnegativi(meningocociigonococietc). Dintrebacteriilegramnegativecareaudimensiunipebazacroranupotfincadratedreptcoci saubaciliseaflparvobacteriile,cocobaciliigramnegativi(Haemophilusinfluenzae,Bordetella pertussis,Brucellaspp.etc). Baciliigrampozitivicarevorfidiscutaisepotgrupanbacilinesporulai(Corynebacterium diphteriae,Listeriaspp.etc)irespectivbaciligrampozitivisporulai(Bacillusanthracis,Clostridium spp.etc). Baciliigramnegativistudiaiaparinfiefamilieienterobacteriilor(E.coli,Salmonellaspp., Shigellaspp.,Klebsiellapneumoniae,Proteusspp.,Yersiniaspp.etc)fiesuntincluingenuri

separateprecumVibriocholeraedingenulVibriosauPseudomonasaeruginosadin genulPseudomonas. MicroorganismeledingenulMycobacteriumsepotcolora(cudificultate)prinmetodaGram,dar nmodcaracteristicsecoloreazprinmetodaZiehlNeelsen.Speciaprincipalstudiateste reprezentatdeM.tuberculosis. Oseriedebacteriispiralate(ex.Treponemapallidum,Leptospiraspp.,Borreliaspp.)nuse coloreazprinmetodaGramdatoritstructuriiparticulareaperetelui.Potfistudiatemicroscopicfie npreparateproaspete(utilizndtehnicimicroscopicespeciale)fieutilizndcoloraiiparticulare(ex. impregnareaargentic). Pnnurmcuoperioaddetimpmicroorganismeleaparinnd genurilorRickettsia,ChlamydiaiMycoplasmaerauinclusencategoriavirusurilor.Totui proprietilelorfundamentalefacslestudiemastzintrebacterii. nobiectuldestudiusuntncadraiifungii(ciupercile)careauoseriedecaracteristiciaparte. Noiunilelegatedediagnosticulmicologicsuntprezentatemaipelargntratateledespecialitate.

24. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Staphylococcus

Stafilocociisuntcocigrampozitiviaerobi,facultativanaerobi,imobili,nesporulai, catalazopozitivi.GenulStaphylococcuscuprindemaimultegrupedemicroorganismedeinteres medical(uneledintreacestegrupuriincluzndmaimultespecii).Celemaicunoscutespeciisunt reprezentatede:StaphylococcusaureusS.epidermidisS.saprophyticus.S.aureusreprezint speciacelmaifrecventimplicatnclinic,ntimpcealtespeciisuntnepatogenesaucondiionat patogene.nfunciedecapacitateadeaelaboracoagulaz,toistafilocociicoagulazopozitivisunt grupaicaS.aureus. Stafilocociipotdevenipatogeniisepotmanifestacaatarefieprinmultiplicareiinvazivitate, fieprinmultiplicareitoxinogenez(fiindposibilicombinareaacestormecanisme).Determinanii patogenitiilastafilococincludproduseletoxiceienzimatice.S.aureusesteimplicatcaagent etiologicntromarevarietatedeinfeciisupurative(cupuroi),ncepndcuinfeciilesuperficialeale tegumentelorimucoaseloricontinundcupanariii,furuncule,abceseprofunde,infeciiale diferitelororganeinternecusaufrgeneralizareainfeciei.Pedealtparte,arfidemenionat toxinozele(datoratenspecialtoxinelorelaborate)ianumetoxiinfeciilealimentare,necroliza toxicaepidermului,sindromuldeoctoxicetc.Toxiinfeciilealimentaresuntprovocatede exotoxinelepreformate,existentenalimentencaresaumultiplicatstafilococienterotoxigeni. Stafilocociicoagulazonegativi(SCN)suntimplicaininfeciiaprutedupmanevre medicochirurgicalecarepenetreazbarieracutaneomucoas(cateterisme,implante,protezri intravasculareetc).ArmaifideamintitinfeciiletractuluiurinarigenitalcuS.saprophyticus(la

femeiletinere).OinfeciegravprodusdeSCNesteenterocolitapostantibioticeanounscutului (maialesaprematurului,lacareadministrareanecontrolataantibioticelorpoateproduce disbacteriemiicuconsecinegrave).Pentruadiscutadiagnosticuldelaboratorninfeciileproduse destafilococivomalegedreptreprezentativeinfeciilepurulentealetegumentelori mucoaselorinevomreferinumailaStaphylococcusaureus. Diagnosticuldelaboratorestenumaibacteriologic,direct,cuurmtoareleetape. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).nfunciedemaladiaprovocatsepotrecoltaurmtoareleproduse patologice:secreiipurulente(dinfoliculite,abcese,celulite,fistule,infeciialeplgiloriarsurilor), lichide(depunciesinusal,otic,mastoidian,articular,peritoneal,pleural,pericardic), exsudatnazalsauexsudatfaringian,snge,LCR,sput,urin,secreievaginal,tampoane vaginale,lichiddevom,materiifecale,alimente,prelevatedepesuprafaacatetereloriainseriilor iv.aleacestora.ncontinuarevomdiscutacazulncarep.p.estereprezentatdepuroi(vezii capitolul6). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelordelaniveltegumentar(eventualmodificatefadenormal),prezenacelulelor inflamatorii(ex.leucocite,piocite)iprezenacocilorgrampozitivi,cudiametrulde0,51,5m, dispuinlanuriscurte,perechi,izolaisaungrmezineregulate.Cociisepotsituaintrasau extraleucocitar.Searenvedereloculdeundeafostrecoltatp.p.(puroiulpoatefinecontaminat, dacserecolteazdeex.prinpuncieaspiraredintrocoleciepurulentprofundiestefoarte probabilcontaminatcuflordeasociaiedacafostrecoltatdintroleziunesuperficial). 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Stafilocociisedezvoltngeneralpemediideculturobinuiten1824ore,la3537C. ColoniileauaspectdetipS,diametrulcuprinsntre13mmisuntpigmentatenfunciedespecia izolat(ex.pigmentauriu).Pemediulgelozsnge,njurulcoloniilorpoateapreaozonde hemolizclar.Stafilocociisepotmultiplicapemediihiperclorurate,tolerndoconcentraiede 710%NaCl(ex.mediulChapman). 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocigrampozitivi,cudiametruldecirca0,51,5m, dispuinlanuriscurte,perechi,izolaisaungrmezineregulate Caracteredecultur:ProduccoloniidetipS,pigmentateauriupemediilecusngepot producehemoliz. Caracterebiochimice:Stafilocociiauunmetabolismglucidicattrespiratorcti fermentativ.Fermenteazglucoza,manitolul,xiloza,lactoza,zaharozaetc.cuproduceredeacid. CapacitateadeacidifiereamediuluiconinndmanitesteutilizatcatestdediferenierentreS. aureus(manitopozitiv)iSCN(manitonegativ).Stafilocociiauriisuntcatalazopozitivi(vezi 12.5.B).Sepoatefaceitestulfosfatazei.Existsistememultitestcaresepotprocuracomercial

(API,MicroScan,Miniteketc). Caractereantigenice:SepotutilizatestecomercialecareincludfibrinogeniIgGcare cupleazcoagulazalegatiproteinaA(tehnicideaglutinareindirect). Caracteredepatogenitate:Trebuieefectuattestulcoagulazei(vezicapitolul12,punctul 12.7)pentruidentificareaexotoxinelorsepoateutilizaotehnicdetipELISAsauaglutinarea pasivinversat(veziicapitolul11). Sensibilitatealabacteriofagi:Susceptibilitatealaaciunealiticabacteriofagilorafost sistematizatpentrutulpiniledeS.aureusntrunsistemcaresepoateutilizalanivelulcentrelorde referin. Altecaractere/testeutilizatenidentificare:Sepotutiliza(ncentredereferin)teste caresebazeazpeproprietifenotipicemoleculare(studiulacizilorgraicelulari,alunorenzime saualunorpolipeptidetotale)saugenotipice(fragmentederestriciealematerialuluigenetic, hibridareamolecular,ribotipia).Saudezvoltattehnicirapideutilizndtrusedeidentificarei instrumenteautomatizatepentruevideniereaunorelementealepereteluicelular(proteinaA, coagulazalegat),aenzimelorelaboratenalimentsaulichiduldehemocultur(testulpentru termonucleaz)iatoxinelor(enterotoxine,TSST1,exfoliatine).Existmetodecareutilizeaz markerimolecularipentruevideniereaprezeneiMRSA(stafilococrezistentlameticilin)ipentru difereniereaintraspecificlaS.aureusiSCN. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)esteobligatorieiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.ncazulunor infeciigravetrebuiesfiensoitdealtedeterminri(vezicapitolul14).

25. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Streptococcus

Streptocociisuntcocisfericigrampozitivicareformeazperechisaulanurincursuldiviziunii celulare.Suntlargrspndiinnatur.Uniifacpartedinfloraumannormalaliisuntasociaicu afeciuniumaneimportantedatorateparialinfecieistreptocociceiparialrspunsuluiimunal gazdei.Nusaelaboratunsistemperfectpentruclasificareatuturorstreptococilor.Dintrespeciile cuimportanmedicalarfideamintitS.pyogenes(grupA),S.agalactiae(grupB),S. viridans(careaparinefloreinormale),S.pneumoniae(pneumococul)etc.Enterocociiaparineau grupuluiD,nsnmomentulactualfacpartedintrungenseparat,genulEnterococcus. Streptocociisuntimobili,nesporulaiipotaveasaunucapsul.nacestcapitolvomdiscuta diagnosticuldelaboratoralinfeciilorprodusedeStreptococcuspyogenes. CeimaimulidintrestreptocociicareconinantigenuldegrupAsuntstreptococipiogeni. Streptocociipiogenisuntbetahemolitici(producnmodcaracteristiczonelargidehemolizclarn jurulunorcoloniidedimensiunimici).Deregulstreptocociipiogenisuntsensibililabacitracin.

Streptocociisuntpotenialimplicaintromarevarietatedeboli.nprincipalstreptocociipiogeni potdevenipatogenidatoritmultiplicriiicapacitiideinvazivitate.Proprietilebiologiceale microorganismelorinfectante,naturarspunsuluigazdeiipoartadeintrareainfecieiauomare influenasupratablouluiclinic.Infeciilestreptococicearputeafigrupateastfel: Boliinvazive,ncareputemincludefaringita,anginastreptococic,erizipelul,diferite infeciinsferaORL,pneumonia,impetigostreptococic,celulita,fasceitanecrozant,febra puerperal,endocarditainfecioas,sepsisulstreptococicetc. Boliprodusedestreptococilizogenizai,ncareputemincludescarlatinaisindromulde octoxicstreptococic. Bolilepoststreptococicecareincludreumatismularticularacut(RAA)iglomerulonefrita acutpoststreptococic(GNA).Diferiiautoriiaunconsiderareialteentiticlinice. Pentruadiscutadiagnosticuldelaboratorninfeciileprodusedestreptocociipiogenivom alegefaringitastreptococic.nvedereaconfirmriiuneibolipoststreptococicevomdiscuta reaciaASLO(veziicapitolul19). Diagnosticuldelaboratorbacteriologic,direct,nfaringitastreptococic. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologic,secreiapurulentdelanivelulfaringelui, trebuiesserealizezerespectndoseriedereguli(ctmaiaproapededebutulbolii,nainteca pacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapidicorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate, respectndtoatenormeledeasepsieiantisepsie,recoltareasefacepreferabildimineaanainte capacientulsmnnceifrssefisplatpedini,frsfiutilizatgargarismecudiferite soluii,iardacacestecondiiinuaufostrespectate,recoltareasevafacedupminim4oreetc (veziicapitolul6).Produsulrecoltattrebuieprelucratctmairepedeposibil,nsnniciuncaznu trebuiestreacmaimultde23oredelarecoltarepnlacultivare(preferabil12ore).ncazuln careseestimeazdepireaacestuiintervaldetimptrebuiefolositunmediudetransport,ex. mediulStuart(veziicapitolul9).Chiarinaceastsituaie,nuartrebuistreacmaimultde24 deorepnlaprelucrareap.p. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaadoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelordelanivelfaringian,prezenacelulelorinflamatorii(ex.leucocite,piocite)i prezenacocilorgrampozitiviaezaiseparat,nperechisaunlanuri,dariaaltortipuride microorganisme.Examenulmicroscopicalp.p.aredoarunrolorientativ. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Streptocociipiogenisuntgermenipretenioicarenusedezvoltpemediidecultur obinuite.Mediulcelmaifrecventfolositesteagarsnge,pecareculturaaparenn1848ore,la 3537C.ncazulncarenuremarcmapariiadecoloniicaracteristicedup24deore,reincubm placaPetripentruncozi.ColoniileauaspectdetipScudiametrulde0,51mm,nconjurate deozondebhemoliz(zonclardehemoliz,cuundiametrumultmaimaredectdiametrul coloniei).ncursulnsmnrii,pecelpuinunadintrelaturilepoligonuluidescristrebuies realizmionepareamediuluinaafelnctinocululsajungmainprofunzime.Aceast manevr(existialtevariantetehnice)estenecesarpentruapermiteactivitateahemolizineiO (aceaststreptolizinesteinactivatnprezenaoxigenului).Speciilecareproducmaterial

capsular,dinacidhialuronic,adeseoridaunatereunorcoloniimucoide(detipM).Sepotfolosi pentrucultivareimediiselective(deex.agarsngeplustrimetoprimsulfametoxazol). 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocigrampozitivi,sfericisauovoidali,cudiametrulde circa1.Sedividntrunplanperpendicularpeaxalorlungisepotdispunenlanuri.Lungimea lanurilorvariaziestecondiionatdefactoridemediu. Caracteredecultur:ProduccoloniidetipScudiametrulde0,51mm,nconjurate deozondebhemolizsaucoloniidetipM. Caracterebiochimice: Streptocociipiogeniproduchemolizdetipbeta. PrintestulPYResteidentificatsintezapirolidonilamidazei(actualmenteexistiteste comerciale,rapide,pentrutestulPYR). MultiplicareastreptococilordegrupAesteinhibatdebacitracin(antibioticprodus deBacilluslicheniformis).SeapreciazcdintretulpiniledeStreptococcuspyogenes,maipuinde 1%suntrezistentelabacitracin(vezicapitolul12). Streptocociipiogenisuntrezistenilatrimetoprimsulfametoxazol. Caractereantigenice: Sepotutilizatestecomercialepentrudetectarearapidapolizahariduluispecificde grupAalstreptococilorpiogeninp.p.,dupextraciechimicsauenzimatic(ex.cupronaz). Tehnicileutilizatepotfiaglutinareaindirect(latexaglutinare),coaglutinareasauELISA. Prinreaciideaglutinare(latexaglutinare,coaglutinare)pelam,sauprecipitaresepot determinaantigenelestreptococicedegrup(Lancefield)saudetip. S.pyogenesestempritnserotipuripebazaantigenelorproteiceM(peste80)prin reaciadeprecipitarentuburicapilareiT(28serotipuri)prinreaciadeaglutinarepelam.Aceste testrisefacncentredereferin. Altetesteutilizatenidentificare:Sepotutilizasondelenucleotidicepentrudetectarea directastreptococilordegrupAnexsudatulfaringian. 5.Streptocociipiogeniimeninsensibilitateacunoscutlapenicilin(aufostidentificaten ultimaperioadtulpinitolerante,caresuntinhibatedarnudistrusedectrepenicilin).Pentru pacieniialergicilabetalactaminesepoatealegepentrutratamenteritromicina,daraufost identificatetulpinirezistentelaacestmedicamentantimicrobianinacestcazantibiogramadevine necesar.ngeneralantibiogramaserealizeaznscopepidemiologic. Diagnosticuldelaboratorserologic DiagnosticulimunologicalinfeciilorprodusedestreptocociibhemoliticidingrupulAarputea constadininvestigareafiearspunsuluiimunumoral(prezenaititrulanticorpilor,ncadrul diagnosticuluiserologic),fiearspunsuluiimundetipcelular.ncontinuarenuvomdiscutadect diagnosticulserologic,careareimportanpractic. Diagnosticulserologicesteutilpentrucertificareaetiologieibolilorpoststreptococice(RAA, GNA),identificareauneieventualestridehipersensibilitate,diagnosticulretrospectivaluneiinfecii streptococice,evaluareaevoluieicliniceieficacitiitratamentului.Diagnosticulserologicse realizeazdeobiceiprinreaciaASLO,careidentifictitrurialeanticorpilorantistreptolizinO(vezi icapitolul19).Testareasefacendinamic,peserurirecoltatelaintervalde710zile.Pentru

zonanoastrgeograficseacceptcanormaluntitrude200(maxim250)unitiASLO.Estestrict necesarrealizareacontroluluiinterniexterndecalitate. Existtesteserologicepentrudeterminareaprezeneiititruluianticorpilorfadealtestructuri antigenice(streptodornaz,hialuronidaz,streptokinaz).Titrulanticorpilorantistreptodornazeste crescutlapacieniicuinfeciitegumentareitrebuieinvestigatdacsesuspicioneazprezenaunei glomerulonefriteacute.Sepotdeterminaianticorpiianticarbohidrat(hemaglutinarepasiv)sau antiMAP(prinlatexaglutinare).

26. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus pneumoniae

Streptococcuspneumoniaeseprezintsubformdecocigrampozitivi,alungii,lanceolai, dispuingeneralndiplopeaxullongitudinal,ncapsulai,nesporulai,imobili.Pneumocociisunt aerobi,facultativanaerobi.PegelozsngedeterminahemolizlafelcaStreptococcusviridans. Creterealorestefavorizatnatmosferde5%CO2laotemperaturde37C.Streptococcus pneumoniaepoatedevenipatogenprinmultiplicareiinvazivitate,conducndlaapariiaunorvariate infeciialetractuluirespiratorsuperioriinferior,aleurechiimedii,alesinusurilor,darialteinfecii produseprindiseminarehematogen(ex.meningit,endocardit,carepotfifoarte grave).Pneumoniapneumococicsensoetedeprezenaedemuluialveolariaunuiexsudat fibrinos,urmatdeapariiadehematiiileucocite. Datoritfaptuluicpoatefacepartedinfloramicrobiannormal,existoseriedeproblemen ceeacepriveteinterpretareasemnificaieiprezeneipneumococilornprodusepatologicecarepot ficontaminatecuaceastflor(ex.sputarecoltatprinexpectoraie).Unadintremarileprobleme terapeuticedecurgnddindezvoltarearezisteneilaantibioticeoreprezintapariia pneumococilorrezistenilapenicilinialtemedicamenteantibacteriene. Pentruadiscutadiagnosticuldelaboratorninfeciileprodusedepneumococivomalegedrept entitatepatologicreprezentativpneumoniapneumococic. Diagnosticulpneumonieipneumococice Diagnosticulpneumonieipneumocociceesteclinic,radiologiciardinpunctdevederealstabilirii etiologieiesteundiagnosticbacteriologic(direct). Diagnosticuldelaboratormicrobiologicestenumaibacteriologic(direct). 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).nfunciedemaladiaprovocatsepotrecoltaurmtoareleproduse patologice:sput,aspiratbronicsautraheal,exsudatfaringian,secreiioticesauconjunctivale, lichidpleural,lichidpericardic,LCR,puroi,snge,materialnecroptic.npneumoniapneumococic agentuletiologicpoatefiizolatiprinhemocultur.ncontinuarevomdiscutacazulncarep.p. estereprezentatdesput(veziicapitolul6).

2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelordelanivelalveolar(ex.macrofagealveolare),prezenacelulelor inflamatorii(ex.leucocite)iprezenacocilorgrampozitivi,alungii,lanceolai,dispuin generalndiplo,ncapsulai(cuocapsulcomun),nesporulai.Examinareamicroscopictrebuie sdemonstrezecalitateaprodusuluipatologicisrealizezeoidentificareprezumtiva microorganismuluiimplicat(veziicapitolul52).ncoloraiacualbastrudemetilen,capsulapoate apreacaunhalounjurulpneumococilor.Utilizndanticorpianticapsulari,sepoaterealizao identificarerapidinclusivdirect,peprodusulpatologic(deexemplusput),prinreaciade umflareacapsulei(vezicapitolul12,punctul12.14). 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Pneumocociisuntgermenipretenioi,carenusedezvoltpemediisimple,suntaerobi, facultativanaerobi.PegelozsngeformeazcoloniidetipSsaudetipM,nconjuratedeozon deahemoliz(lafelcaStreptococcusviridans).Multiplicareaestefavorizatnatmosferde5% CO2laotemperaturde3537C.nmediiledeculturlichidetulburomogenmediul. Produsulpatologicsepoateinoculailaanimaledelaboratorsensibile,respectivlaoareci albi. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocigrampozitivi,alungii,lanceolai,dispuingeneral ndiplo,ncapsulai(cuocapsulcomun),nesporulai. Caracteredecultur:PegelozsngeformeazcoloniidetipSsauM,nconjuratedeo zondeahemoliz(lafelcaStreptococcusviridans). Caracterebiochimice: Glucozareprezintprincipalasursdeenergiepentrupneumococi.Acetiaelaboreaz enzimezaharolitice,proteoliticeilipolitice. Fermentareainulineireprezintuncaracterbiochimicimportant,utilndiferenierea pneumococilordes.viridans(existtulpinideS.viridanscarefermenteazinulina).Seutilizeaz unmediuncareexistinuliniunindicatordepH.ncazulreacieipozitivearelocomodificare depHirespectivmodificareaculoriimediului. Pneumocociielaboreazenzimeautolitice.Autolizaesteindusiacceleratdebil, sruribiliare,acizibiliaritestulesteutilnidentificareapneumococilor(testulbilolizei,Neufeld vezicapitolul12,punctul12.3). Suntsensibililaoptochin(etilhidrocuprein),sensibilitatealaaceastsubstanfiind deasemeneautilnidentificareidifereniereadeStreptococcusviridans(vezicapitolul12, punctul12.13). Caractereantigenice: Celmaiimportantdeterminantantigenicipatogenicestecapsulapolizaharidic (antigenulK),ceprotejeazpneumococulfadefagocitozipermiteinvazivitatea.Structura polizahariduluicapsularestespecificfiecruiserotipnparte.Pnnprezentaufostidentificate peste85deserotipuricapsularediferite,acrorstructurafostdeterminatpentrumajoritatea

serotipurilor.Aufostproduseserurispecificeanticapsularepolivalenteimonovalente,utilen identificareapneumococilorcuajutorulreacieideumflareacapsulei(vezicapitolul12,punctul12. 14).nacelaiscopsepoateutilizaireaciadeaglutinare. DatoritfaptuluicprinurinseelimincantitidestuldeimportantedeAgK,prezena acestuiapoatefievideniatprinreaciidelatexaglutinaresaumaibineprinimunoelectroforez. Caracteredepatogenitate:Sepoateutilizainocularealaoarecelealb(vezicapitolul 11). Altetesteutilenidentificare:Sepotutilizasondenucleotidicepentruidentificarea ARNr. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)esteobligatorieiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetricepemedii suplimentatecusngedefibrinatdeoaie.Pentruverificareasensibilitii/rezisteneilapenicilinse utilizeazmicrocomprimatecuoxacilin(1mg).ncazulunorinfeciigraveantibiogramatrebuies fiensoitdealtedeterminri(vezicapitolul14).

27. Diagnosticul de laborator n infeciile produse microorganisme din genul Neisseria

FamiliaNeisseriaceaeincludemaimultegenuri. Exemplu:Neisseria,Moraxella,Acinetobacter,Kingella.ngenulNeisseria,speciileimportante pentrupatologiaumansuntNeisseriameningitidis(meningococul)iNeisseria gonorrhoeae(gonococul),darsepotamintiiN.lactamica,N.sicca,N.subflavaetc.nacest capitolvomdiscutanumaidiagnosticuldelaboratorninfeciileprodusedemeningococigonococ. Neisseriileseprezintsubformdecocigramnegativi,dispuindiplo,reniformi,imobili, nconjuraideostructurcapsularcomun.nfunciedestructuracapsuleiexistmaimulte serogrupuri.Ambelemicroorganismesuntoxidazopozitiveiaunevoienvedereaizolriide utilizareaunormediideculturmbogite,necesitilenutritivefiindmaimarincazulgonococului. PrincipialsepotmultiplicapemediulMuellerHinton(amintitilaantibiogramadifuzimetric)dup ceizolareadinp.p.afostrealizatpealtemediimbogite.Multiplicareaareloclaotemperatur deincubarede3537Cincondiiileuneiatmosferede310%CO2.Coloniileaparn2448deore, mairapidncazulmeningococului.

Neisseriameningitidis
Neisseriameningitidispoatefacepartedinfloramicrobiandelaniveloral,nazalsaufaringian. Colonizareapoatepersistasptmnisaulunidezile.Meningococulesteunmicroorganism

condiionatpatogencarepoatefiimplicatninfeciirespiratorii,darestesemnificativdereinutfaptul cprininvazivitatepoateconducelaapariiauneibacteriemiincursulcreiacomplicaiaprincipal estemeningitameningococic.Meningococulreprezintunadinprimeletreicauzedemeningit infecioaslaaduli(alturideHaemophilusinfluenzaeiStreptococcuspneumoniae). Diagnosticulmeningiteimeningococice Diagnosticulmeningiteimeningococicepornetedelaelementeleclinice,eventualntrun anumecontextepidemiologicdinpunctdevederealstabiliriietiologieiesteundiagnostic bacteriologic(direct). Diagnosticuldelaborator nmeningitameningococicdiagnosticulesteurgent(riscdeevoluiecusechelei/sau deces),deimportanmaximfiindrecoltareaitransportulrapidalLCRctrelaborator.Estede preferatrealizareauneicultivrilapatulbolnavului,chiardacpentruconcentrareagermenilorar puteafinecesarcentrifugareaLCR.AnalizacitologicibiochimicaLCResteutilnstabilirea etiologiei. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmai rapidicorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).Aacumammenionat,recoltareaLCRprinpuncie(dupverificareapresiuniidin arteracentralaretineiprinexaminareafunduluideochi)trebuiefcutpectposibillapatul bolnavului,avndladispoziietotceestenecesarpentrupregtireafrotiurilor,cultivareapediferite mediidecultur,repartizareauneicantitideLCRpentruexamenulcitologicibiochimic(vezii capitolul6).LCRpoatefipurulent.ncazulncarep.p.urmeazafitransportatctrelaborator, transportultrebuierealizatfrntrziere(laotemperaturapropiatde37C).Meningococular puteafiizolatiprinhemocultur,cultivareasecreiilornazalesaufaringieneetc. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.DacLCRestefrancpurulentfrotiurilesepotexecutadirectdinp.p.,ncaz contrarrealizminiialcentrifugareaLCR.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersie isenoteazprezenacelulelorinflamatorii(ex.leucocite)iprezenacocilorgramnegativi, dispuindiplo,reniformi,imobili,nconjuraideostructurcapsularcomun,situaiintrasau extraleucocitar. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Meningocociisuntgermenipretenioi,carenusedezvoltpemediisimple,suntaerobi, facultativanaerobi.Sepotutilizamediiselective(ex.mediincareseincludevancomicin,colistin, trimetopriministatin)sauneselective(ex.MuellerHinton,gelozsngesaugelozchocolat)pe careformeazcoloniidetipSsaudetipM.Estenecesaroatmosferde35%CO2,lao temperaturde37C. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocigramnegativi,dispuindiplo,reniformi,imobili, nconjuraideostructurcapsularcomun,nesporulai. Caracteredecultur:ColoniiledemeningococsuntdetipS,cudimensiunidecirca12

mm.Tulpinilencapsulate(ex.grupeleA,C)potconducelaapariiaunorcoloniidetipM. Caracterebiochimice: Metabolizeazdiferiicarbohidrai,activitatecarepoatefiutilnidentificare.Spre exemplumeningococulmetabolizeazattglucozactimaltoza. Produccitocromoxidaz,untestcheienidentificare(veziicapitolul12) ExistoseriedesistemecomercialepentruidentificareexoenzimaticaNeisseriilor (ex.QuadFerm+,RIM,Miniteketc). Caractereantigenice:nfunciedestructuralipooligozahariduluiexist12serotipuri.Cel maiimportantdeterminantantigenicestecapsulapolizaharidic.Structuracapsularpermite subdivizareaspeciein13serogrupuri.Dintreacesteamaiimportantesuntgrupele:A,B,C,Yi W135. Prezenameningococuluipoatefidetectatdirectnprodusulpatologicprinlatex aglutinare,coaglutinaresaucontraimunoelectroforezutilizndseruripolivalenteantiA,C,Y, W135irespectivserurimonovalenteantiB(sepotdetecta0,020,05mgdeAg/ml).Denotat posibilitateauneireactivitincruciatefadeAggrupuluiB,respectivAgK1delaE.coli. Tehnicisimilaresepotutilizapentruidentificareatulpinilordemeningococizolaten cultur. Caractereutilizatentiparea(tipizarea)tulpinilorizolate:Existdiferitetehnici (imunologice,electroforetice,debiologiemolecular)caresuntpracticatenumaincentrede referin.UtilizareaPCRareosensibilitateispecificitatedecirca91%foarteutillapacienii pentrucaresainiiatdejaantibioticoterapia. 5.Antibiograma(testareasensibilitiitulpinilorizolatenvedereastabiliriitratamentului)este recomandatiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.ncazulunorinfeciigrave antibiogramatrebuiesfiensoitdealtedeterminri(vezicapitolul14). Neisseriagonorrhoeae Infeciilegonococicecontinusreprezinteoproblemimportantdesntatepublic. Dupptrundereanorganismulreceptiv,nfunciedecaleadetransmitere,gonococulse ataeazdemucoase(genitourinar,ocular,rectal,faringianetc)iproducelocalosupuraie acut.Labrbaiapareuretritagonococic.Lafemei,gonoreeaselocalizeazendocervical,darse poateextindelaniveluluretrei,vaginului,glandelorBartholin,trompeloruterine.Dacmamaare gonoreeinounscutulsenatepecalenatural,poateapreaoftalmiagonococic.Rareori gonococulpoatediseminapecalesanguin(bacteriemie),cuapariiaunorleziunidermice,artrite, tenosinovitegonocociceetc. Diagnosticuldelaboratorngonoree Diagnosticuldelaboratorestenumaibacteriologic(direct),cuetapelecunoscute. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmai rapidicorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).Labrbatsepreleveazsecreiauretral(eventualpicturamatinal)iarla femeierecoltareatrebuieefectuatpemasginecologicdelanivelulcoluluiuteriniglandelor Bartholin(veziicapitolul6).Secreiileaudeobiceiunaspectpurulent.Estedepreferat cultivareaimediat,pemediideculturpotriviteinatmosferdeCO2.ncazulncarep.p.

urmeazafitransportatctrelaborator,transportultrebuierealizatfrntrziere(laotemperatur apropiatde37C).Chiarincazulutilizriimediilordetransport(ex.mediulAmiespluscrbune activat),acestanuartrebuisdurezemaimultde6ore.Gonococularputeafiizolatiprin hemocultur,cultivareasecreiilorconjunctivale,faringiene,cultivareaurineietc.ncazulncarenu existniciosecreie,sepoateutilizaurinacaretrebuiecentrifugatinsmnatimediatpe mediidecultur. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelor,acelulelorinflamatorii(ex.leucocite)iprezenacocilorgramnegativi, dispuindiplo,reniformi,imobili,nconjuraideostructurcapsularcomun,situaiintrasau extraleucocitar. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Gonocociisuntgermenifoartepretenioi,carenusedezvoltpemediisimple,suntaerobi, facultativanaerobi.Sepotutilizamediiselective(ex.mediincareseincludevancomicin,colistin, trimetopriministatin)sauneselective(ex.mediulGC,gelozsngesaugelozchocolatcu diferitesuplimentenutritiveserecomandutilizareapulberiidehemoglobininuasngelui proaspt).Estepreferatcultivareandublu,pemediiselectiveineselectivencazulncarep.p. estereprezentatdesecreiedelanivelulrectuluisaudesecreiefaringiansevorfolosinumaimedii selective.Estenecesaroatmosferde310%CO2,laotemperaturde3537C.Coloniileaparn 2448deore.GonococulproducecoloniidetipS,cudimensiunide0,51mmsaucoloniidetipM, nepigmentate,transparentesauopace.Estederemarcatfaptulcnaceeaiplacpotaprea pnlacincitipuridecolonii(T1T5),ceeacepoatefacilitaidentificarea.Placaesteeliminatn cazulncarenusedezvoltcolonii,dup72deore. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocigramnegativi,dispuindiplo,reniformi,imobili, eventualnconjuraideostructurcapsularcomun,nesporulai.Sepoateutilizaicoloraia fluorescent. Caracteredecultur:ColoniiledegonococsuntdetipSsauM(vezipunctul3). Caracterebiochimice: Metabolizeazdiferiicarbohidrai,activitatecarepoatefiutilnidentificare.Gonococul metabolizeazglucozadarnuimaltoza. Produccitocromoxidaz,untestcheienidentificare(veziicapitolul12). Testulcatalazei(superoxol)esteintenspozitiv. ExistoseriedesistemecomercialepentruidentificareexoenzimaticaNeisseriilor (ex.QuadFerm+,RIM,Minitek,GonochekIIetc). UtilizndgaleriaAPINH(manual)putemidentificaspecii deNeisseria,HaemophilusiBranhamellacatarrhalis,nnumai4ore. Caractereantigenice: nfunciedestructuralipooligozahariduluiexist6serotipuri.Gonocociipotexprima simultanmaimultestructuriantigenicdiferite,ceeacecreazproblemetehnice.Acestetestrise

realizeazncentredereferin. Prezenagonococuluipoatefidetectatdirectnprodusulpatologicprincoaglutinare (suspensiedeS.aureustipCowanIstabilizatisensibilizatcuAcmonoclonaliantiproteinIdin membranaexternagonococilor)sauprintrotehnicimunoenzimatic(cuAcpoliclonali). SepotutilizaAcmonoclonalicunoscui,pentruidentificaregonococuluiprintehnica imunofluoresceneidirecte. Caractereutilizatentiparea(tipizarea)tulpinilorizolatesaudirectpentrup.p.: Existdiferitetehnici(imunologice,biochimice,debiologiemolecular)caresunt practicatenumaincentreledereferin. Metodelebiologieimoleculareauattospecificitatectiosensibilitatefoartebunse potutilizafieporninddelaculturifiedelap.p. Sondelenucleotidice PCR LCR(LigaseChainReaction)aceastmetodsepoateutilizaporninddelaurinsau delasecreiivaginaleiareunsingurdezavantaj,costulridicat. 5.Antibiograma(testareasensibilitiitulpinilorizolatenvedereastabiliriitratamentului)este recomandatiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice(mediulutilizatesteGC suplimentatnutritivdarfrpulberedehemoglobin).Aufostidentificatetulpinirezistentela penicilin(fiedatoritunuiplasmidcarecodificoblactamazdetipulTEM,fiedatoritunor mutaiicromozomiale).Estenecesartestareaproduceriideblactamaz(deex.folosinddiscuricu nitrocefin).DeterminareaCMIsepoaterealizaprinmetodeclasicesaucuajutorultestuluiE(vezi capitolul14).

28. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de enterobacterii. Coprocultura.

FamiliaEnterobacteriaceaecuprindeunimportantnumrdegenuridemicroorganisme semnificativedinpunctdevederemedical(28)inumeroasespecii(peste100,ncazulncarenu lumnconsiderareclasificareagenuluiSalmonellanpeste2000despecii).Dintregenurileincluse naceastvastfamilie,vomaminti urmtoarele:Escherichia,Shigella,Salmonella,Yersinia,Klebsiella,Proteus,Citrobacter,Edwarsie lla,Enterobacter,Morganella,ProvidenciaiSerratia.ncapitoleleurmtoarevomdiscutanumai desprediagnosticulninfeciileprodusedemicroorganismeleaparinndprimelor6genuri enumerate.Enterobacteriilesuntbaciligramnegativicarenusepotdifereniaprinmicroscopie optic,mobilicuciliperitrichi(ex.Salmonellaspp.,Proteusspp.),sauimobili (ex.Shigella,Yersinia,Klebsiella),nesporulaiunelespeciiprezintcapsul(ex.Klebsiella pneumoniae).

Suntgermeninepretenioicaresepotmultiplicapemediisimple,aerobifacultativanaerobi, utilizeazfermentativglucozacusaufrproduceredegaz,suntoxidazonegativi,catalazopozitivi, reducnitraii.FormeazcoloniidetipS,R(ncazulculturilorvechi)sauM(pentruspeciile capsulate),potfermentalactoza(ex.Escherichiacoli,Klebsiella)sausuntlactozonegativi (ex.Salmonella,Shigella,Yersinia).Pentruizolareaspeciilordeenterobacteriiputemfolosimedii selective,diferenialeiselectivodifereniale.Existmediicuselectivitatemaireduscareinhib majoritateabacteriilorgrampozitiveipermitedezvoltareatuturorenterobacteriilor(ex.mediulMac Conkeycusruribiliarenconcentraiemicsepoateadugaicristalviolet),mediicu selectivitatemediecareinhibmultiplicareaenterobacteriilorlactozopozitive(ex.mediulADCLcu dezoxicolat,citratilactoz,mediulShigellaSalmonellacusruribiliareiverdebriliantsaumediul XLDcuxiloz,lizinidezoxicolat,preferatnmultedintrerileUniuniiEuropene)imediicu selectivitatenalt(ex.mediulWilsonBlaircuverdebriliantnconcentraiecrescut). Caracterelebiochimicesuntesenialepentruidentificareaenterobacteriilor.Dupexaminarea caracterelordecultur(pemediileselectivodiferenialesepoateidentificaicomportamentul enterobacteriannceeaceprivetefermentarealactozei),prinrepicareacoloniilorsuspectepe mediipotrivite(TSI,MIU/MILF,Simmonsetc),nziuaurmtoaresepotexaminadiferitecaractere biochimice(fermentareazaharurilor,evideniereaunuianumitmetabolit,metabolizareaunuianumit substrat,utilizareacitratuluicaunicsursdecarbon,identificareaunorenzimeetc)saualte caracterefenotipice(ex.motilitatea).nmomentuldefaexistbateriidetesteisisteme comercialecarepermitexaminareauneigameextinsedecaracterebiochimice(ex.galeriileAPI). Dorimsmenionmcpentrufiecaretestfenotipicexistoseriedevariaiicaresuntprezentate procentualntabelespecialdedicate. Unaltaspectfoarteutilpentruidentificareestereprezentatdestudiereacaracterelorantigenice folosindseruricunoscute(preparatepeanimaledelaborator),cuajutoruldiferitelorreaciiAgAc (veziicapitolele1520).ToateenterobacteriiledeinAgO.EnterobacteriilemobiledeinAgH. EnterobacteriilecapsulatedeinAgK.SalmonellatyphiprezintiAgVi,Yersiniapestisprezint AgF1etc. Infeciileenterobacterienesuntdestuldevariate.Potfilocalizatelaniveldigestiv(dizenteriei sindroameasemntoaredizenteriei,sindroameasemntoareholerei,toxiinfeciialimentareetc), lanivelultractuluiurinar,lanivelulaparatuluirespiratorsaulanivelulsistemuluinervos.Infeciile enterobacterienepotaveaialtelocalizrisaupotfigeneralizate(deex.nfebratifoid,febrele paratifoide,pest). nmajoritateainfeciilorprodusedeenterobacteriidiagnosticulestebacteriologic,direct.nfebra tifoiddiagnosticulpoatefiattbacteriologicctiimunologic(serologic). Datoritfaptuluicnmultedintreacesteinfeciiprodusulpatologicestereprezentatdectre materiilefecale,ncontinuarevomdiscutaexamenulbacteriologicalmateriilorfecale.

Coprocultura
nmultedintreinfeciileprodusedeenterobacterii,caresemanifestprinsindromdiareic, utilizmcoprocultura.nceleceurmeazvomdiscutacoproculturangeneral,nunumaidinpunctul devederealuneiinfeciienterobacteriene.

Boaladiareicacut

Boaladiareicacut(BDA)afostirmneoentitatepatologicfoarterspnditlanivel mondial.Spreexemplu,naranoastrnultimiiani,numruldecazuridebolidiareiceacuteafost de85.055nanul2000,81.268nanul2001irespectiv97.317nanul2002,cuoincidende 446,50/0000n2002.naceeaiperioaddetimp,nfiecareanaudecedatdatoritBDAcirca100de pacieni. Sindromuldiareicincludeeliminareaapeste3scaunen24deoreiarscauneleauconsistena diminuat(pnlaemitereaunorscauneapoase,cupierdereaapnla2030litri/zinholer). Materiilefecalepotaveaaspectpatologic(apos,mucos,purulent,sanguinolentetc),culoare modificat,mirosparticularetc.Deregulsindromuldiareicasociazialtesemneisimptome digestive(dureriabdominale,tenesme,grea,vrsturietc)saugenerale(febr,staregeneral alteratetc).FoarteimportantiobligatoriudereinutestecBDAducelapierderideapi electroliiiarinterveniaceamaiimportantcaretrebuieavutnvedereestereechilibrarea hidroelectrolitic.

Agenietiologici
Boaladiareicacutpoatefideetiologieinfecioasineinfecioas.ncontinuarevomdiscuta pescurtetiologiainfecioasngeneral,nunumaiceabacteriansaufungic.Estedemenionatc mareamajoritateaBDAinfecioaseauetiologieviral. Etiologiabacterianinclude: Salmonellaspp. Shigellaspp. Escherichiacoli(EPEC/enteropatogen,ETEC/enterotoxigen,EHEC/ enterohemoragic,EIEC/enteroinvaziv,EAEC/enteroagregant,DAEC/aderentdifuz) Klebsiellaspp. alteenterobacterii(Yersiniaenterocolitica,Citrobacterspp.,Proteusspp.etc) Vibriocholeraeialivibrioni alibaciligramnegativi(Aeromonasspp.,Alcaligenesspp.,Pseudomonasspp.etc) Bacilluscereus Campylobacterjejuni Clostridiumperfringens,Clostridiumdifficile Clostridiumbotulinum Staphylococcusaureusetc Etiologiafungicinclude: Candidaalbicans(lapacienicuSIDA)etc Etiologiaparazitarinclude: Giardialamblia EntamoebahystoliticaiEntamoebacoli Trichinellaspiralis Cryptosporidiumparvum Strongyloidesstercoralisetc Etiologiaviralinclude: rotavirusurile virusurileNorwalkiasemntoarevirusurilorNorwalk calicivirusurile

astrovirusurile coronavirusurile enterovirusurile adenovirusurileetc. Grupareaageniloretiologicinfunciedemecanismulpatogenic Attdinpunctdevederediagnosticctipentrutratamentpoatefiimportantelucidareatipului demecanismimplicat.Astfel,BDAarputeafiproduseprin: mecanismneinflamator,atuncicnddinpunctdevederemicroscopicnpreparatulntre lamilamelnuseevideniazleucocite(ex.BDAprodusedeVibriocholerae,ETEC,Clostridium perfringens,Staphylococcusaureus,Giardialamblia,rotavirusuri,virusuriNorwalk,Cryptosporidium parvumetc) mecanisminflamator,atuncicnddinpunctdevederemicroscopicnpreparatulntre lamilamelseevideniazleucocitepolimorfonucleare(ex.BDAprodusedeShigellaspp., EIEC,Salmonellaenteritidis,Vibrioparahaemolyticum,Entamoebahystoliticaetc) mecanismdepenetrare,atuncicnddinpunctdevederemicroscopicnpreparatul ntrelamilamelseevideniazleucocitemononucleare(ex.BDAsausindromdiareicprodus deSalmonellatyphi,Yersiniaenterocoliticaetc). Dupcumsepoateremarca,simplarecoltareaprodusuluipatologicurmatderealizareaunui preparatnativ(vezicapitolul7)iexaminareamicroscopicaacestuiapotdainformaiiimportante cuprivirelaetiologiaprobabilprecumiatitudineaterapeuticdeurmat.Esteevidentcntro BDApentrucareageniietiologicisuntviralisaumecanismulpatogenicincludeaciuneaunei toxineestecontraindicatadministrareadeantibioticesauchimioterapiceantibacteriene. Indicaiilecoproculturiinbacteriologie atuncicndestesuspicionatoinfeciecuShigellaspp.,Vibriocholerae,E.coli(tipurile patogene),Campylobacterspp.,YersiniaenterocoliticasauSalmonellaspp.nspeciallapacienicu vrsteextremesauimunodepresie dupcirca1sptmndeladebutulfebreitifoideetc atuncicndBDAprezintrisculextinderiilaniveluluneicolectiviti(cree,grdinie, tabere,unitidealimentaiepublic,staiidedistribuieaapeipotabileetc) atuncicndBDAaparelapacienicareaufosttrataicuantibioticeiarsindromuldiareic persistidupntrerupereaantibioticoterapiei atuncicndsindromuldiareicpersistmaimultdeosptmnsauarelocorecdere nscopulverificriistriidesntateapersoanelorcarelucreaznunitidealimentaie public(conformnormativelorstabilitedectreministerulsntii) nscopdecercetareetc. Recoltareaitransportulmateriilorfecale Sevorrespectarecomandrilemenionatencapitolul6,nspecialfaptulcrecoltareap.p. trebuiesserealizezenaintedeadministrareademedicamenteantimicrobiene.Sepotrecoltai examina: scaunulemisspontanreprezintprodusulpatologicutilizatcelmaifrecvent.Defecaia arelocntrunrecipientdecartonsauntruncontainerdinmaterialplasticdeunicntrebuinare (carepoatefiapoidecontaminatieliminatfrprobleme).nacelaitimpefectumiexaminarea macroscopicap.p.dinpunctuldevederealmirosului,culoriisauaspectului.Utilizmpentru

prelevarelinguriarecoltoruluialegndporiunicarepermitcuomaimareansizolareaagentului patogen(fragmentemucopurulente,poriunicusnge,flocoaneriziformeetc)sauporiunidiferite dintrunscaunncarenuseremarcaspectelemenionateanterior.Prelevmocantitatede aproximativ1grampecareosuspensionmnmediuldetransport(minim2mlncazulscaunelor apoase). tamponulrectalesterecomandatncazuluneiinfeciicronicecuShigellaspp.,atunci cndsuspicionmportajuldeShigellaspp.sauSalmonellaspp.Tamponulsterilseintroducecu blndeeisepreleveazsecreiiledelanivelulmucoaseirectale,prinrotire,pentruarecolta materialdincriptelerectale.Apoiintroducem.tamponulnmediuldetransport.Pentruaputea nchiderecoltorul,tiemnmodcorespunztortijatamponului. sondaNelatonsepoateutilizaatuncicndurmrimrecoltareap.p.delanivelulcolonului sigmoid.Introducemcublndeesondapnlaniveluldorit(circa1012cmlacopilirespectiv circa1520cmlaadult),adaptmlacellaltcaptalsondeioseringiaspirmp.p.delanivel sigmoidian.Introducemp.p.nmediuldetransport. ncazulncarep.p.nupoatefiprelucratimediatsaunmaxim1or,utilizmunmediude transport,transportullarece(+4C)sautransportulnmediudetransportmeninutla4C.Celmai frecventutilizmmediulCaryBlair(vezicapitolul9).Acestmediuasigursupravieuirea enterobacteriilorpatogenetimpde2448deore,inhibndnacelaitimpmultiplicareafloreide asociaie.AtuncicndestesuspicionatinfeciacuV.cholerae,apapeptonatalcalinserveten acelaitimpdreptmediudetransportimediudembogire. Examinareamateriilorfecale Materiilefecalesuntexaminatemacroscopicimicroscopic.Dinpunctdevederemicroscopic, defiecaredatsevorrealizapreparatenative(ntrelamilamel).Materiilefecalesunt suspensionatentropicturdelugolsaudealbastrudemetilen1%iarpreparatulsevaexamina iniialcuobiectivul10,apoicuobiectivul40.Spreexemplu,evideniereaapeste40PMN/cmp, nsoitedemacrofageihematii,conducelasuspicionareauneidizenteriibacteriene.Frotiurile coloratepotfiutilensuspicionareadiagnosticuluideenterocolitcuCampylobacterspp.saual coliteipseudomembranoase,postantibioticoterapie. Cultivareamateriilorfecale nmodobinuit,pentrucultivarevomutiliza3mediidiferite,respectivoeprubetcubulion selenitaciddesodiui2plciPetri,unacumediucuselectivitatesczut(ex.MacConkey)i altacumediucuselectivitatemedie(ex.ADCLsauXLD).Acestemediiselectivesuntnacelai timpimediidifereniale. Alegemfragmentecaracteristicedinp.p.(mucus,puroietc)insmnm23ansenmediul cubulionselenit(mediudembogirenspecialpentruSalmonellaspp.).Realizmosuspensie omogennmediullichid.Prelevmoans(sauopictur)dinsuspensieiodepunempemediul MacConkey.Moduldensmnarediferdecelprezentatncapitolul10.ntindemp.p.nstriuri paralelepeojumtatedeplac,pnaproapedemarginileplciifrsleatingem.Frs sterilizmansa,atingemultimile34striuriidispersmp.p.naltestriuriparalele,perpendiculare peprimele,pejumtatedinmediuldisponibil,pnaproapedemarginileplciifrsleatingem. Atingnddinnouultimele34striuri,dispersmp.p.nmodsimilarpemediulncnensmnat. Incubmtimpde1824deorela3537C. nziuaurmtoare,porninddelatubulcubulionselenitnsmnmaacumammenionatmai

susoplaccuMacConkeyioplaccuADCL(sauXLD)incubmacesteplcitimpde1824de orela3537C.Examinmplcilensmnateprecedentnvedereaselectriicoloniilorsuspecte. PemediulMacConkeycoloniilelactozopozitiveaudimensiunide13mm,suntroii,pot prezentaunhalouopalescent,deregulsuntdetipSdarpotfiidetipM.Coloniile lactozonegativeaudimensiunide12mm,nusuntcolorate,sunttransparente,deregulsuntde tipS. PemediulADCLmajoritateabacteriilorlactozopozitivesuntinhibatepotapreatardivcolonii dedimensiunimaimici,roii,detipS.Coloniilelactozonegativeaudimensiunide12mm,nusunt colorate,suntsemitransparente,detipSdacproducH2Scentrulcolonieiestedeculoareneagr. Deregulurmrimapariiacoloniilorlactozonegative,iarpentruetapeledeidentificarevom repica(fraatingemediuldecultur)3coloniincazulncarepacientulestecopili35coloniin cazulncarepacientulesteadult.ncazulncarenuexistcoloniilactozonegative,pentru identificarevomrepica(frsatingemmediuldecultur)10coloniilacopilirespectiv10colonii laadult(dacseconsidercidentificareaestenecesar,deex.nizbucniriepidemicedeBDA). Aadar,dupapariiacoloniilorizolatepemediileselectivodiferenialetrecemlaidentificarea speciilorimplicatepatogenicpebazacaracterelormorfotinctoriale,decultur(vezicapitolul11), biochimice(vezicapitolele11i12),antigenice(vezicapitolele1120,nspecialcapitolul17),de patogenitate,pebazasensibilitiilabacteriofagiieventualpebazaunorcaracteremoleculare. Pentruinterpretarevomutilizadiferiteletabeledisponibilentratateledespecialitatesau recomandrileproductorilorncazulutilizriiunorsistemecomercialedediagnostic.Pentru tulpinileconsiderateafiimplicatepatogenicvomrealizastudiulsensibilitiilaantibioticei chimioterapice,deregulprinmetodedifuzimetrice(antibiogramadifuzimetricstandardizat, comparativ,Etest). Alteaspecteparticulareurmeazafiprezentatencapitoleleurmtoare.

29. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia coli. Urocultura.

Dupceoseriededatesugerauasemnareadinpunctdevederemolecularntrespeciile genurilorEscherichiaiSalmonella,cunotineleactualepledeazpentruogrupareaspeciilordin genurileEscherichiaiShigella.Cutoateacestea,vomprezentancontinuareseparatdiagnosticul delaboratorninfeciileprodusedemicroorganismeleaparinndgenurilorclasice. GenulEscherichiacuprindegermenicomensalicaresegsescubicvitar(nap,pesol,etc)iarla nivelulintestinuluiumanaurolnsintezaunorvitamine(simbioz).Suntbaciligramnegativimobili sauimobili,aerobifacultativanaerobi,lactozopozitivi.SpeciatipestereprezentatdeEscherichia coli.

CutoatecmajoritateatulpinilordeE.colisuntsaprofitesaucondiionatpatogene(fiind implicateninfeciioportunisteculocalizrinafaratractuluidigestiv,spreex.peritonite,colecistite, infeciialeplgilor,endometrite,pneumoniietc)existianumitetulpinidotatecucaractere patogeniceparticulare.DintreacestetipurideE.coli(patotipuri)sedistingtreigruprimai importante: tipuripatogeneimplicatenbolidiareiceacute(BDA) E.colienteroagregativ(EAggEC)implicatnapariiauneiBDAapoase,persistent,cu mucus,nspeciallasugari E.colienterohemoragic(EHEC),spreexempluserotipulO157:H7,careelaboreazdou citotoxineiesteimplicatnapariiauneiBDAapoas,carepoatedeveniseverisepoatensoi deocomplicaiegrav,sindromulhemoliticuremic E.colienteroinvaziv(EIEC)careelaboreazunasaumaimulteenteroxineproducndun sindromdizenteriform E.colienteropatogen(EPEC)caredetermindiareelacopilulmic,uneoridegravitate maxim(ex.diareemalignlanounscut) E.colienterotoxigen(ETEC)careelaboreazdouenterotoxine(termolabili termostabil)iproduceunsindromholeriform E.coliaderentdifuz(DAEC)careproducediareeapoas,persistent,lacopiinvrst de15ani tipuri(grupuri)patogeneimplicateninfeciialetractuluiurinar(ITU) tipulpatogenimplicatninfeciameningeallanounscut. Indiferentdelocalizareainfeciei,diagnosticuldelaboratormicrobiologicestebacteriologic, direct. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicninfeciileculocalizaredigestiv 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute.Produsulpatologicestereprezentatdeobiceidescaunuldiareicdaramputearecoltai lichiddevrstursauunanumitalimentincriminat.Materiilefecaleseexamineazmacroscopici setrimitctrelaboratoraacumammenionatncapitolulprecedent.ncontinuarevomdiscuta diagnosticuluneiinfeciiprodusdeEHEC(ex.O157:H7)dar,subliniemfaptulcnpractica medical,porninddelap.p.reprezentatdemateriilefecale,putemizolaoricemicroorganism implicatetiologicnBDA,dupcaz.Materiilefecalepotaveaaspecthemoragiciarlaexaminarea macroscopicap.p.putemobservaprezenaunorlambouridemucoasepitelial.Transportulse varealizaaacumammenionatncapitolulnr.28. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareapreparatuluinativ,ntre lamilamelremarcmprezenahematiilorileucocitelorPMN. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(vezicapitolulnr.28).n vedereaizolriiEHEC,pelngmediilemenionatencapitolulprecedentserecomandutilizarea mediuluiMacConkeycuDsorbitol,deoarecespredeosebiredemajoritateatulpinilordeE. coliEHECnufermenteazsorbitolul(saulfermenteaztardiv).nacestsens,coloniilesuspecte, repicate(fraatingemediul)nvedereaidentificriivorfinecolorate,cudimensiunide13mm,de reguldetipS(coloniilesorbitolpozitivevoraveaoculoareroz). 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor

caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativi. Caracteredecultur: ProduccoloniidetipScucaracterelemenionatemaisus. Caracterebiochimice(pentruEHECsevorexaminalanivelulcentruluidereferin procesareaunorculturincareesteprezentEHECnecesitmsurisuplimentaredesiguran): Fermenteazglucoza(cuproduceredegaz),suntlactozopozitivi,nufermenteaz(sau fermenteaztardiv)sorbitolul,nuproducH2S Potproduceindol,suntureazpozitivi,mobili(darexistitulpiniimobile)etc. Sepotfolosimediilemultitestconvenionale(TSI,MIU,MILF)saugaleriilemultitestAPI 10S,API20E,APIRapid20Esaualtevariante Altetestecepotfistudiatenscopulidentificriigermenilor: Testareacaracterelorantigenice:Agsomaticepotfiidentificateprinreaciideaglutinare saulatexaglutinare(sepotutilizaiserurimonovalenteantiO157irespectivantiH7)toxinelepot fiidentificateprintehnicidetipELISA,latexaglutinare,latexaglutinarepasivinversat (VETRPLA),sauprinseroneutralizareaefectuluicitotoxicpeceluleVero Testareacaracterelordepatogenitate:EHECproduceenterocolithemoragicletalla purcelsepoatestudiaefectulcitopaticpeceluleVero Testedebiologiemolecular(PCR,detectareagenelordepatogenitateporninddela p.p.saudelacoloniileizolatepeMacConkeycuDsorbitol). 5.Antibiogramaesterecomandatderegulnumaipentrusupraveghereaapariieifenomenului derezistenlaantibioticeichimioterapiceserealizeazprinmetodedifuzimetrice.

Urocultura
Tractulurinarestenmodnormalnecontaminat,nschimburetradistalpoateprezentaoflor microbianfoartevariat,fiindcontaminatcumicroorganismeproveninddinzonagenitalsaude lanivelulcolonului.Dintreacestemicroorganismeputemizoladelaniveluluretreidistalestafilococi coagulazonegativi,E.coli,Klebsiellaspp.,Proteusspp.,bacilidifteromorfi,enterococi,streptococi, neisseriisaprofite,Mycoplasmaspp.,Ureplasmaspp.sauFusobacteriumspp.Laacelainivelar puteafiidentificateitulpinideCandidaspp.,Clostridiumspp.,diferiicocigrampozitivisaugram negativianaerobi,lactobabili,mycobacteriinetuberculoase,stafilocociauriietc.Colonizarea microbianauretreidistaleexplicmotivulpentrucarenmareamajoritateacazurilorvom realizauroculturacantitativ. Cutoatecindiferentdegrijacucarevomrecoltap.p.(urina)acestavaficontaminat,prin apreciereacantitativanumruluideunitiformatoaredecoloniinurinaproasptrecoltat,din mijloculjetului,putemsprecizmdacpacientularesaunuinfecieurinar.Maimultestudiiau artatcatuncicndsedemonstreazprezenaa105bacterii/ml,aceastaindicoinfeciea tractuluiurinar(ITU)naproximativ80%dintrecazurintimpceovaloarede104bacterii/mlindic ITUnmaipuinde30%dintrecazuri. Datoritacestorrezultate,npracticamedicalseconsidercneaflmnsituaiauneiITU atuncicndnumruldebacterii/mlurineste105/ml. Cutoateacestea,dorimssubliniemcinterpretarearezultatuluinutrebuierealizatmecanic

ideciziafinalnceeacepriveteidentificareabacteriei,efectuareatestriisensibilitiila antibioticeirespectivredactareabuletinuluideanalizartrebuisfieluatavndnvedere aspectulmacroscopicalurinii(ex.purulent),rezultatulexamenuluimicroscopicalsedimentului urinar(ex.prezenadePMN),numruldeunitiformatoaredecolonii/mlurinielementeclinice (ex.disurie,miciunimaifrecvente,febr),cualtecuvintecolaborareantreclinicilaboratoreste esenial.Spreexemplu,ncazulunorelementesugestive,chiardacnumruldebacteriiestede 104/ml,putemluadeciziasrepetmuroculturaiarizolareaaceleiaibacteriipoateindica prezenaITU.Pedealtparte,izolareaapeste104unitiformatoare/mlncazulstafilococilorsau levuriloresteluatnconsiderareiarprezenanurinaListeriamonocytogeneslafemeile nsrcinatesauprezenanurinaSalmonellatyphisuntsemnificativeindiferentdenumrulUFC/ ml. Pentruasubliniancodatimportanaetapeiderecoltareitransportaurineiamintimfaptul curinareprezintunfoartebunmediudeculturpentrumajoritateabacteriilorcarepotcontamina p.p.iaroprobdeurincareareiniial(nmomentulrecoltrii)103bacterii/ml,dup2orela temperaturacamereivaconine105bacterii/ml. ClasificareaITUsepoatefacedupmaimultecriterii.ITUjoaseincludcistitadardupunii autoriiuretrita,prostatitaiepididimita.ITUnalteincludpielonefritaacut,necrozapapilar (complicaieapielonefriteiacutesaucarepoateapreanabsenainfeciei),abcesulrenalsau pielonefritacronic(dupuniiautori).Invaziatractuluiurinarpoateavealocpecale ascendent,limfaticsauhematogen. ExistoseriedefactoricarefavorizeazapariiaITU,dintrecareamintim:obstruciilecareduc lastazurinar(adenomsaucarcinomdeprostat,tumoridevecintate,stricturiuretralesauale coluluivezical,compresiuneuretralntimpulsarcinii,corpistrini,calculiurinari,cateterizare urinaretc),refluxulvezicoureteral,alifactorifuncionali. Agenietiologici Microorganismelemaifrecventimplicatenproducereauneiinfeciiatractuluiurinarsunt nordinedescresctoareE.coli,Klebsiellapneumoniae,Klebsiellaoxytoca,Enterobacter cloacae,Enterobacteraerogenes,Pseudomonasaeruginosa,Proteusmirabilis,Proteus vulgaris,Citrobacterfreundii,Citrobacterdiversus,Enterococcusfaecalis,stafilococii coagulaznegativi.Adenovirusurilepotdeterminacistitehemoragicelacopii.Mairar,nordine descresctoareetiologiaITUpoatefireprezentatdeStaphylococcusaureus,Acinetobacter calcoaceticus,streptococibhemoliticidingrupeleA,B,CsauG,Morganellamorgani,Providencia rettgeri,P.stuartii,Serratialiquefaciens,Serratiamarcescens,Candidaalbicans,Salmonella spp.,Corynebacteriumurealyticum.CuprivirelaE.coli,celmaifrecventmicroorganismimplicatn ITU,existanumitegrupuriuropatogene,spreex.O1,O2,O7etc.nmodcert,existdiferenen ceeacepriveteetiologiaITUpegrupedevrst,nfunciedesexsaulapacieniispitalizain comparaiecupacieniipentrucaresesolicituroculturanambulatoriu. Realizareauroculturii Recoltareaitransportulprodusuluipatologic nITUsepotrecoltaurin,snge(ex.npielonefritaacut)sauchiariLCR.ncontinuarevom discutadesprerecoltareaitransportulurinei. nafarderecomandrilegeneralemenionateanterio,trebuiessubliniemuneleaspecte particulare

ncazulncarenusepoaterecoltaprimaurindediminea,trebuieateptatpentru recoltare34oredupmiciune Recoltareaserealizeazdupsplareacuapispunaorganelorgenitaleia perineuluiexistrecomandrispecificepentrusexulfemininimasculinirespectivpentrucopilul mic Estepreferabilcarecoltareasaiblocntrunspaiucorespunztornapropierede laboratoriarpersonalulmedicaltrebuiesexpliceieventualsasisterecoltarea Estecontraindicatrecoltareaurineiladomiciliu(potexistaeroriderecoltareiar prelungireatimpuluidetransportvaconducelamultiplicareabacteriilor,aacumammenionatmai sus)duprecoltare,ncazulncareurinanuesteprelucratimediat(sauncelmult30deminute duprecoltare),p.p.trebuiemeninutlatemperaturafrigideruluiiartransportultrebuierealizatla +4C Deregulserecolteazurinadinmijloculjetuluidupsplareaorganelorgenitaleia perineului,prinmiciuneseelimincirca100mlurin(ndeprtndastfeloparteagermenilordela niveluluretreidistale)iabiaapoiserecolteaz2050ml(preferabil50ml)urinnrecipientulsteril, dupcaremiciuneacontinu Existialtetehniciderecoltare,neinvazivesauinvazive(puncieiaspiraie suprapubian,cateterizareuretral,curiscurilerespective). Examinareamacroscopicimicroscopicaurinei Realizminiialexamenulmacroscopicp.p.poatefitulbure,opalescent,poateprezentaun anumitmirosetc.nvedereaexamenuluimicroscopicalurineiomogenizmurinaprinrsturnare, de23ori.Punemopicturdeurinpelam,acoperimcuolameliexaminmcumicroscopul cuimersie(saumicroscopulcucontrastdefaz).ncazulncareidentificmprezenaacelpuin uneibacteriipefiecarecmp,nfiecaredintre5cmpurisuccesive,putemcuobunaproximaie sconsidermcavemobacteriuriede105bacterii/ml.Alternativsepoateutilizapreparatul coloratGram.Estenecesarsapreciemconcomitentiprezenapiuriei(peste10leucocite/ mm3deurin).Aufostimaginateoseriedealtetestepentruapreciereapiurieiibacteriuriei,spre exemplutestulGriess(detectareanitriilornurin),detectareaesterazeileucocitare,teste bioluminiscenteetc.Piuriaibacteriuriatrebuieinterpretatencontextulclinic. Examenulsedimentuluiurinarpermitevizualizareadeceluleepiteliale(malpighiene,vezicale, uretraleetc),celulesanguine(leucocite,hematii),cilindriiurinari(hialini,leucocitari,eritrocitari, epiteliali,granularietc),cristaleurinare,levuri(eventualnmugurite,cublastoconidii),Trichomonas vaginalisetcexamenulsedimentuluiurinarestefoarteutilitrebuierealizatdefiecaredat.
Cultivareaurinei

nmodobinuit,pentrucultivareputemutiliza34mediidiferite.Dinmotivedeeconomieam puteansmnaojumtatedeplaccumediuMacConkey(frcristalviolet),ojumtatedeplac cugelozsngeicteunsectordeplaccumediuagarteluritirespectivagarcueozini albastrudemetilen(EMB)ncazulncareexamenulmicroscopicalurineiestepozitiv.Dac examenulmicroscopicestenegativ,nsmnmdoarojumtatedeplacPetricumediu MacConkey. OvariantdensmnarepentrumediileMacConkeyigelozsngeesteutilizareauneianse calibratede1lcuajutorulcreiaprelevmurinprinatingereasuprafeeip.p.dupomogenizare. nsmnminiialunstriupecentruljumtiideplacdupcarentindemp.p.nstriuriparalele,

perpendicularepeprimulstriu.nfinalfrsterilizmansantindemp.pnstriuriparalelenunghide 45fadestriurileprecedente.Dupoincubarede1824orela3537C,nmulindcu1000 numruldeUFCdezvoltate,putemapreciacareestenumruldebacterii/mldeurin. Frecventesteutilizatnsmnareaurineidupdiluare(ex.1/100)cuajutorulpipeteigradate. nsmnmdeex.peoplaccumediuMacConkey0,1mldeurindiluat1/100,incubmn condiiilecunoscuteidupapariiacoloniilorcalculmnumruldebacterii/mlprinnmulirea numruluideUFCinversuldiluieinversulvolumuluinsmnat. Interpretarearezultateloruroculturiicantitative Izolareauneibacteriicuoconcentraiedepeste105/mldeurinconfirmITUlabrbat saulafemeie(cusimptomecaracteristice)ncazulcpacientaesteasimtomatic,certificareaITU estedatdeizolareaaceleaibacteriinadouaprobdeurin Izolareaadoubacteriidiferite,fiecarecuoconcentraiedepeste105/mldeurin, impunerepetarearecoltriiinsmnriincazulncarerezultatulestesimilaripentruadoua probdeurinesteposibilITUmixt(ncazcontraresteofoarteprobabilcontaminare) Izolareaatreibacteriidiferite,chiarincazulncareconcentraiilepentrufiecaren partedepesc105/mldeurin,impunerepetareaanalizeiextremdeprobabilestevorbadeo contaminaresaudeunp.p.recoltatcumaimulttimpnurmimeninutlatemperaturacamereii nulafrigider Izolareauneibacteriicuoconcentraiede104/mldeurinconducelarecomandarea repetriianalizei(existiuneleexcepii,ncarerezultatulesteconsideratpozitiv,spreex.pentru levurinconcentraiedepeste104/mldeurin,stafilocociicoagulazonegativinconcentraiede peste5104/mldeurinetc) LipsamultiplicriibacterienesaudezvoltareadeUFCnconcentraiede103/mldeurin reprezintouroculturnegativ Dorimssubliniemdinnoucrezultatulmicrobiologictrebuiesfieanalizatncontextul clinicicorelatcurezultatulmicroscopieiiarncazulanumitorbacterii(ex.Salmonellatyphi) rezultatulestepozitivindiferentdeconcentraiaUFC/mldeurin. ncazuluneiuroculturipozitive,bacteriaizolatseidentific(pebazacaracterelor morfotinctoriale,decultur,biochimice,altecaractere)isetesteazsensibilitatealaantibioticei chimioterapice,deregulprinmetodadifuzimetric(vezicapitolul14). ExistoseriedencercripentruoptimizareadiagnosticuluiITU,inclusivabordareaunortehnici miniaturizate.DintreacesteavomamintimetodaimaginatnInstitutuldeboliinfecioaseMatei Bal(prof.FlorinCruntu),metodaUrilineetc.Spreexempluultimadintremetodeutilizeazo lamdeplasticacoperitpeambelepricumediudecultur,protejatntruntubdeplastic. Principiu: MediulCLEDdepeprimapartealamei(CysteineLactoseElectrolyteDeficientagar)are culoareverdeipermitenumrareacoloniilorbacteriene(indirectanumruluideUFC/mlurin)i identificareaprezumtiv.ConcentraiasczutdeelectroliiinhibinvaziaProteusspp.Mediul MacConkeyfrcristalvioletdepeadouapartealameiareculoarerozinhibmajoritatea bacteriilorgrampozitive. Tehnicadelucru: Deurubmcapaculiextragemlamafrsatingemsuprafaaagarului.Imersmlaman probadeurinrecoltat(dacurinanuestesuficientcantitativ,repartizmp.p.pecele2priale

lameicuajutoruluneipipetePasteur).ndeprtmexcesuldeurinpeohrtiedefiltrucurati punemlalocndispozitivlamansmnat.Incubmnpoziiedreapt,timpde1824orela 3537C.Adouazicitimrezultatele,comparndnumruldecoloniiaprutepemediulCLEDcu modelulproductorului. Interpretare: ncazulncarenumruldeUFC/mlestemaimarede105realizmtestesuplimentarepentru identificareirespectivantibiograma.Alteelementeprivindinterpretareaaufostprezentateanterior. Controldecalitate: Pregtimosuspensiebacteriannsoluiesalinfiziologicsterilcu105106bacteriipe mldinfiecaredintretulpiniledereferin StaphylococcusaureusATCC25923 EscherichiacoliATCC25922 ProteusmirabilisATCC12453 InoculmsuspensiileastfelpregtitepesuprafaamediilordeculturUriline,iardup 1824oreincubarecitimiinterpretmrezultatele Staphylococcusaureus:aparcoloniidoarpemediulCLED.Fermentarealactozeieste indicatdeprezenaculoriigalbenenjurulcoloniilordezvoltate. Escherichiacoli:aparcoloniigalbenepeCLEDicoloniirozpeMacConkey. Proteusmirabilis:aparcoloniitranslucideiarculoareaCLEDestealbastrpeMac Conkeyaparcoloniiincolore.

30. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Shigella

GenulShigellaartrebuisfacparteconformstudiilordebiologiemoleculardintrungencare includeiEscherichiaspp.,genulEscherichiaShigella.Cutoateacestea,nmomentulactualeste acceptattratareaseparatacelordougenurinrudite.Pebazastructuriiantigeniceaufost difereniatepatrusubgrupe(AD)respectivShigelladysenteriae(13serotipuri),S.flexneri(6 serotipuricaresepotsubdivizansubserotipuri),S.boydii(18serotipuri)iS.sonnei(1serotipcu 2fazesauvariante,respectivRiS). GenulShigellaincludebaciligramnegativi,imobili,cudimensiunide0,50,8/23, nesporulai,necapsulai,aerobifacultativanaerobi,glucozopozitivifrproduceredegazoxidazo negativi,lactozonegativi.Subgrupelesepotdifereniadeex.pebazafermentriimanitei(subgrupul Aestemanitonegativ).CrescpemediisimpleiproduccoloniidetipSn24deore. MicroorganismeledingenulShigellasuntpatogeneprinmultiplicareiinvazivitate.ncazul serotipului1dinsubgrupulA(Sh.shiga)esteimplicatitoxigeneza.Exotoxinashigaafecteaz

attintestinulctisistemulnervoscentral(putndconducelaapariiaunorfenomenede meningismsauchiarpierdereastriidecontien,pnlacom).Fadeanimaleledeexperien areefectletal. InfeciilecuShigellaspp.suntderegullimitatelanivelultractuluiintestinal.Dizenteriapoate apreadupingestiaanumai10100debacterii,careselocalizeaz,semultipliciinvadeaz epiteliulintestinal(potapreaabceselanivelulpereteluiintestinuluigros,lanivelulileonului terminal,abcesecareevolueazspreulceraie,necroz,hemoragie).Dupoperioaddeincubaie decirca25zile,ncazuluneidizenteriitipiceaparbruscfebr,diareeapoas,dureriabdominale intense.Ulteriorseeliminscaunefoartenumeroase(2040/zi),nefecaloide,cumucus,puroii snge,nsoitedecoliciintestinaleitenesmerectale.Stareageneralsenrutete(maigravn cazuluneiinfeciiprodusedeSh.shiga).nlipsatratamentuluicorespunztor(nspecialnlipsa reechilibrriihidroelectrolitice)evoluiapoatefifatal.nafardedizenterie,Shigellaspp.poate produceitoxiinfeciialimentaredetipinfecios. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicestebacteriologic(direct)itrebuiefcutdeurgen datoritimplicaiilorposibilealeuneidizenterii. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatdemateriifecale,darsarputea recoltailichiddevrstur.Lanceputulboliiestemaiuorsizolmbacteriapatogen, deoareceiniialseelimincirca103109bacterii/gramdemateriifecale.Dinpunctde vederemacroscopicmateriilefecalepotfincantitatemic,coninndmucus,puroiisnge (uneorisngelenuestevizibilmacroscopic).Recomandmrecoltareaicultivareanspeciala fragmentelorcareconinmucus,puroiisnge.Transportultrebuiesfierealizatrapid,dareste preferabilnsmnarealapatulbolnavului.Dacaceastrecomandarenupoatefiurmat, recomandmfolosireaunuimediudetransport,mediulbacteriostaticCaryBlair.Oaltvariantde recoltareposibil(deex.ncazuriatipicesaupentrucontrolulstriidepurttor)estereprezentat deutilizareasondeiNelatonintrodusncolonulsigmoid(1015cmlacopilsau1520cmlaadult) aspirndp.p.cuajutoruluneiseringi.Materiilefecalesevorsuspensionansoluieclorurosodic saunmediulCaryBlair.Existiposibilitateadearecoltap.p.atuncicndsepresupune diagnosticuldizenterieibacterieneprinrectosigmoidoscopie. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunuipreparat proasptntrelamilamel(nuefectumfrotiuridinacesttipdeprodusulpatologic,ncazuln caresuspectmoinfeciecuShigellaspp.).Preparatulseexamineazlamicroscopulopticcu obiectivul40.EvideniereaanumeroasePMNvinensprijinulstabiliriimecanismuluiboliidiareice, iarunprocentdepeste75%PMNnsoitdeprezenahematiilorestesugestivpentrudizenteria bacterian.Anumiiautorirecomandutilizareaimunofluoresceneidirecteexamenulestecostisitor nspecialdatoritexisteneinumeroaselorserotipuri. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Sevorutilizamediiledeculturrecomandate,prezentatencapitolul28.Shigellasedezvolt pemediileslabimoderatselectiveinusemultiplicpemediilenaltselective.ncazulapariiei unorcoloniilactozonegative,repicm35coloniiizolatepemediilemultitest(TSI,MIU,MILF)sau procedmconformprotocoluluidelucrupentrugaleriiletipAPI.

4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativicucudimensiunide0,50,8m/23m Caracteredecultur: produccoloniidetipS,lactozonegative,semitransparente,cudiametrulde12mmpe MacConkeysauADCL(S.sonneipoateproducecoloniicaredevinrozdeoarecepoatefermenta tardiv,lactoza)iroiipeXLD Caracterebiochimice: sepotinvestigaanalizndrezultateleobinutepemediilemultitestsaupegaleriileAPI caracterelebiochimicesuntutileindifereniereasubgrupelorgenului microorganismeledingenulShigellasuntglucozopozitive,frproduceredegaz, lactozonegative,nuproducH2S,imobile,ureaznegative,indolnegative potfinecesaretestebiochimicesuplimentare Caractereantigenice: seutilizeazseruriimunepolivalentepentrusubgrupsauseruriimunespecificedetip, prinreaciideaglutinarepelam,conformunorschemestabilite ncazulncareotulpinizolatareuncomportamentbiochimicsugestivdarreaciade aglutinareestenegativ,trebuiesrealizmosuspensie(destuldedens)dinrespectivatulpin, pecareomeninemtimpde3060minutelaotemperaturde100Ciulteriorrepetmreaciade aglutinare Testareasensibilitiilabacteriofagi(lizotipia)sepoateutilizanstudiiepidemiologice saunscopdecercetare,fiindrezervatlaboratoarelordereferinschemeledelizotipieaufost utilizatenspecialpentruS.flexneri2aiS.sonnei Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin: testebiochimicesuplimentare(biotipie) bacteriocinotipie(ex.pentruS.sonnei) rezistotipie(tipareprinpaternulrezisteneilaantibiotice),utilnscopepidemiologic testulSereny(producereacheratoconjunctiviteilacobai)repicmcoloniasuspectpe geloznclinatiardup8ore,introducemoansdecultursubpleoapaunuicobaidup1224 orencazuluneireaciipozitiveaparecongestieconjunctival,secreiepurulentiopacifierea corneeicuaccentuareaacestorfenomeneievoluiesprecheratoconjunctivit(testulpoatefipozitiv incazulunortulpinideEscherichiacoli) tehnicialebiologieimoleculare(stabilireaprofiluluiplasmidic,ribotipia,sondeleADN etc). 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapice)serealizeazprin metodadifuzimetricstandardizat,nspecialnscopulsupravegheriiapariieiunortulpinirezistente lamedicamenteleantimicrobienedaripentrustabilireatratamentuluiantimicrobiancorespunztor.

31. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Salmonella.

Hemocultura.
ExistmaimulteclasificripentrumicroorganismelecareaparingenuluiSalmonella.Una dintreclasificrileacceptate(Ewing)grupeazgenuln3speciiianumeS.typhi(patogendoar pentruom),S.choleraesuis(patogenlaporc,ocazionalilaom)iS.enterica(produceboli diareicelaomilaanimal,cuaproximativ2000deserotipuri).Estencbinecunoscutschemade identificareserologic(KaufmannWhite)caresubmpartegenulSalmonellangrupecareinclud foartemultespecii,spreex.grupulA(S.paratyphiA),grupulB(S.paratyphiB,S.typhimurium), grupulC(S.paratyphiC),grupulD(S.typhi,S.enteritidis)etc. GenulSalmonellaincludebaciligramnegativi,cudimensiunide24mm/0,40,6mm,mobili cuciliperitrichi(cuexcepiaS.galinarumpullorum),necapsulai,nesporulai,glucozofermentativi (cuproduceredegazcuexcepiaS.typhi),nufermenteazlactoza,producH2S(existiexcepii) iutilizeazcitratulcaunicsursdecarbon. InfeciileprodusedemicroorganismelecareaparingenuluiSalmonellasepotmprin salmonelozeminore(enterocolite,toxiinfeciialimentare)isalmonelozemajore(febratifoid,febre enterale). Enterocolita(gastroenterita,toxiinfeciaalimentardetipinfecios)aparedupingestiaa 10 108salmonele.Febratifoid(febraenteral)poateapreadupingerareaacirca103salmonele. Febratifoidesteoboalgravcarenlipsatratamentuluipoateconduceladeces.S.typhitrece priniprintreceluleleepitelialedelanivelulanseiileocecale,semultiplicactivnsubmucoasi estefagocitatdemacrofageundesupravieuieteicontinussemultiplice.Microorganismele trecapoinganglioniimezenterici,ncanalultoraciciconduclaapariiauneiprimebacteriemii urmatdeinvadareaaltororganeiformaiunilimfatice.Multiplicareaimportant,nspeciallanivelul organelorcusistemreticuloendotelialbinereprezentat(ficat,splin),esteurmatdeoadoua bacteriemiemasivideeliminareaprinbili/sauurin.Lasfritulprimeisptmnide boal,S.typhiseelimindinfoliculiiintestinaliiprinbilnmateriilefecale,excreia prelungindusemulttimpnconvalescen.Potapreaangiocolit,colecistitbolnavulpoatedeveni purttor(ex.lanivelulveziculeibiliare)dupvindecare. ncazulafeciunilorstrictdigestive,diagnosticuldelaboratormicrobiologicestebacteriologic, direct.ncazulafeciunilorsistemice,diagnosticulpoatefibacteriologici/sauserologic. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicninfeciileculocalizaredigestiv Diagnosticulbacteriologic(direct)cuprindeetapelecunoscute. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute.Produsulpatologicestereprezentatdeobiceidemateriilefecaledaramputearecolta ilichiddevrstur,unanumitalimentincriminatetc.Materiilefecaleseexamineazmacroscopic isetrimitctrelaboratoraacumammenionatncapitolul28. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareapreparatuluinativ,ntre lamilamelputemremarcaprezenagranulocitelormononucleare. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,careurmeazafiidentificat(vezicapitolele 910i28).Pentruizolareaiidentificareaagentuluipatogenp.p.estensmnatpeunmediu
5

lichiddembogire(bulionselenit)ipedoumediigelozateselectivodifereniale(MacConkeyi ADCL/XLD).Dupoincubarede1824orela3537C,pemediilesolidepotapreacolonii bacterienesuspecte(lactozonegative)dincareobinemculturapurnscopulidentificriiistabilirii sensibilitiilaantibiotice.Pentruacreteansadepistriiagentuluicauzal,culturade1824oren bulionselenitvafitrecutpemediilesolide(peMacConkeyiADCL/XLD). 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicizolatnculturpursevarealizapebaza maimultorcaractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativi. Caracteredecultur: ProduccoloniidetipS,lactozonegative,cudiametrulde13mm(necoloratei semitransparentepeMacConkeynecoloratedarcucentrulnegrupeADCLroii, semitransparente,cucentrulnegrupeXLD).ncazulncareafostfolositimediulWilsonBlair (foarteselectiv,carenuincludelactoz)coloniilesuntnegre,cumarginineregulateihaloumetalic. Caracterebiochimiceidemobilitate: Fermenteazglucoza(cuproduceredegaz),suntlactozonegativi,producH2S,(exisi excepii)iutilizeazcitratulcaunicsursdecarbon. Nuproducindol,suntureazpozitivi,mobili,produclizindecarboxilazi ornitindecarboxilazetc. Pentrupunereanevidenacaracterelorbiochimicesepotfolosimediilemultitest convenionale(TSI,MIU,MILF)saugaleriilemultitest(API10S,API20E,APIRapid20Esaualte variante). Caractereantigenice: seutilizeazseruriimunespecifice,nschemecarefolosesciniialAcantiOiulterior, nfunciederezultatulobinut,AcantiH,prinreaciideaglutinarepelamconformschemei KauffmannWhite(existtabeleischemecaretrebuierespectate) ncazulncareotulpinizolatareuncomportamentbiochimicsugestivdarreaciade aglutinareestenegativ,trebuiesrealizmosuspensie(destuldedens)dinrespectivatulpin, pecareomeninemtimpde3060minutelaotemperaturde100Ciulteriorrepetmreaciade aglutinare. Altetestecepotfirealizatenscopulidentificriigermenilor,deregullanivelulcentrului dereferin schemesuplimentarepentrutestareacaracterelorantigenice(serotipie) testesuplimentarebiochimice(biotipie) testeprivindsensibilitatealabacteriofagispecifici(lizotipie) testedebiologiemolecular(determinareaprofiluluiplasmidic,ribotipia,studiulunor secvenespecificelanivelcromozomialetc). 5.Antibiogramaesterecomandatderegulnumaincazulpacienilorcuvrsteextremesau pentrusupraveghereaapariieifenomenuluiderezistenlaantibioticeichimioterapicese realizeazprinmetodedifuzimetrice. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicnfebreleenteraleestebacteriologici/sauserologic. Diagnosticuldefinitiv(cert)estereprezentatdeizolareaiidentificareaS.typhinp.p. Diagnosticulbacteriologic,directrespectetapelecunoscutealeacestuitipdediagnostic, cuanumiteparticulariti.Multedinaspecteaufostprezentateanterior.

Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatnprimasptmndesnge,ulterior putemrecoltamateriifecale,urin,lichidbiliar,mduvhematogenetc.Hemoculturavafi discutatnceleceurmeaz.ncazulncarep.p.estereprezentatdemateriifecale,respectm ceeaceamprezentatmaisus,cuoseriedesublinieri: SuntnstudiumetodedeidentificareaprezeneiS.typhi,directnp.p.(ex.materiifecale)prin latexaglutinareiPCR ColoniiledeS.typhipotsnuprezintecentruldeculoareneagrpeADCLsauXLD. S.typhingeneralnuproducegazdinglucoziarH2Spoatefiprodusncantitimiciitardiv nufolosetecitratulcaunicsursdecarboniesteornitindecarboxilaznegativ. PentruidentificareaAgOpoatefinecesaroinactivareprealabil(termic,folosindo substanacidsauaceton).PentruidentificareaAgHpoatefinecesarinactivareacu formaldehid.PrezenaAgVipoatecreaproblemenceeacepriveteidentificareaAgO. Deilizotipiaesteometodlaborioas,demulteorisedovedetesuperioardinpunctulde vederealrezultatelorobinutencomparaieinclusivcumetodealebiologieimoleculare. Testareasensibilitiilaantibioticeichimioterapiceesterecomandatpentrufiecaretulpin deS.typhiizolat. Diagnosticulserologic Uniiautoriconsidercniciunuldintretesteleutilizabilendiagnosticulserologicnueste suficientdespecific,sensibilirapid.Diagnosticulserologicserealizeazrespectndprincipiile generalealeacestuitipdediagnostic.ReaciaWidalafostimaginatnfinalulsecoluluialIXleai standardizatlamijloculsecoluluiXX.SerodiagnosticulWidal,folosindculturiviideS.typhinuse maipracticastzi.Ceamaicunoscutmetodutilizabilactualesteanalizasericcantitativ, realizattotprintehnicaaglutinriintuburi.Utilizmseriiseparatedetuburi,cteoseriepentru fiecareAgcunoscutfolosit,seruldecercetatfiinddiluatcorespunztorprotocoluluidelucru.Atunci cndpresupunemofebrtifoidsauparatifoidutilizmspreex.6seriidetuburi,cuAgcunoscute iinactivate,pentruaevideniaAcantiO(TOS.typhi,AOS.paratyphiA,BOS.paratyphiB), iantiH(dS.typhi,aS.paratyphiA,bS.paratyphiB).Duprealizareadiluiilor,incubm tuburilepentruAcantiOtimpde1820orela52Curmatde10minutelatemperaturacamereiiar tuburilepentruAcantiHtimpde2orela52Curmatde10minutelatemperaturacamereiicitim reacia.Untitrude1/250ncazulAcantiOirespectiv1/2500ncazulAcantiHarputeafi sugestiv.Cretereade4oriatitrului,la2determinrisuccesive(intervalde710zile)poate confirmasuspiciuneadediagnostic.Lapersoanelevaccinatenantecedentediagnosticulserologic nupoatefiutilizat(rezultatelenusuntinterpretabile)iestestrictnecesarizolareanculturiaS. typhi. Attncazulbolnavilor,darmaialesncazulconvalesceniloripurttorilorafostrecomandat reaciadeaglutinarentuburipentruidentificareaprezeneiititruluiAcantiVi.Seconsidercun titrudepeste1/40poateficonsideratsugestiv.

Hemocultura
Arborelecirculatorestenmodnormalsteril. Bacteriemia/fungemiareprezintprezenatranzitorieideregulintermitentabacteriilor/

fungilorntorentulcirculator.Obacteriemie/fungemiesepoatensoidecretereatemperaturiii/ saufrisonprecumidealtesemnesausimptoame.Dintresituaiilecarepotconducelaapariia uneibacteriemiiputemaminti:realizareauneiextraciidentare,periajulmaienergicaldinilor folosindoperiuneadecvat(preadur)precumimulteactemedicalesaumedicochirurgicale invaziverealizateladiferitenivelurianatomice(cateterismeetc). Bacteriemia/fungemiansoescinfeciilegeneralizatecubacterii/fungi.Existomare varietatedemicroorganismecapabilesproducinfeciigeneralizate(bacteriiaerobeianaerobe, fungi,virusuri,parazii).Trebuiensmenionatc,destuldefrecvent,ohemoculturpozitivnu indicdefaptagentuletiologicalinfecieiciocontaminaresurvenitpeparcursuldiagnosticului microbiologic.Dintreageniicontaminanintlniimaifrecventputemaminti:Staphylococcus epidermidis,S.hominis,Micrococcusluteus,Corynebacteriumspp.,Brevibacterium epidermidis,Propionebacteriumacnes,Acinetobactercalcoaceticus,streptocociinonhemolitici etc.Esteimportantutilizareanoiunilordemicrobiologiecliniccaretrebuiefoartebine cunoscutedectremediculmicrobiologncolaborarecurestulmembrilorechipeicomplexe,pentru stabilireanmodcorespunztoraetiologieiinfecioaseiatitudiniideurmat. Avndnvederecelemenionatemaisus,dorimssubliniemialtedoudintreaspectele importantedecaretrebuiesseinseamanrealizareauneihemoculturi: momentulrecoltriisngelui volumuldesngerecoltat. Cuprivirelaprimulaspectestedereinutcntotdeaunaserecomandrecoltareaaminim2 probedesnge,nscelmaifrecventsuntrecoltate3probedesnge,nmomentediferite,pe parcursula24deore.nanumitecazuri(deex.nendocarditabacteriansubacut),bacteriemia fiindcontinu,suntsuficiente2hemoculturi/24ore.Pedealtparte,ncazulncarepresupunem cagentuletiologicpoatefacepartedinfloranormalvomrecoltaminim3probepentru hemocultur.nceleceurmeazoslistmctevadinexempleleposibile,nceeaceprivete momentulrecoltriisngeluiinumruldehemoculturirecomandate: endocarditacutrecoltm3hemoculturidin3sediidiferite,peparcursula12ore endocarditsubacutrecoltmminim2hemoculturidin2sediidiferite(veziimai sus)launintervalmaimarede15minute sepsisrecoltm3hemoculturidinsediidiferite,peparcursula10minute(idealarfi, pentrutoatecazurilemenionate,srecoltmsngelecucirca30minutenaintedevrfulfebril, acestmomentarcoincidecuceamaimareconcentraiedemicroorganismentorentulcirculator, daracestmomentestedificildeprecizat) febrdeoriginenecunoscutrecoltm23hemoculturi,dinsediidiferite,launinterval detimpde4560minuteetc. nceeaceprivetealdoileaaspect,avndnvederefaptulcderegulncursulbacteriemiilor/ fungemiilornumruldeunitiformatoaredecolonii/mldesngeestedestulderedus,trebuies recoltmunvolumdesngeadecvat(pentrufiecarehemoculturnparte).Astfel,vomrecoltacirca 20mldesngencazuladulilori15mldesngencazulnounscuilor,sugariloricopiilormici (deoarecenumruldeUFC/mlpoatefidecirca3orimaimarelaacestegrupedevrst). Atuncicndestenecesarrealizareauneihemoculturi(defaptaunuisetdehemoculturi) estenecesarsnegndimilaurmtoareleaspecte: celmaiadeseahemoculturiletrebuierealizatenurgen

sngele,fiindunprodusbiologicnmodnormalsteril,vomizolacelmaiadeseaun singuragentinfecios(darexistiposibilitateaunorasocieri) dintreageniietiologicicusemnificaieclinicizolaimaifrecventprinhemocultur,n ordinedescrescndafrecveneiputemaminti:Staphylococcusaureus,diferite enterobacterii,Pseudomonasaeruginosa,streptococihemolitici(inclusivpneumococul), enterococi,Haemophilusinfluenzae(tipb),Neisseriameningitidis,germenianaerobi(Bacteroides fragilis,Fusobacteriumspp.,Peptostreptococcusspp.,Clostridiumperfringensetc),stafilococi coagulazonegativi,Listeriamonocytogenes,Leptospiraspp.,Brucellaspp.,Candida spp.,Cryptococcusneoformans,Histoplasmacapsulatum,Aspergillusspp.etc existanumiteparticularitinceeacepriveteetiologiainfeciilorgeneralizatenfuncie devrstapacienilor,poartadeintrareposibil,focarulinfeciosprincipal,stareadinpunctulde vederealaprrii(specificeinespecifice)agazdeirespectiveetc nsngeexistoseriedefactoriantimicrobieniacroraciunetrebuiepectposibil diminuat(aceastaserealizeazpedeoparteprindiluarea1/10asngeluicultivatnraportcu volumulmediuluideculturdarexistioseriedesubstanechimicecarepotfiutilizatenacelai scop,spreex.polianetolsulfonatuldesodiuareattefectanticoagulantctideneutralizarea unorfactoriantimicrobieni) mediiledeculturicondiiiledeincubaretrebuiealesnaafelnctspermit dezvoltareaageniloretiologiciprobabili asigurareacalitiimediilordeculturvaincludeattcontrolulsterilitiifiecruilotcti controluleficieneiacestora(prininoculareamediilorcutulpinidereferin,decolecie). Pentrurecoltareasngeluitrebuierespectatecondiiileimpuserecoltriioricruitipdep.p. Subliniemnsimportanarespectriicustricteearegulilordeprelevareasepticirespectiva recoltriisngeluinaintedeadministrareaoricruitratamentantimicrobian.Orictdeurgentarfi consideratctrebuienceputterapiasepoatetemporizapnserealizeazrecoltareasngelui pentruhemocultur,ceeacenastfeldesituaiiarnecesitaunintervaldetimpdenumai1015 minute. Esterecomandatcarecoltareasfieurmatdensmnareadirectpemediuldecultur,la patulbolnavului,spreexempluntrunsistemnchisderecoltareainsmnareaacumafost realizatdeProf.Dr.MateiBal.Utilizareasistemelorcuvacuumesterelativrecentnaranoastr nSUAafostutilizatncnaintede1974.Altfelspus,recoltareaartrebuisfieurmatimediatde nsmnare,framaiexistaoetapdetransport.Dacaceastrecomandarenupoatefiurmat amputeafolosiuntubcareconine1mldintrosoluie0,250,50%depolianetolsulfonatdesodiun carerealizmrecoltareasngeluiipecareltransmitemimediatctrelaboratorpentru nsmnareapemediidecultur. Mediiledecultursuntmediilichide,mbogite(ex.bulioninfuziedecordcreierpentruaerobi irespectivbulionColumbiacucisteinpentruanaerobi)condiionatenflacoanecorespunztoare cantitiidesngepecaretrebuiesorecoltm.Pentrubacteriilecumultiplicarelenteste recomandatutilizareamediuluibifazic(mediusolidificatnpant,deex.gelozchocolatplus mediullichidbuliontripticazdinsoia).nfinalulprezentriivomdiscutaidespresistemele automatepentruhemocultur. ncazulncarerecoltareaafostrealizatsimultanndouflacoanepentruhemocultur,unul vafiincubatnaerobioziarcellaltnanaerobioz.Pentruunelemicroorganisme(ex.Brucella

spp.)estenecesarincubareanatmosferde510%CO2.Temperaturadeincubareestecelmai frecvent3537C. Examinareaflacoanelordehemoculturserealizeazde2ori/zinprimele3zile,apoizilnic pentruminim7zile(nanumitesituaiiflacoanelepotfiincubatetimpdemaimultesptmni). Examinareaofacemmacroscopicurmrindoseriedeaspectecarearputeassemnifice dezvoltareamicrobian(tulburareamediuluimaimultsaumaipuinuniform,apariiauneipeliculela suprafaamediuluilichid,apariiaunuidepozitpestratuldehematiidinzonadeclivaflaconului, apariiaunorbuledegaz,apariiaunorcoloniipemediulsolidncazulncareamutilizatmediul bifazicetc).Dinpunctdevederemicroscopic,manipulndasepticflacoaneledehemoculturputem realizafrotiuripecarelecolormGram. ncazulapariieiunormodificriprecumceledescrisemaisusdariatuncicndacesteanu apar(trecerioarbe)vomrealizasubcultivripemediidecultursolide(deex.gelozchocolat). Prinutilizareamediuluibifazicsubcultivareaserealizeazuorifrrisculcontaminrii,prin simplanclinareaaflaconuluiiscldareapanteicumediuldecultursolid). Dupobinereaculturiipuretrecemlaidentificareaagentuluietiologicistabilireasensibilitiila antibioticeichimioterapiceaacestuia.nvedereatestriisensibilitiilaantibioticeputemutiliza cainoculbulionuldehemocultur,darrezultateleobinutevorficonfirmateprinantibiograma difuzimetricstandardizatporninddelacoloniileizolate(culturapur). nmomentuldefaexistnumeroasesistemeautomateutilizatepentruhemocultur(BacT/ Alert,Isolator,BACTEC,SeptiChek,Vitaletc). Spreexemplu,sistemulBacT/ALERTreprezintuninstrumentautomatpentrudetectarea multiplicriimicrobiene,capabilsincubeze,sagiteismonitorizezecontinuu(pebazde reflectometrie)aerobianaerobprelevatedelapacienisuspecidebacteriemie/fungemie. Instrumentulprezint: unmoduldecontrolcareincludeunecrancepermiteoperatoruluisintervin(prinatingerea cudegetul)nalegereaopiunilordencrcareidescrcareaflacoanelorintroduse, unmoduldeincubarecepoateprelucra120pnla240flacoanensmnate, posibilitatearealizriiautomateacontroluluidecalitatealcelulelorncaresuntintroduse flacoanele(nefiindnecesarinterveniaoperatorului). Intervaluloptimdefuncionarealinstrumentuluiestesituatntre+5oi45oC.Flacoanele introduseninstrumentsuntrecunoscutedeacestacuajutorulunuicititordecoddebare(codulse aflpepartealateralaflaconului).Flacoaneleiinstrumentulsuntprodusenconformitatecu standardeleinternaionaledecalitatenvigoare(ISO9001,FDAiQualitySystemRegulations). Flacoaneledeculturconinmediudeculturlichid(bulion),carepermitmultiplicareamajoritii speciilorbacterieneprecumiafungilor.FiecareflaconconineunsenzorLES(senzoremulsie lichid),cedetecteazproducereadeCO2,caindicatoralmultiplicriimicrobiene. Existmaimultetipurideflacoane,pentruincubarenaerobioz,anaerobioz,pentruaduli saucopii,pentrupacienilacarenusauadministratmedicamenteantimicrobieneanteriorrecoltrii (variantastrictrecomandat)sauchiaripentrupacieniaflaisubtratamentantibiotic. Citireaseefectueazautomatlafiecare10minute,rezultndomediede144citiri/zi,prin reflectometriecuafiajpemonitor,semnalluminossausonor.ncazulunuirezultatpozitiv,flaconul respectivesteanalizatprinmetodealemicrobiologieiclasicesaumodernenvedereaidentificrii specieimicrobieneistabiliriisensibilitiilaantibioticeichimioterapice.

Interpretarearezultatelorhemoculturii Avndnvederepedeoparteposibilitateacontaminriiuneihemoculturiiarpedealtparte cretereaincideneihemoculturilorpozitivecusemnificaieclinicncaresuntimplicate microorganismecondiionatpatogene,carefacpartedinfloramicrobiannormal,rezultatele trebuieinterpretatecuresponsabilitateinechip. Existargumentebacteriologice(deex.izolareaaceluiaimicroorganismdinmaimulte flacoanedehemocultur)iclinicecarepermitmedicilorinfecionitincolaborarecumedicii microbiologisstabileascetiologiamicrobian(uneoripolimicrobian)auneiinfeciigeneralizate. Fiindvorbadeinfeciicupronosticadesearezervat,laboratorularedatoriascomunice rezultatelepemsurceacesteasuntobinute(deex.aspectulmicroscopicpefrotiulcoloratGram duptulburareabulionuluidecultur,aspectemicroscopiceiculturaleobservatedupdezvoltarea unorcolonii,rezultateleantibiogrameinestandardizateetc,saufaptulcduposptmnde observaienusepoateevideniamultiplicareamicrobian)pentrucaspoatfiluatecelemai adecvatemsuri,nfavoareavindecriipacientuluirespectiv.

32. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Klebsiella

MicroorganismeledingenulKlebsiellasuntenterobacteriiimobile,nesporulate,caracterizate printrointensactivitatemetabolicasuprahidrailordecarbonpecareihidrolizeazcuproducere deaciziiuneoridegaz.Glucozaestedegradatcuproduceredegaz.Existmaimultespeciide exempluKlebsiellapneumoniae,K.ozaenae,K.rhinoscleromatisiK.oxytoca.Klebsiella pneumoniaeestespeciaprincipalagenuluiiincludebaciligramnegativi,capsulai(capsula poateaveadimensiunide23orimaimaridectdiametrulbacteriei). Consideratiniialcaagentetiologicalpneumoniilor,sadoveditcnumai13%dinpneumonii (grave,necroticeihemoragice,nspeciallapacienicuunsistemdeapraredeficitar)sunt produsedeKlebsiellapneumoniae.Microorganismul,condiionatpatogen,poatefiimplicatntro marevarietatedeboliprecumtoxiinfeciialimentaredetipinfecios,infeciialetractuluirespirator superior,infeciiurinareetc.DincencemaifrecventKlebsiellapneumoniaeesteizolatninfecii nosocomiale(despital),veziicapitolul23. Cutoatecnuesteceamaireprezentativentitateclinic,vomdiscutancontinuare diagnosticulpneumonieiprodusedeKlebsiellapneumoniae.Diagnosticulcompletincludeelemente clinice,paracliniceidelaboratordiagnosticulbacteriologicfiindutilnstabilireaetiologieii tratamentuluiantibioticcorespunztor. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicestebacteriologic,direct,incluzndurmtoareleetape. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei

antisepsieetc).ninfeciileprodusedeKlebsiellapneumoniaesepotrecoltamateriifecale,urin, snge,puroietc.ncontinuarevomdiscutacazulncarep.p.estereprezentatdesput(vezii capitolul6).Dinpunctdevederemacroscopic,sputapoateaveaunaspectmucoid,deculoare rounchis,njeleudecoacze. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelordelanivelalveolar(ex.macrofagealveolare),prezenacelulelor inflamatorii(ex.leucocite)iprezenabacililorgramnegativi,dedimensiunirelativ mari,ncapsulai(nconjuraideocapsulvoluminoas).Examinareamicroscopictrebuies demonstrezecalitateaprodusuluipatologicisrealizezeoidentificareprezumtiva microorganismuluiimplicat(veziicapitolul52).ncoloraiacualbastrudemetilen,capsulaapare caunhalounjurulklebsielelor.Utilizndanticorpianticapsulari,sepoaterealizaoidentificare rapidinclusivdirect,peprodusulpatologic,prinreaciadeumflareacapsulei(vezicapitolul12, punctul12.14). 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Klebsiellapneumoniaesepoatedezvoltapemediideculturobinuiten1824ore,la3537C. Sepreferutilizareaunormediideculturslabselective(ex.MacConkey).Klebsiella pneumoniaenusedezvoltpemediinaltselectiveiesteparialinhibatpecelemoderat selective.PemediilesolideKlebsiellapneumoniaeformeazcoloniilactozopozitive,mari, detipMbombate,cremoase,npicturdemiere,caredauaspectuldecurgerepesuprafaa mediuluidecultur,cutendindeconfluare.Sepoaterealizaiinocularealaanimaledelaborator sensibile(oarecelealb),veziicapitolul11. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativi,cudimensiunimari,capsulai, capsulafiindvoluminoas,dispuinlanuriscurte,perechisauizolai.nmediuldeculturpot pierdecapsula. Caracteredecultur:Produccoloniilactozopozitive,detipM,mari(23mmla24de ore,peste4mmla48ore),bombate,vscoase,cremoase,npicturdemiere,caredau aspectuldecurgerepesuprafaamediuluidecultur,cutendinlaconfluare. Caracterebiochimice: Klebsiellaesteunmicroorganismlactozopozitiv,ceeacesepoateevideniancdin etapadeizolarepemediulMacConkey. Altecaracterebiochimicesestudiazduprepicareaunorcoloniipemediimultitest (TSI,MIU),pemediulSimmonssaunsistememultitestcomercialedetipAPI. Klebsiellapneumoniaeesteglucozopozitiv(cuproduceredegaz),lactozopozitiv,nu produceH2S,imobil,ureazpozitiv,indolnegativ,caresedezvoltfolosindcitratulcaunic sursdecarbon. Produceacetoin,caracterevideniatprinreaciaVogesProskauer. Caractereantigenice: SeutilizeazseruricuanticorpicunoscuipentruidentificareatulpinilordeKlebsiella,

printehnicideaglutinare,coaglutinaresaulatexaglutinare.Existpeste80detipurideantigenK laKlebsiellapneumoniae.Acestereaciisepotpracticanlaboratoaredereferin. Caracteredepatogenitate:Sepoateutilizainocularealaoarecelealb(vezicapitolul 11). Altecaractere/testeutilizatenidentificarecaresepotutiliza(ncentredereferin): Testareasensibilitiilabacteriofagi(uneledintreschemeaufoststabilitenInstitutul Cantacuzino) Grupareanfunciederezistenalaantibioticeichimioterapice Caracteretestateprinmetodealebiologieimoleculare(stabilireaspectruluiplasmidic, cuidentificareaplasmidelorimplicatenvirulenetc). 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)esteobligatorieiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.Determinarea CMIiCMBpoatefinecesar(vezicapitolul14).

33. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Proteus

GenulProteusesteformatdingermenipleomorfi(deundeinumelegenului),foartemobili, gramnegativi,aerobifacultativanaerobi,carenufermenteazlactoza,producureaz,produc fenilalanindezaminaz,suntnesporulai,necapsulai.Exist2speciiprincipale,Proteus mirabilisiProteusvulgaris. DeregulmicroorganismeledingenulProteussuntimplicatepatogenicnafeciuniceaparn afaratractuluidigestiv(facpartedinfloramicrobianintestinal).Existtotuiitoxiinfecii alimentaredetipinfecioscuProteusspp.nmodfrecventsediscutdespreinfeciiletractuluiurinar (ITU),darsuntposibileialteinfecii(tegumentare,genitale,cualtelocalizrincursulunei bacteriemiilapacienicustatusimundeficitarsaunspital/infeciinosocomiale).Vomdiscutan continuarediagnosticuldelaboratoralITU. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicestebacteriologic,direct,incluzndurmtoareleetape. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).ninfeciileprodusedeProteusspp.sepotrecoltaurin,puroi,diferiteexsudate purulente,materiifecale,lichiddevrstur,alimente,sngeetc.ncontinuarevomdiscutacazuln carep.p.estereprezentatdeurin(veziicapitolul29).Dinpunctdevederemacroscopic,urinaar puteafitulbure,purulent.Transportulurineitrebuierealizatrapid,nmaxim30minute,iardac

aceastrecomandarenupoatefindeplinit,p.p.trebuietransportatlarece(+4C). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunuipreparatproaspt ntrelamilamel,dinsedimentulrezultatdupcentrifugareaurinei.Examenulmicroscopical urineiestefoarteimportantpentrucesteuorderealizat,esteieftinipermiteobservareaunor elementecareorienteazdiagnosticul.Examinareamicroscopicaurineiarputeaconducela economiiimportante(detimp,reactiviimateriale,mediidecultur)veziicapitolul29.Proteus spp.prezintunmarenumrdeciliperitrichicareconfermobilitateacaracteristic(existi tulpiniaciliate).SepoaterealizaiunfrotiucoloratGramdinurinaomogenizat.Germeniiau unaccentuatpolimorfismpefrotiuputnduseobservabacili,cocobacili,formefilamentoasede pnla30m.Suntnecapsulaiinesporulai.Prezenaacelpuin1leucocit/cmpmicroscopic laexaminareacuobiectivuldeimersiesugereazpiuria,carentruncontextclinicsugestivajutla definireaITU.ncazulncaredinurinaomogenizatprelevmcuansacalibratde0,01mluriniar nfrotiulrezultatidentificmcelpuin12bacterii/cmp(nmicroscopiaopticcuimersie)acest rezultatsugereazprezenaa105bacterii(unitiformatoaredecolonii)/mlirespectivinfecia tractuluiurinar. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologictrebuierealizatnaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Crescpemediisimpleinclusivpemediipeptonatelichidecudegajareaunuimiroscaracteristic deputrefacie.SuportmarivariaiidetemperaturidepH.Estenecesarrealizareauroculturii cantitativeidemonstrareaprezeneiapeste105bacterii/mldeurin.Pemediilesimpleuzuale,pe agarsnge,peAABTLetc,nusepotobinecoloniiizolate,fiindcunoscutfenomenulde invazie(veziicapitolul11).AcestaspectsugereazprezenaProteusspp.nprodusulpatologic. Fenomenulpoatefiinhibatdacserealizeaznsmnareap.p.pemediiselectivodifereniale (ex.MacConkeysauADCL).PeacestemediiProteusspp.producecoloniilactozonegative,detip S. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativi,cuunaccentuatpolimorfism(bacili, cocobacili,formefilamentoasedepnla30m),necapsulaiinesporulai. Caracteredecultur: Fenomenuldeinvazie:reprezintuncaracterdeidentificarepreliminarpentruProteus spp.,obacteriefoartemobildacnsmnmotulpincareaparineacestuigenlaperiferiaunei plciPetricumediusimplu(agarizat2%),delaloculnsmnriiculturasedezvoltnvaluri concentrice(sentindeinaproapenaproape)petoatsuprafaamediului Peanumitemediiselective,invaziaesteinhibatisepotobinecoloniiizolate (adugmlamediuldeculturacizisausruribiliare,tiosulfatdesodiuetc)acestecolonii suntlactozonegativeidetipS Fenomenullinieidedemarcaie,reprezintuncaracterutilnstudiiepidemiologice,n cazulncaretulpinileimplicateaparingenuluiProteusdacpeoplaccumediusolidcultivm2 tulpinidiferite,n2puncteopuse,tulpinilesevordezvoltainvadndpnlaunpunctnapropierea linieidentlnire,undesevacreaoliniededemarcaientrecele2tulpini(distande12 milimetri)dactulpinilenusuntdiferitevaavealoccretereanvalurifrdemarcaiecu dezvoltareauneipnzedeculturcontinue

Fenomenuldecrare,reprezintovariantdeizolarenculturpurauneitulpini deProteuscultivareaunuiproduspatologicnlichiduldecondensalunuitubcugeloznclinat incubatnpoziieverticalvaconduce(ncazulncarenp.p.existotulpindeProteusspp.)la obinerean24oreauneiculturipuredeProteus,caresevadezvoltanvalurisuprapusepnla parteasuperioaramediuluidecultur. Caracterebiochimice: Proteusspp.includemicroorganismelactozonegative. Altecaracterebiochimicesestudiazduprepicareaunorcoloniipemediimultitest (TSI,MIU),pemediulSimmonssaunsistememultitestcomercialeProteusspp.esteglucozo pozitiv(uneoricuproduceredegaz),lactozonegativ,produceH2S,mobil,ureazpozitiv,sepoate dezvoltafolosindcitratulcaunicsursdecarbon. Proteusspp.producefenilalanindezaminaz. ProteusmirabilisesteindolnegativiornitindecarboxilazpozitivntimpceProteus vulgarisesteindolpozitiviornitindecarboxilaznegativ. Caractereantigenice: Seutilizeazseruricuanticorpicunoscui(antiOiantiH)pentruidentificareatulpinilor deProteus,printehnicideaglutinare(lanivelullaboratoarelordereferin). Altecaractere/testeutilizatenidentificare(ncentredereferin): Testareasensibilitiilabacteriofagi Grupareanfunciederezistenalaantibioticeichimioterapice. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)esteobligatorieiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.Determinarea CMIiCMBpoatefinecesar(vezicapitolul14).

34. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Yersinia

GenulYersiniainclude11speciidintrecareYersiniapestis(cauzaciumei),Y. pseudotuberculosisiY.enterocoliticaproducinfeciiumane.Suntenterobacteriidedimensiuni mici,cuaspectdebacilisaucocobaciligramnegativi,careprezintcoloraiebipolar.nprodusul patologicprezintunpleomorfismaccentuat.Nuformeazspori,potprezentastructuridetip capsular.Suntaerobifacultativanaerobi,catalazopozitivi,oxidazonegativi.Crescpemediisimple iproduccoloniidetipSn2448deoreultimele2speciisuntmobilela2230C.

ncontinuarevomdiscutadespreyersiniozelecupoartdeintraredigestiv,carepotaveadrept agenietiologiciY.enterocoliticasauY.pseudotuberculosis.Y.enterocoliticareprezintocauz destuldefrecventaBDA,celpuindindateleprezentatenliteraturadespecialitateinternaional. Poatedeterminainfeciicucaracterinvazivlocalizatepeileonulterminal,cuprindereaganglionilor mezentericiiapariiaunordurerinfosailiacdreaptceeacepoateconducelapunereaeronata diagnosticuluideapendicitacut,maialeslacopii.ncazuladulilorsadoveditimplicareaY. enterocoliticandeclanareaunorartritereactivesauaeritemuluinodoscudificultinceeace privetediagnosticuldiferenial.Lapacieniicuvariategradedeimunodepresieboalaentericpoate fiurmatdemanifestriextraintestinale,uneorincadruluneiinfeciigeneralizate.Bolileproduse deY.pseudotuberculosisauoincidenmaireduspotapreaenteritesubacute,adenopatie mezentericetc. Diagnosticuldelaboratornyersiniozelecupoartdeintraredigestivestebacteriologic,direct. ncazulmanifestrilorextraintestinaleesteindicatdiagnosticulserologic. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicpoatefireprezentatdemateriifecale,ganglionirecoltai intraoperator,sngeetc.ncontinuarevomdiscutadiagnosticuluneiBDA.Sepoatefolosimediul detransportCaryBlair. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunuipreparat proasptntrelamilamel(nuseefectueazfrotiuridinmateriilefecale).Preparatulse examineazlamicroscopulopticcuobiectivul40.Vomevideniaprezenacelulelorinflamatorii. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).nvedereaizolriiY.pseudotuberculosissauY.enterocoliticasepotutilizadiferitemedii selectiveclasice(MacConkey,ADCL)saumediulCIN(cefsulodin,irgasan,novobiocin),eventual cuincubarelatemperaturacamerei(2030C).Existdiferitemetodedembogire,deex. inoculareap.p.ntamponfosfatsalincuincubarela4Ctimpde13sptmniurmatdetreceri pemediilemenionatemaisus.Coloniilesuspecteserepicpemediilemultitestclasicesaupe galeriiAPI. 4.Identificareasevarealizapebazamaimultorcaractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocobacilisaubaciligramnegativicucudimensiunide 0,53m/12m,posibilpleomorfi Caracteredecultur: ProduccoloniidetipS,de11,5mm(23mmdup48ore) PemediulCINcoloniilesuntsemitransparente,cumarginiclareicentrulrou Caracterebiochimice: sepotinvestigafolosindmediilemultitestclasicesaugaleriileAPI fermenteazglucozafrproduceredegaz,nufermenteazlactoza,nuproducH2S suntimobilela37Cimobilela22C,nuproducindol,producureaz Caractereantigenice: seutilizeazserurispecificeantiYersinia,prinreaciideaglutinarepelam Testareasensibilitiilabacteriofagi(lizotipia)sepoateutilizanstudiiepidemiologice saunscopdecercetare,fiindrezervatlaboratoarelordereferin

Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin: testebiochimicesuplimentare reaciideaglutinarecualteseruriimune,pentrutipurimaipuinfrecventntlnite bacteriocinotipia tehnicialebiologieimoleculare(digestiaendonucleazicaADNuluicromozomial, electroforezancmppulsatil,ribotipia,PCRetc). 5.Esterecomandatrealizareaantibiogramei(verificareasensibilitiilaantibioticei chimioterapice),prinmetodadifuzimetricstandardizat.Sepotutilizaisistemeautomate,de exemplutrusaautomatATBG5,cucitireiinterpretaredup1824oredeincubare(21 antibiotice),pentrubaciliGramnegativi. Diagnosticulserologic Diagnosticulserologicesteutilndeterminareaetiologieiartritelorreactive,eritemuluinodos sauncazulaltormanifestriextraintestinale.Anticorpiiaparlacirca47ziledeladebutulbolii, atingvaloareamaximdupcirca14zileipersistctevaluni.Sepotpracticadiferitetehnici,de ex.reaciadeaglutinarentuburi. Seconsidercvaloareatitruluisemnificativeste1/160.Esterecomandattestareaserurilor pereche,ndinamic. Trebuiesfieluatnconsiderareposibilitateaapariiaunorreaciincruciate,datorit existeneiunorantigeneasemntoarelamicroorganismedingenurileBrucellasauSalmonella.

35. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Pseudomonas

GenulPseudomonasfacepartedinfamiliaPseudomonodaceaeiincludemaimulte specii.Pseudomonasaeruginosa(bacilulpiocianic,bacilulpuroiuluialbastru)reprezintspecia ceamaiimportantagenului,relativfrecventimplicatninfeciilapersoanecureactivitatesczut, precumininfeciinosocomiale(infeciidespital).Acetigermenisuntbaciligramnegativi aerobi,oxidazopozitivi,nesporulai,cudimensiunide15m/0,51m,mobilidatoritprezeneiunuia saumaimultorflageli(polari). Datoritcapacitiideadaptareisupravieuirendiferitemedii,precumidatoritfactorilorde

virulenpecareideine,Pseudomonasaeruginosapoateproduceinfeciifoartevariate,dela infeciitegumentaresuperficialepnlastridesepsiscuevoluiefulminant.Prezena piocianiculuiarputeafisemnalatdeculoareaalbastrverzuieapansamentelor.Lapersoanelecu reactivitatenormal,infeciilesuntdeobiceilocalizate(foliculite,otite,infeciioculareetc).Lanivel dermic,procesulinfeciospoateaveaioevoluiegrav,cuapariiadeveziculecaresespargise refacpeobaznecroticprocesulpoateprogresanprofunzime(ecthymagangrenosum). Lapersoanelespitalizate,cureactivitatediminuatisupuseunormanevremedicochirurgicale invazive(intubaii,cateterizrietc)precumilapersoanelecuarsuri,Pseudomonas aeruginosapoateproduceinfeciilocalizate,darpotenialuldiseminriiiapariieiunorcomplicaii grave(bacteriemie,osteomielit,meningit,endocardit,sepsis)estefoarteimportant.nlipsa tratamentuluiadecvat(dificildatoritrezisteneilaantibiotice),evoluiaprocesuluiinfeciospoatefi gravsaudeosebitdegrav.UnfenotipparticularalspecieiPseudomonasaeruginosaproduceo infeciepulmonarcroniclapacieniicufibrozchistic(mucoviscidoz).Dintreentitileclinice menionatemaisus,dinpunctdevederealdiagnosticuluidelaboratorvomdiscutainfeciile supurativealetegumentelorimucoaselor. Diagnosticuldelaboratorestenumaibacteriologic,direct,cuurmtoareleetape. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).ncontinuarevomdiscutacazulncarep.p.estereprezentatdepuroi(vezii capitolul6).Puroiultrebuieexaminatmacroscopic,deoarecepoateaveaunaspectsugestiv (culoarealbastrsaugalbenverzuifluorescent). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelordelaniveltegumentar(eventualmodificatefadenormal),prezenacelulelor inflamatorii(ex.leucocite,piocite)iprezenabacililorgramnegativicucudimensiunide 15m/0,51m,dispuinlanuriscurte,perechi,izolai. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Pseudomonasaeruginosasepoatedezvoltapemediideculturobinuiten1824ore,la542 C,cudezvoltareoptimla3037C.Sepreferutilizareaunormediideculturselective.Uneori cultivareaserealizeazpeagarsnge.PemediilesolidePseudomonas aeruginosaformeazcoloniidetipScaresepigmenteaznmodspecific,nsoinduse depigmentareamediului(albastrusaugalbenverdefluorescent).Demenionatcpotaprea colonii(detipS)cuaspectediferite,dndimpresiaprezeneiconcomitenteaunorbacteriidiferite. Culturapoateaveaunmirosaromat,caalflorilordeteisauiasomie.Peagarsngeproduce hemoliz.nmediilichide,Pseudomonasaeruginosatulburmediulnsntimpducelaapariiaunei membraneaderent,cenuie,lasuprafaaacestuia.Dup1824deore,submembransepoate evideniaprezenapigmentuluiprodus. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativicucudimensiunide15m/0,51m,

dispuinlanuriscurte,perechi,izolai,relativpolimorfi.nculturimaivechipotapreadiferiteforme (filamentoase,cocoide).Mobilitateasepoateexaminapepreparatulproaspt,ntrelamilamel. Caracteredecultur: ProduccoloniidetipScaresepigmenteaznmodspecific,nsoinduse depigmentareamediului(albastrusaugalbenverdefluorescent).Potapreacolonii(detipS)cu aspectediferite,dndimpresiaprezeneiconcomitenteaunorbacteriidiferite.Coloniilepotprezenta osuprafairidescent,culuciumetaliciplajedeautoliz,degajndoaromptrunztoare particular.Pentrustimulareasintezeipigmenilorsepoatefolosirepicarepemediispeciale,KingF (stimuleazproducereadefluorescein)iKingP(stimuleazproducereadepiocianin). Culturapoateaveaunmirosaromat,caalflorilordeteisauiasomie. Pemediilecusngeproduchemoliz. Multiplicareala42Cpoatefiutilpentruidentificare. Caracterebiochimice: Producediferiipigmeni,dintrecaremaiimportanisuntpiocianina(albastru)i pioverdinasaufluoresceina(galbenverzuifluorescent). Esteungermencatalazopozitivcaredegradeazoxidativglucozainufermenteaz lactoza(attcoloanactipantamediuluiTSIauculoareroie). Sepoaterealizatestuldeoxidarefermentareaglucozei. Bacilulpiocianicesteoxidazopozitiv(vezicapitolul12). Pentrustudiimaiaprofundate,nmomentulactualanumitelaboratoareutilizeaz sistemecomercialecareverificnacelaitimpnumeroasecaracterebiochimicepermindnu numaincadrareangenulPseudomonas,dariidentificareaprecisaspeciei(deexempluRapid NTF,cuidentificareaspeciein448deore). Caracteredepatogenitate: Sepotstudiananumitesituaii(inoculm4oarecicucantitifixedegermenicultivai pegeloznclinat2%iurmrimsupravieuireaacestoratimpdepatruzile). Altetestecepotfistudiatenscopulidentificriigermenilor: Testareacaracterelorantigenice Testareasensibilitiilabacteriofagi(lizotipia)irespectivpiocinopiasepotutilizan studiiepidemiologicesaunscopdecercetare,fiindrezervatelaboratoarelordereferin Testedebiologiemolecular(sondenucleotidice,analizaADNduputilizareade endonucleazederestricie,PCR). 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)esteobligatorieiserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.Pseudomonas aeruginosareprezintunuldintremicroorganismelecarepotcreadificultideosebitdemarin alegereatratamentuluietiologic,datoritrezisteneilafoartemultedintreantibioticeleuzuale.Cu toatecanumiiautoriindicfaptulcabacilulpiocianicarfisensibillamezlocilin,ticarcilin, ticarcilinacidclavulanic,piperacilin,piperacilintazobactam,imipenem,aztreonam,anumite aminoglicozide,fluorochinolonesaucefalosporinedegeneraiaaIIIa,considermcprincipiul caretrebuiereinutestecnoriceinfeciecuPseudomonasaeruginosa(atuncicndsadovedit cacestmicroorganismesteagentuletiologicalinfeciei)antibiogramaesteobligatorie.ncazul unorinfeciigraveantibiogramadifuzimetrictrebuiesfiensoitdealtedeterminri(vezicapitolul

14).

36. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Vibrio

GenulVibrioincludemaimultespeciidintrecare12suntpotenialpatogenepentruom. Vibrioniisuntbaciligramnegativi,drepisauuorncurbai,foartemobili,necapsulai,nesporulai. SpeciaprincipalestereprezentatdeVibriocholerae(vibrionulholeric),aerobfacultativanaerob, oxidazopozitiv,rezistentlapHalcalinisruribiliare.Vibrionulholericproduceoenterotoxini determinholera. ncondiiinaturalevibrionulholericestepatogennumaipentruom.Dozainfectantestede 1081010microorganisme.Holeranuesteoboalinvaziv.Germeniinuajungntorentulcirculatorci rmncantonailanivelultractuluiintestinalcolonizeazmargineanperieacelulelorepiteliale,se multiplicielibereaztoxinaholeric.Dupoperioaddeincubaiede14zileaparbruscgrea, vrsturi,diareeabundent(2030litri/zi)icrampeabdominale.Scauneleapoase,riziforme(ap deorez)coninmucus,celuleepitelialeiunmarenumrdevibrioni.Existopierdererapidde fluideielectroliicareduceladeshidratare,colapscirculatorianurie.Ratamortalitiinlipsa tratamentuluieste2550%. Diagnosticuldelaboratornholerestebacteriologic,direct,trebuierealizatctmairapid posibil(urgendinpunctdevedereepidemiologic)iincludeetapelecunoscute. Diagnosticulunuicazgravdeholeresteuorderealizat,nspecialncontextuluneiepidemii. Cutoateacestea,cazurileuoaresaucazurileizolatesuntrelativdificildedifereniatdealteboli diareiceacute. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatcelmaifrecventdemateriifecale,dar sarputearecoltailichiddevrstur.Dinpunctdevederemacroscopicmateriilefecalesunt apoase,riziforme(apdeorez),deculoareverzuie,cumirosfetid,coninflocoanedemucus. Transportultrebuiesfierealizatrapid,nmaxim13ore.Sepoatefolosicamediudetransport mediulbacteriostaticCaryBlair.Mediulappeptonatalcalin(pH99,5)poatefiutilizatattn calitatedemediudetransportctidemediudembogire. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunuipreparat proasptntrelamilamel(nuseefectueazfrotiuridinprodusulpatologic).Preparatulse examineazlamicroscopulopticcuobiectivul40.Esenialestefaptulcnuseevideniaz prezenaleucocitelor.Vibrioniisuntnnumrmareiprezintmicriactive,derostogoliresau micrihaotice.Suplimentar,p.p.arputeafitratatcuAcspecificidacmobilitateaestestopat, seconfirmdiagnosticul. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Abordareadiagnosticuluideholerserealizeaznmoddifereniat,respectivprezumtiv(la

nivelulunuilaboratorperiferic)idecertitudine(lanivelullaboratoruluidereferin).Este recomandatutilizareaattaunuimediumoderatselectiv(ex.BileSaltsAgar/BSA)ctiaunui mediunaltselectiv(ex.ThiosulphateCitrateBilesaltsSucrose/TCBS). LundnconsideraresituaiancareseridicsuspiciuneauneiinfeciicuV.choleraese recomandnsmnareap.p.,directsauduptransportulnmediulCaryBlair,nappeptonat alcalin(APA).Dupincubarepentruoduratde68orela3537,facemtrecereapemediul selectiv(TCBSi/sauBSA)lund2ansedelasuprafaaAPA(nacestinterval,lasuprafaaAPA poatesaparunvl,respectivculturadevibrioni). Examenulmicroscopicalvlului(preparatproaspt,ntrelamilamel:vibrionifoartemobili, cumicriderostogoliresauhaotice)precumiutilizareaunoranticorpispecifici(reacie antigenanticorp)potgrbidiagnosticul. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligramnegativicucudimensiunide13m/0,50,8m Caracteredecultur: ProduccoloniidetipS,galbene,mari,cudiametrulde24mm(peTCBS) PemediulBSA,V.choleraeproducecoloniidetipSrotunde,strlucitoare,transparente capicturilederou(spredeosebiredecoloniiledeE.colicaresuntmate). Caracterebiochimice: V.choleraeesteoxidazopozitiv(vezicapitolul12) TestuluvieideADNsepoateutilizapentruadifereniatulpinicaresunt oxidazopozitiveiformeazcoloniicuaspectasemntor(V.choleraeiAeromonasspp.)n acestscopsuspensionmocoloniesuspectntropicturdesoluie0,5%dezoxicolatdesodiu, peolamdemicroscop.ncazulncareestevorbadeocoloniedevibrioni,acetiasuntlizaii elibereazADNulcarepoatefitrascuansacaouvi altetestebiochimice,prinmetodeclasicesauutilizndgaleriilemanualesauautomate (ex.API20E,ID32E),seefectueazlanivelulunuilaboratordenivelsuperiorsaulanivelul centruluinaionaldereferintestelebiochimicepotdifereniabiotipulclasicdebiotipulElTor(se apreciazcV.choleraeO:139esteunmutantalbiotipuluiElTor) Caractereantigenice: SeutilizeazserantiholericO:1isepracticreaciadeaglutinarepelam.Lanivelul centruluidereferinseconfirmreaciapozitiviseidentificserotipul(Ogawa,Inabasau Hikojima)iarncazuluneireaciinegativeserealizeazoreaciedeaglutinarepelamfolosindser antiholericO:139 Testareasensibilitiilabacteriofagi(lizotipia)sepoateutilizanstudiiepidemiologice saunscopdecercetare,fiindrezervatlaboratoarelordereferin.Existsistemedelizotipare caredefinescpeste140delizotipuridiferite. Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin: testulsensibilitiilaagentulvibriostaticcuO/129(10gi50g) determinareatoxinogenezeitulpinilordeV.choleraeprinreaciaVETRPLA(latex aglutinarepasivinversat) tehnicidetipELISApentruidentificareaunorstructuricaracteristiceV.cholerae tehnicialebiologieimoleculare(ribotipie,PCRetc).

5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapice)serealizeazprin metodadifuzimetricstandardizat,nspecialnscopulsupravegheriiapariieiunortulpinirezistente lamedicamenteleantimicrobiene.

37. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Haemophilus

MicroorganismeledingenulHaemophilussuntcocobacilipolimorfi,imobili,nesporulai,gram negativi,aerobi,facultativanaerobi.Suntgermenipretenioipentruasedezvoltaaunevoiede prezenafactorilordecretereprezeninsnge(deundeinumelegenului).Existmaimulte specii,dintrecarecelemaicunoscutesuntHaemophilusinfluenzaeiHaemophilusducreyimulte dintretulpiniledeH.influenzaesuntcapsulate.

Haemophilusinfluenzae
Haemophilusinfluenzaeestepatogenprinmultiplicareiinvazivitate.Microorganismulptrunde pecalerespiratorie.Boaladebuteazcaorinofaringitacut,probabilnasocierecuoinfecieviral lanivelultractuluirespirator.Aceastapoatefiurmatdeepiglotit,laringotraheit,otit,sinuzit, mairardepneumoniedaridecelulitsaudemeningitacutpurulentlacopiiimiciprecolari. Sinusurilesauurecheamediepotfiafectateprinextensielocal(sepoatenotafaptul cHaemophilusinfluenzaetipbipneumococulsenumrprintreageniietiologicifoartecomuni aiotiteimediibacterieneiaisinuziteloracute).Dacmicroorganismulptrundentorentul sanguin,peaceastcalepoateinfectameningele.OcazionalinfeciacuH.influenzaepoateducela olaringotraheitobstructivfulminantcarenecesittraheotomiesauintubarepromptacopilului respectiv.nvedereadiscutriiexamenuluidelaboratorvomaveanvederemeningitaprodusdeH. influenzae. DiagnosticuldelaboratormicrobiologicninfeciilecuHaemophilusinfluenzaeeste bacteriologic,direct,incluzndetapelecarevorfiprezentatencontinuare. nmeningitaprodusdeH.influenzaediagnosticulesteurgent(riscdeevoluiecusechelei /saudeces),deimportanmaximfiindrecoltareaitransportulrapidalLCRctrelaborator.Este depreferatrealizareauneicultivrilapatulbolnavului,chiardacpentruconcentrareagermenilorar puteafinecesarcentrifugareaLCR.AnalizacitologicibiochimicaLCResteutilnstabilirea etiologiei. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).ninfeciileprodusedeHaemophilusinfluenzaesepotrecoltasecreiidelanivelul tractuluirespiratorsuperiorsauinferior,secreiidinsferaORL,lichiderecoltateprinpuncie,snge, LCRetc.ncontinuarevomdiscutacazulncarep.p.estereprezentatdeLCR(veziicapitolul6).

Aacumammaimenionat,recoltareaLCRprinpuncie(dupverificareapresiuniidinartera centralaretineiprinexaminareafunduluideochi)trebuiefcutpectposibillapatulbolnavului, avndladispoziietotceestenecesarpentrupregtireafrotiurilor,cultivareapediferitemediide cultur,repartizareauneicantitideLCRpentruexamenulcitologicibiochimic(veziicapitolul 6).ncazulncarep.p.urmeazafitransportatctrelaborator,transportultrebuierealizatfr ntrziere(laotemperaturapropiatde37C,refrigerareaestecontraindicat).H.influenzaear puteafiizolatiprinhemocultur,cultivareasecreiilornazalesaufaringieneetc.Dinpunctde vederemacroscopic,LCRpoateaveaaspectpurulent. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.DacLCRestefrancpurulentfrotiurilesepotexecutadirectdinp.p.,ncaz contrarrealizminiialcentrifugareaLCR.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersie isenoteazprezenacelulelorinflamatorii(ex.leucocite)iprezenacocobacililor gramnegativi,fini,capsulai,dispuiseparatsaungrmeziaranjatenaceeaidirecie,uneori dispuinlanuriscurte,situaiintrasauextraleucocitar.Datoritfaptuluicacestemicroorganisme secoloreazrelativslabncoloraiaGramarputeafinecesarcolorareafrotiuluiderezervprintro altmetodsau,recolorareaprelungitcufucsin. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Haemophilusinfluenzaeesteunmicroorganismfoartepretenioscarenusepoatedezvoltape mediideculturobinuite.UneletulpinideHaemophilusinfluenzaenecesitpentruiniierea creterii510%CO2.Estenecesarpentruincubareoatmosferumed,la3537C,ioduratde minim2448deore.Pentrucultivaresuntnecesarifactoridecretereprecumhemina(factorX)i factorulVcarepoatefinlocuitprinNAD,NADPsaualtecoenzime.Ambiifactoriseobindin eritrocite,nsestenecesareliberareaconinutuluiacestoranmediu(deexempluprincldur, sauprindigestiepeptic).FactorulVestesintetizatidestafilococulauriu,astfelcpegeloz sngecoloniiledeHaemophilusinfluenzaesuntmainumeroaseidedimensiunimaimarin apropiereauneiliniipecareafostnsmnatotulpinhemoliticdeStaphylococcus aureus(fenomenuldesatelitism).ColoniilesuntdetipSsauMiatingundiametrude0.50,8mm dup24deore,respectiv12mmla48deore,avndaspectulunorpicturideroupegeloz chocolat.Pegelozsngecuinfuziedeinimcreieraparcoloniimici,rotunde,convexe,detipS, carenprimele24oreprezintirizaiiputernice,caracteristice.Nuaparehemoliz. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocobaciligramnegativi,mici(11,5/0,3mm),dispui separatsaungrmezi,uneoridispuinlanuriscurte.nmediicomplexe,la68ore,predomin formelecocobacilare,careauicapsul.nculturilevechisecaracterizeazprinpleomorfismi pierdereacapsulei(dificultidediagnosticdiferenialmicrobiologic). Caracteredecultur:ProduccoloniiledetipSsauMcareatingundiametrude0.50,8 mmdup24deore,respectiv12mmla48deore,avndpegelozchocolataspectulunorpicturi derou.Necesitprezenanmediuldeculturafactorilordecretere(XiV).FactorulVeste sintetizatidestafilococulauriu,astfelcpegelozsngecoloniiledeHaemophilus influenzaesuntmainumeroaseidedimensiunimaimarinapropiereauneiliniipecareafost

nsmnatotulpinhemoliticdeStaphylococcusaureus(fenomenuldesatelitism).Pe gelozsngecuinfuziedeinimcreieraparcoloniimici,rotunde,convexe,detipS,carenprimele 24oreprezintirizaiiputernice,caracteristice.Nuaparehemoliz. Caracterebiochimice: Majoritateatulpinilor(70%)suntindolpozitive(transformtriptofanulnindol). Fermenteazinconstantdiferiicarbohidraii.Pebazaunortestebiochimicespeciaa pututfimpritnbiotipuri. UtilizndgaleriaAPINH(manual)putemidentificaspecii deNeisseria,HaemophilusiBranhamellacatarrhalis,nnumai4ore. Caractereantigenice: SeutilizeazseruricuanticorpicunoscuipentruidentificareatulpinilordeHaemophilus influenzae,printehniciimunologice,nfunciedeAgK.Tipurile(af)sepotdifereniaprinreaciide umflareacapsuleiideimunofluorescen. Tulpinilecapsulate(AgK)sepotidentificanp.p.(LCRsauurindupcentrifugare)prin contraimunoelectroforez,latexaglutinaresauELISA. TulpinilenecapsulatesepotidentificaitipizaprinMultilocusEnzymeElectrophoresis (MLEE). Alteteste:existsondenucleotidiceprodusecomercialpentruidentificareaH. influenzae. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)estenecesariserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.Este recomandatutilizareaunuimediuspecial,respectivHaemophilustestmedium(HTM).Sepot utilizaitruseautomatepentrutestare(ex.ATBHAEMOcucitireiinterpretaredup1824ore saurapidATBE4cucitireiinterpretaredup45oreincubare).DeterminareaCMIiCMBpoate finecesariserealizeazprinmetodeclasicesaucuajutorultestuluiE(vezicapitolul14). IdentificarearspunsuluiimunfadeHaemophilusinfluenzae IdentificareaprezeneideanticorpifadeH.influenzaearputeafiutilpentruverificarea rspunsuluiimunnurmavaccinrii.nacestscopaufostutilizateRIAiELISA.

Haemophilusducreyi
Haemophilusducreyiestestrictpatogenpentruspeciaumanfiindagentulpatogenaluneiboli cutransmiteresexual,ancrulmoale.nregiuneagenitalapareancrulmoale(iniialseformeaz opapulsensibil,cueritemnjur,urmatdeapariiauneipustuleiapoiauneieroziunicare ulcereaz),dureros,cueritemiedem.Potexistaancremultiple.Ganglioniiregionalisuntmrii, dureroiipotsupura.Diagnosticuldiferenialsefacecusifilisul,infeciacuvirusulHerpes simplexilimfogranulomatozavenerian. Diagnosticuldelaboratorestenspecialmicrobiologic(bacteriologic,direct). 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).ninfeciileprodusedeHaemophilusducreyisepotrecoltasecreiidelanivelgenital (raclareasecreieidesubmargineaancruluipuroidinabces).

2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Putemvizualizaintrasauextracelularbacilidedimensiunimici,pleomorfi, gramnegativi,dispuinperechisaulanuriparalele(niruri),frecventnasocierecualte microorganisme.Sepotcolorabipolar. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).CultivareaH.ducreyiestedificil.NecesitpentrucultivarefactorulX.Sepoatedezvoltadac produsulpatologicesterecoltatdelabazaancruluiicultivatpegelozchocolatplusvancomicin 3mg/mlla33Cnatmosferde510%CO2. 4.Identificareamicroorganismuluisevarealizapebazamaimultorcaractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbacilidedimensiunimici,pleomorfi,gramnegativi, dispuinperechisaulanuriparalele.Sepotcolorabipolar. Caracteredecultur:ProduccoloniiledetipSdedimensiunimici,dup37ziledela cultivare.Pegelozsngepotproducehemoliz. Caracterebiochimice: Necesitprezenanmediuldeculturafactoruluidecretere(X). Haemophilusducreyiestecatalazonegativ. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)estenecesaripoaterealizaprinmetodedifuzimetrice. Diagnosticuldelaboratorimunologic ancrulmoaleestesinguraafeciuneprodusdemicroorganismedingenulHaemophilusn carediagnosticulserologicarputeafiutil.Identificareprezeneianticorpiloresteutilinscop epidemiologic.SepotutilizatehnicidetipELISApentruidentificareaanticorpilorIgGsauIgMcare aparfadeH.ducreyi. EstencndiscuieutilitateaIDRcuAgextrasedinculturdebaciliDucreyi.

38. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Bordetella

MicroorganismeledingenulBordetellasuntcocobacilipolimorfi,imobili,nesporulai,capsulai, gramnegativi,asemntoricelordingenulHaemophilus,strictaerobi.Speciatipestereprezentat deB.pertussisagentuletiologicaltuseiconvulsivealteexemplesuntreprezentatedeBordetella parapertussisiBordetellabronchiseptica.Suntgermenipretenioipentruasedezvoltaaunevoie demediideculturmbogite.

Bordetellapertussis
Bordetellapertussisestepatogennumaipentruom.Transmitereaserealizeaznspecialpe caleaerian(picturiPflgge)ntrunaccesdetuse.Contagiozitateaestemaximnprimulstadiu

deboalilanceputulstadiuluialdoilea(detuseparoxistic).Microorganismulader,se multiplicrapid,interfercuactivitateamucociliarnormal,aparprimelemanifestriclinicecarese agraveaztreptat.Substaneletoxiceelaborate(inspecialtoxinapertussis/TP)auurmtoarele aciuni:TPconducelahipoglicemie,sensibilizarelahistamin,reducereaactivitiimacrofagelor, diminuarearspunsuluiimunumoral(sintezadeanticorpi)adenilatciclazapertussisdiminu activitateafagocitaramacrofagelorileucocitelortoxinaletalproducenecrozelocale,citotoxina trahealareefectcitotoxicpeceluleleciliateetc. DiagnosticuldelaboratormicrobiologicninfeciilecuBordetellapertussisestebacteriologic, directdiagnosticulserologicestetardiviarputeafiutilpentruundiagnosticuldiferenial (postfactum)saudinpunctdevedereepidemiologic. Diagnosticuletiologicestefoarteutilnprimulstadiualtuseiconvulsive(pacientulestefoarte contagiosiarevoluiaboliipoatefiinfluenatpozitivprinadministrareadeantibiotice) identificareaB.pertussislapersoaneleasimptomaticeirespectivlacontaciarpermiteaplicarea unormsuripreventive. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).ninfeciileprodusedeBordetellapertussissepotrecoltasecreiidelanivelul tractuluirespiratorsuperior(nazal,faringian)vomrealizarecoltareacuajutorultamponuluidin alginatdecalciucareselaspeloc3060desecundepentruafavorizaadsorbiaB. pertussis(bumbaculinhibdezvoltareamicroorganismelor)sauprinaspirareasecreiilor traheobronice.Estedescrisimetodaplcilortuite(seexpuneoplacPetricumediul BordetGengoulacaresaadugatantibiotic,deschis,laaproximativ20cmnfaaguriibolnavului ntimpulaccesuluidetuse).Esterecomandatprelucrareaimediatap.p.,dacesteposibilla patulbolnavului(microorganismulfiindfoartepuinrezistentnmediulextern).Nuexistometod perfectpentrurecoltareap.p.atuncicndsesuspicioneazoinfeciecuB.pertussis(toate metodeleaudiferitelimiteattdinpunctuldevederealsensibilitiisauspecificitiictidinpunct devederepractic). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologic,caresevorcoloracualbastrudemetilen(AM)irespectivGram.Examinm frotiurilelamicroscopulopticcuimersieinotmprezenacelulelorinflamatorii(ex.leucocite)i prezenacocobacililorgramnegativi,dispuiseparatsaunperechi,rareorinlanuriscurte. DatoritfaptuluicacestemicroorganismesecoloreazrelativslabncoloraiaGramarputeafi necesarcolorareafrotiuluiderezervprintroaltmetod(imunofluorescendirect)sau recolorareaprelungitcufucsinsausafranin. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Bordetellapertussisesteunmicroorganismfoartepretenioscarenusepoatedezvoltapemedii deculturobinuiteesteinhibatdeacizigrai,peroxiziorganicietc.IzolareaB.pertussisnculturi estedificil,dareforturilesuntnecesarepentruaputeafievaluatvariaiagenetic(defaz)i respectivpentruaputeasupravegheafenomenulapariieirezisteneilaantibioticeichimioterapice. Bordetellapertussisnecesitpentrucultivarenicotinamidsauacidnicotiniciotemperatur optimde3537C,cuincubaretimpde37zile,naerobioziatmosferumed.Celmai

cunoscutmediudeculturestemediulBordetGengoucareconineagar,maceratdecartof,snge, glicerolidevineselectivprinadugaredepenicilin/meticilinsaucefalexin.Albuminele plasmaticedinacestmediuleagaciziigraiipermitdezvoltareamicroorganismelor.Dezavantajul principalalmediuluiclasicBordetGengouestereprezentatdetimpulscurtncarepoatefiutilizat (17zile). Actualmenteserecomandutilizareaunuimediufolositiniialcamediudetransport,care includegeloznutritiv,crbuneactivatiestesuplimentatcu10%sngedecal.Acestmediu poatefiutilizatpeparcursula12luni,iarcoloniiledeB.pertussisaparmairapid. nvedereaizolriiprimareestenecesarmediulBordetGengousaumediulcucrbuneactivat, nsprintrecerirepetatecoloniilesepotdezvoltaipegelozsngesauchiaripegelozsimpl. Microorganismulsevamultiplicamairapid,coloniilevorfimaiopaceivorapreamodificri morfologice(pleomorfism),alterristructurale,virulenafiindsczut. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocobaciligramnegativi,mici,cudimensiuneade 0,20,5m/0,52m,imobili,dispuiseparatsaunperechi,rareorinlanuriscurte,cutendinade adevenipleomorfinurmasubcultivrilor(potapreaiformefilamentoase).Utilizndcoloraii speciale,ncoloniilerezultatedinprimoculturisepotevideniastructurilecapsulare.Dacfrotiulse coloreazcualbastrudetoluidin,sepunnevidengranulemetacromaticesituatebipolar. Imunofluorescenadirectesteutilipentruidentificareamicroorganismuluidupcultivare. Caracteredecultur:ProduccoloniidetipSsauM.Dup37ziledeincubarela37C pemediulBordetGengousepotdezvoltacoloniidetipSmici,convexe,uortransparente,cu strluciremetalic,foarteaderente,nconjuratedeunhaloudehemoliz(fazaI).nlumina transmisobliccoloniileseamncupicturiledemercur.Pemediulcucrbuneactivatcoloniile aparmairepede,sunttotdetipS,mici,convexe,negre,cusuprafaaperlat. Caracterebiochimice: Bordetellapertussisestehemolitic,oxidazopozitiv,ureazonegativ. Sepotutilizatrusecomercialemanualecareidentificspeciidebaciligramnegativi(ex. API20E,API20NE),fiindderegulnecesareitesteadiionaledeidentificare. Caractereantigenice: SeutilizeazseruricuanticorpicunoscuipentruidentificareatulpinilordeBordetella pertussis,prinreaciadeaglutinarepelam. Altetestedeidentificareutilizatenlaboratoaredereferin:Sepoateutilizaamplificarea geneticfolosinddiferiteamorse(primeri)tehnicaPCRareobunspecificitateisensibilitate dezavantajulprincipalfiindreprezentatdecostulridicat. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)poatefinecesarnscopulsupravegheriiapariieifenomenuluiderezistenla antibioticeiserealizeazprinmetodedifuzimetrice. Diagnosticulserologicestetardiv.DinpunctdevederetehnicaufostutilizateRFC,reaciile deaglutinare,hemaglutinareihemaglutinoinhibaresautehniciledetipELISA.Anticorpiiapardina 2asaua3asptmndeboal.Diagnosticulserologicarputeafiutilpentruundiagnosticul diferenial(retrospectiv)saudinpunctdevedereepidemiologic.

39. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Brucella

GenulBrucellacuprinde7specii,cunumeroasebiotipuri,careinfecteazanimaleleisepot transmitedecelemaimulteoriaccidentalomuluideex.Brucellamelitensis(capre,oi),Brucella abortus(vaci),Brucellasuis(porci),Brucellacanis(cini).Suntcocobaciligramnegativi(demulte oricoloraibipolar),cudimensiunide0,50,6m/0,61,5m,imobili,prezentndeventualostructur capsular,nesporulai,localizainmodcaracteristicintracelular,aerobifacultativanaerobi,catalazo pozitivi,relativinactivimetabolic,caresedezvoltrelativdificilpemediiledeculturintrndn categoriabacteriilorpretenioasecunecesitinutritivecomplexe,suntbacteriifastidioase(maiales atuncicndserealizeazcultivareainiial,dinp.p.). Brucelelesuntmicroorganismeparazitepentruoseriedeanimalesaupentruom,capabiles determineinfeciiacute,cronicesauinfeciiinaparente.Cronicizareadepindedecapacitateade multiplicarencelulefagocitare.FormelecelemaigraveaparcaurmareainfecieicuBrucella melitensis,urmatdeinfeciacuBrucellasuis,BrucellaabortusirespectivBrucellacanis. Transmiterealaompoatefirealizatpecaledigestiv,cutanatimairarpecalerespiratorie. Delanivelulporiideintrare,microorganismeleajunglanivelulganglionilorlimfaticiregionali, depescaceastbarieripecaleaductuluitoracicajungnsngeiarpecalesangvinn organelecusistemreticulohistiocitarilanivelosos.Incubaiaestenmediede23sptmni, nsuneoripottrecectevalunintremomentulinfectriiiapariiafenomenelorclinice.Debutul estedeobiceiinsidios,manifestatprinastenie,indispoziie,cefalee,artralgii,febrmoderat, transpiraiiabundente. nperioadadestaresimptomelesuntpolimorfe,brucelozafiindunadinbolileextremdegreude recunoscutclinic.Febraondulant(carecretencursuldupamieziiiscadentimpulnopii) nsoitdefrisoaneareovaloareistoric.nrealitate,curbafebrilareunaspectvariabil. Transpiraiileabundentenocturne,cuunmiroscaracteristic,astenia,durerilesubdiverseforme reprezintalteelementecarepotficomunencursulbolii.Saudescriscirca200desemneclinice carepotaparenbruceloz. Durataboliipoatefide34sptmni,darcelmaifrecventdepete3luni,ajungndn formelecronicelaanidezile.nformelecronicediagnosticulsestabiletefoartedificil. Diagnosticulbrucelozei nprincipiu,nrealizareadiagnosticuluisepornetedelaaspectecliniceiepidemiologice, nsdiagnosticuldelaboratoresteesenial,reprezentndunicametodcertpentruundiagnostic pozitiv. Diagnosticuldelaboratornbrucelozpoatefibacteriologic(direct)sauserologic.Diagnosticul

bacteriologicincludeurmtoareleetape. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialctmairapiddupdebutulboliiinaintedeiniierea antibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatcelmaifrecventdesnge,darsarputea recoltaiprinpuncieganglionar,punciemedular(ratadeizolarecrete),punciehepaticsau splenic,sauarputeafireprezentatdeLCR,urin,bil,lapte,materialenecropticeetcnfunciede simptomatologieistadiulbolii.ncontinuarevomdiscutasituaiancareserealizeaz ohemoculturprinmetodeclasicesaunsistemedecultivarerapide,detipulBactAlert,Bactec sauSeptiChek(veziicapitolul31). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicnuaducederegulinformaiiutile diagnosticului,nspecialdacestevorbadesnge.Sepoatefolositehnicaimunofluorescentcare uneoriducelarezultatepozitive. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Toatespeciileaucerinenutritivecomplexenecesitndpentrudezvoltaremediimbogitecu substanenutritive(aminoacizi,proteineserice,glucoz,sruri,vitamine,ser,sngeetc).Se recomandefectuareahemoculturilornmediulbifazic(solidlichid),ex.tipCastaneda.Culturase incubeaznatmosferde510%CO2,la37Cpentruoperioaddeminim23zileculturile negativetrebuieurmritepnla4sptmni.ncazulmediuluibifazic,vomnsmnapantade mediusolidlafiecare23zile,fradeschideflaconul. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntcocobaciligramnegativicucudimensiunide0,50,6m/ 0,61,5m,dispuiizolatsaunperechi,lanuriscurte,grupat.Sepotcolorabipolar.Poatefi necesaroprelungireatimpuluiderecolorarecufucsin,altfelsuntpalidcolorai. Caracteredecultur: Pemediilembogitecorespunztoarenutritiv,potproducedup23zilecoloniidetip S,cuundiametrudecirca1mmdimensiuneacoloniilorsemreteastfelnctla1sptmnde incubarediametrulpoatefide67mmpotfiidentificate(nspecialdupincubareprelungit)colonii detipRsauM Examinatefolosindosursdeluminla45,coloniileapartransparente, galbendeschis,asemntorpicturilordemierentimpcenluminareflectatprezinto transparencenuiualbstruie Caracterebiochimice: Brucellaspp.duprepicarepeunmediuneselectivprezintunmetabolismoxidativ Microorganismelesuntcatalazopozitive,ntimpcetestareareaciiloroxidazei,ureazei iproduceriideH2Spotdarezultatevariabilesepotutilizasistemeclasicedetestare,dareste posibiliutilizareagaleriilorAPI(ex.API20E) TestmnecesitateanCO2,pentruizolare Semaipotverificametabolizareaglucozei,lactozeiprecumisensibilitatealadiferii coloraniincluideex.nmediidecultur(ex.tioninsaufucsinbazic) Caractereantigenice: UtilizmseruriimuneantiBrucellaadsorbite,prinreaciideaglutinarepelam(exist

reaciincruciate)ncazuluneireaciipozitive,lanivelullaboratoarelordereferinsepotrealiza reaciideaglutinarepelamcuseruriimunemonospecifice(antiA,MsauantiRncazulcoloniilor detipR) Testareasensibilitiilabacteriofagi(lizotipia)sepoateutilizanstudiiepidemiologice saunscopdecercetare,fiindrezervatlaboratoarelordereferinspreexemplufagulTbilisi lizeaztulpiniledeB.abortus,poatelizalaconcentraiicrescutetulpiniledeB.suis,darnulizeaz tulpiniledeB.melitensis,B.canissautulpinilenformR Altetesteutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin: tehnicialebiologieimoleculare(existsondenucleotidicespecificepentrudiferite biotipuriizolatemaifrecvent,deex.1i3aparinndB.melitensissencearcpunerealapuncta PCR,pentrudiagnosticulbrucelozei). 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapice)serealizeazprin metodadifuzimetricstandardizat,iesteutilattnscopulsupravegheriiapariieiunortulpini rezistentelamedicamenteleantimicrobienectipentrustabilireatratamentuluicorespunztorn cazuluneimaladiiinfecioasengeneraldificildetratat. Diagnosticulserologic Estedemulteorinecesar,inndcontdedificultilentlnitencursuldiagnosticului bacteriologic.Utilizmantigenecunoscuteincercmsdeterminmprezenaanticorpilor specificinsngelepacientului,valoareatitruluianticorpilorirespectivevoluiaacestuititrun dinamic.TrebuiesmenionmcanticorpiidetipIgMcrescninfeciaacut(ncteva sptmni)darpersistininfeciacronicsauchiariduptratamentulantibioticrealizat corespunztor(timpde12ani).AnticorpiidetipIgGapardupcirca3sptmnideladebutul brucelozei,atingovaloaremaximla68sptmniipersistncazuluneiinfeciicronice. nspecialdinpunctdevedereistoricdiscutmiputempracticancadrullucrrilorpractice, aglutinareapelam(Huddleson,reaciecalitativ,descreening).Ceamaicunoscutiutilizat tehnicdediagnosticserologicestereaciadeaglutinarentuburi(Wright)princareputem determinaatttitrulanticorpilordetipIgMcticelalanticorpilordetipIgG. Avndnvederefaptulcnbrucelozaparianticorpiblocani(AcdetipIgAcareblocheaz activitateaaglutinantaAcIgMsauIgG),carepotpersistaanidezile,existdificultiinceea cepriveteinterpretarearezultatelorobinutendiagnosticulserologic. Pentruasimplifica,considermcuntitru1/160estesugestiv,ntimpceocreterede4ori ndinamicatitrului,poateconfirmadiagnosticuldebruceloz. Existoseriedevariantetehnicecarepermitreducereaerorilordeinterpretare: diluareasuplimentaraserurilordecercetat testuldeblocare(adugmtuburilorncarereaciaWrightestenegativcte1pictur deserimunantiBrucelladacreaciarmnenegativinicinacestcaznuapareaglutinarea, concluzionmcnseruldecercetatexistanticorpiblocani) testulCoombs utilizareauneitehnicidetipELISApentrudetectareaAcdetipIgMiIgGcareaparfa deproteinelemembraneiexterneetc. Diagnosticulimunobiologic DatoritfaptuluicninfeciacuBrucellaspp.estestimulatnspecialrspunsulimunmediat celular,diferiiautorimenioneazutilizareaintradermoreacieicubrucelinninvestigareaunuicaz

suspectdebruceloz.IDRcubrucelinpoateidentificaexistenauneistridehipersensibilitatede tipIV,fadeantigenulbrucelos.

40. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Corynebacterium diphtheriae

GenulCorynebacteriumincludemaimultespeciidebaciligrampozitivi(sepotcolora neuniform),uorincurbai,mciucai,aezainV,L,nmicigrmezineregulatesaunpalisade, nesporulai,necapsulai,imobili,aerobiifacultativanaerobi,catalazpozitivi. StudiirecenteaudelimitatgrupulCorynebacteriumdiphtheriaencareseregsescspeciileC. diphtheriae,C.pseudotuberculosisiC.ulcerans(ultimeledoufiindureazpozitive).Cultivmai binepemediimbogite(deex.cuadaosdesersausnge).Aucapacitatea(ncazulconversiei genetice)deaelaboraexotoxin.C.diphtheriaeincludepatrubiotipuri:gravis,mitis,intermediusi belfanti. Dupptrundereacareareloccelmaifrecventlanivelultractuluirespirator(faringian,nazal), urmeazmultiplicareaiinducereauneiinflamaiilocale.Tulpinilelizogene(infectatecu bacteriofagitox+)sintetizeaztoxinacarepoateafectaoricetipdecelul,darcelemaiimportante efectesuntlanivelcardiac(miocardit),nervos(demielinizare),renal(necroztubular), suprarenalian,muscularihepatic.nctevaziledeladebutulinfeciei,toxinainduceapariiaunei structuricompusedinfibrin,leucocite,eritrocite,celuleepitelialerespiratoriimoarteibacterii, respectivfalsamembrandeculoaregrimaronie(diphtheramembran).Aceaststructurse poateformalocal(amigdalian,faringian,nazaletc)sausepoateextinde,acoperindfaringele, obstrucionndarboreletraheobronic(cruplaringian,asfixiemecanic).Laadpostulfalsei membrane,baciliiicontinumultiplicareaisintezadetoxincaredifuzeazpecalesanguini conducelaapariiaunortulburriladistan(tulburrideritmcardiac,miocardit,dificultivizuale, devorbire,denghiireetc). Cuctdiagnosticulestemaitardiv,cuattratamortalitiiprindifteriecrete. Datoritfaptuluicnultimii15aninuaumaifostnregistratecazurideboalnaranoastr, existrisculnerecunoateriiacesteipatologiidectremediciicarenuauvzutniciodatuncazde difterie.Risculapariieicazurilorexistiarsistemuldesntatetrebuiesfienpermanenpregtit pentruareacionaprompt,dintoatepuncteledevedere(clinic,terapeutic,diagnostic,epidemiologic etc). Diagnosticuldelaboratorndifterieestebacteriologic,directitrebuierealizaturgentexist anumiteparticulariticaretrebuiemenionate. ncazulsuspicionriiunuicazdedifteriediagnosticuliinstituireatratamentuluiseimpuncu maximurgen.Sepornetedelaundiagnosticprezumtivbazatpeurmtoarelesemne:a). amigdaliti/saufaringitcudurerideintensitatemedieplusasociereauneifalsemembraneb). adenopatieiedemcervical,maialesdacseasociazcufaringitmembranoasisemnede

toxicitatesistemicc).cornajistridor(respiraiizgomotoaseiuiertoare),tiraj(depresiunea prilormoisuprasternale,supraclaviculare,intercostale,epigastricenmomentulefortului respirator)d).paraliziapalatuluimoalee).secreienazalserosanguinolentasociatcuprezena unorfalsemembranelanivelulmucoasei. Seadaugdinpunctdevederebacteriologicexaminareafrotiurilorrealizatedinprodusul patologiccolorateGramicualbastrudemetilen.Tratamentulspecific(administraredeantitoxin) seinstituiefrntrziere,fraateptafinalizareadiagnosticuluibacteriologic. Diagnosticuldirect(bacteriologic),curealizareaetapelorcorespunztoare,esteutilpentru confirmareinscopepidemiologic. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6).Produsulpatologicestereprezentatcelmaifrecventdesecreiidela nivelulfaringeluiidesecreiinazale.ncazulprezeneifalseimembraneserecomand detaareacuprecauieaacesteiairecoltareasecreieiaflatesubaceaststructur.nvederea prelevriip.p.vomutilizaminimpatrutampoanediferite,treipentrurecoltareasecreiilorfaringienei alpatruleapentrurecoltareasecreiilornazale.Primultamponvafiutilizatpentrurealizarea frotiurilor,aldoileasevautilizapentrucultivarepediferitemediidecultursolide,selectivei neselective(ex.gelozsnge,Loefflerimediicuteluritdepotasiu,precummediulTinsdale),n timpcealtreileaialpatruleatamponvorfiintrodusentrunmediudembogire(OST, ousertelurit).Pentrufiecarecultivarenparteexistunanumitalgoritm.Spreexemplu,mediul Loefflervafiincubatpentru48orela3537Cdupcaresevarealizaunprimfrotiu,coloratGram. Dacrezultatulestenegativtubulsereincubeaztimpde18oreiardacestepozitivsefaceo repicarepemediulTinsdaleisencepeidentificareapebazacaracterelorbiochimice. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicpoatefidecisiv(ncontextclinici/ sauepidemiologicsugestiv)pentruncepereatratamentuluispecific.Realizmminimdoufrotiuri, unulcoloratGramiarcellaltcoloratcualbastrudemetilen.Prezenaunorsemneclinicesugestive lacareseadaugvizualizareapefrotiulcoloratGramaleucociteloriaunorbaciligrampozitivi(la limit),uorincurbai,mciucai,aezainV,Lsausubformdeliterechinezetintimpcela coloraiacualbastrudemetilen(modificat)amputearemarcaprezenagranulelormetacromatice puteaconducelaadministrareadeantitoxindiftericdiagnosticuldecertitudineurmeazafi stabilitulterior. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Aspectulcelmaicaracteristicsenregistreazpemediilecuteluritdepotasiu(ex. GundelTietz,Hoyleetc),dup2448deore.BiotipulgravisformeazcoloniiopacedetipR,plate, cumarginicrenelate,cutendinadeasedesfacenfragmenteatuncicndsuntprelevatecuansa, relativdificildeemulsionat,deculoarecenuiesauneagr,diametrulcolonieifiindde1,52mm. BiotipulintermediusformeazcoloniiopacedetipS,platecucentrulmamelonat,deculoare cenuiesauneagrcumarginetransparent,diametrulcolonieifiindde1,52mm(darse recunoateprezenaunorcoloniidedimensiunidiferite).BiotipulmitisformeazcoloniidetipScare pottrecenformaRprinmbtrnire,cusuprafalucioas,culoarecenuiesauneagr, translucide,diametrulcolonieifiindde0,51mm.BiotipulbelfantiformeazcoloniiopacedetipS, deculoarecenuiesauneagr,diametrulcolonieifiindde1,52mm(darserecunoateprezena unorcoloniidedimensiunidiferite).

4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Seexamineazcelmaibineatuncicndfrotiulesterealizat dincoloniiaprutepemediulLoeffler(aspectetipiceaparincazulfrotiurilordinp.p.).Suntbacili grampozitivi(lalimit),polimorfi,cudimensiunide18m/0,50,8m,uorincurbai,mciucai, aezainV,Lsausubformdeliterechinezeti.Existrecomandarearealizareaunorfrotiuri colorateimunofluorescent,ceeacearpermiterealizareaunuidiagnosticmairapid. Caracteredecultur: nfunciedebiotip,produccoloniidetipSsauR,aacumammenionatmaisus.Pe mediiledetipulgelozeisngeaspectulmorfologicesteaproapesimilar,culoareafiindalbsaugri perlat.Biotipurileintermedius,mitisibelfantiproducozonmicdebhemoliz. PemediulTinsdalecoloniilesuntnegre(datoritproduceriideH2S)cuhalogrimaro. Anumiiautorimenioneazcfrotiurilerealizateporninddelacoloniiledezvoltatepeacestmediu permitevideniereagranulelormetacromatice. PemediulLoeffler(mediuelectiv)coloniileaparn18orefiindalbe,lucioase,bombate, semicremoase,asemntoarepicturilordespermanet. Caracterebiochimice: nscopuldiferenieriiC.diphtheriaedealtespeciialegenuluisepractictestul pirazinamidazei(negativ)icistinazei(pozitiv).Testulcatalazeiestepozitiv. Difereniereabiotipuriloriconfirmareadiagnosticuluidespecieserealizeazprintestul catalazei(pozitiv),ureazei(negativ),reducereanitrailorifermentareaunorzaharuri. Sepotutilizasistemecomerciale,precumgaleriileAPICORYNEcaresebazeazpe combinareatestelorbiochimicecutesteleenzimatice(20teste) Caractereantigenice: Seutilizeazserantitoxindiftericpentruidentificareaproduceriitoxineiprintestul ELEK(veziicapitolul16).Testulpoatefiinterpretatla2448oreesteuntestsimpluiprecis. Caracteredepatogenitate: Testareatoxigenezeiinvivo,pecobai,lanivelulcentruluidereferinculturaeste inoculatsubcutanatlaunlotdecobaineprotejaiiunlotdecobaiprotejai(cuantitoxin difteric).ncazulncareculturatestatincludemicroorganismetoxigen,cobaiineprotejaimorn 2448orecuevideniereasemnelordeintoxicaiedifteric. TestareaproduceriidetoxinpeceluleVerosauprinaltemetode(Westernblot,ELISA, PCRpentrusubunitialegeneitox+etc) Testareasensibilitiilabacteriofagi(lizotipia)sepoateutilizanstudiiepidemiologice saunscopdecercetare,fiindrezervatlaboratoarelordereferin. Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin: Testebiochimicesuplimentare tehnicialebiologieimoleculare(ribotipie,profilulderestriciealuneiregiuni caracteristice,dupamplificaregenicetc). 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapice)sepoaterealizaprin metodadifuzimetricstandardizat,nspecialnscopulsupravegheriiapariieiunortulpinirezistente lamedicamenteleantimicrobiene.Deregul,tulpiniledeC.diphtheriaesuntsensibilela antibioticelefolositeuzualntratament(penicilin,eritromicin).

41. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Listeria

GenulcuprindemaimultespeciidintrecareceamaiimportantspecieesteListeria monocytogenes,carepoateproduceinfeciivariate,umaneianimale.Mairaraufostizolatetulpini dinspeciileL.ivanoviiisauL.seeligeri.Suntbacilifinigrampozitivi,aerobifacultativanaerobi, mobilila25C,caresedezvoltpreferenialla30Cdarsepoatemultiplicailatemperatura frigiderului(mbogirelarece).

Listeriamonocytogenes
Listeriamonocytogenesestepatogenprinmultiplicareiinvazivitate(prezintostructur asemntoareproteineiMstreptococice,producediferitesubstanecurolninvazivitate,inclusiv lecitinaza,fosfolipazaCilisteriolizinaO,cuefecthemolitic).Infecteazprobabiliniialcelulele intestinale,supravieuieteintracelularisemultiplicintramacrofagic. Listeriozaesteozoonoz.Infeciaumanapareaccidentalifoartefrecventevolueaz inaparent.Dintremanifestrileclinicegraveamintimlisteriozaperinatal,probabiloinfecie intrauterin(avortspontan,natereprematur,sepsiscudecesnaintesaurelativrepededup momentulnateriietc).Laadulipotapreameningoencefalit,bacteriemieurmatdemetastaze septice(maialeslaimunodeprimai)imairar,diferiteinfeciifocalizate. Dintretoatetipurileantigenice,90%dintretulpinileizolatelaomaparintipurilorIa,IbiIVb. PutemmenionactipulIVbafostmaifrecventasociatcuconsumuldebrnzfcutdinlapte nepasteurizat.Asociereaunorepidemiidelisteriozcuconsumuldealimentecontaminate sugereazcaleagastrointestinaldreptceamaiimportantcaledeptrundere. DiagnosticuldelaboratormicrobiologicninfeciilecuListeriamonocytogeneseste bacteriologic,direct. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmai rapidicorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieetc).Diagnosticuldelaboratorsebazeazpeizolareaiidentificareamicroorganismului, nspecialdinsngei/saudinLCR.ninfeciileprodusedeListeriamonocytogenessemaipot recoltalichidamniotic,placent,esutfetal,dariprelevatepatologicecontaminatecualigermeni precummateriifecale,secreiigenitale,alimente,probedinmediulexternetc. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimdoufrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracualbastrudemetilen (AM)irespectivGram.Listeriamonocytogenesseprezintcabacilisaucocobaciligrampozitivi, cudimensiunide0,55mm/0,50,8mm,dispuiizolat,nperechisaunlanuriscurte,intrasau extracelular.

3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Demenionatcsepoatemultiplicalatemperaturicevariazntre245C(temperaturaoptim fiindde2030C)nculturileiniiale,temperaturasczutfavorizeaz multiplicareaL.monocytogenes(mbogirelarece)tolereazoatmosferde510% CO2precumiconcentraiidepeste5%NaCl. ncazulp.p.necontaminate(snge,LCRetc)vomutilizaspreex.agarglucozatsautriptozat, suplimentatcu5%sngedeberbec.Atuncicnddorimsrealizmizolareaporninddelap.p. contaminate(alimente,materiifecaleetc)estenecesarsfolosimmediideculturselectivespre exemplunsmnminiialopartep.p.n9pridebulionpeptontriptoncuextractdecarnei drojdie,suplimentatcucuacidnalidixiciacriflaviniardup27(sauchiar30)ziledeincubarela temperaturafrigiderului,incubmnc1824deorela3537C.Ulteriorrealizmorepicarepemedii selective(ex.agar,acriflavin,polimixinB,clorurdelitiu,ceftazidimetc).Existialtestrategii folositepentruizolareaL.monocytogenes. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbacilifinisaucocobaciligrampozitivi,cudimensiunide 0,55mm/0,50,8mm,dispuiseparatsaugrupainpalisade,nperechisaunformdelitere (asemntorcorynebacteriilor).nculturiletinerepredominformelecocobacilarentimpcen culturilevechisecaracterizeazprinpleomorfismipotapreaformefilamentoase.npreparatul proasptsepoatedemonstramobilitatea,nspecialdacsameninutculturala1825C(saula temperaturacamerei). Caracteredecultur:Culturadegajunmirosdelapte acidulat.L.monocytogenesformeazcoloniidetipS.Dup12ziledeincubarela3537Cpeagar glucozat,coloniileatingundiametrude11,5mm(maimicipeagarultriptozat)potsaibaspect depicturiderou.Peagarsnge,coloniilesuntnconjuratedeozondiscretdebhemoliz. Dacnsmnmprinnepareocoloandemediusemisolid,datoritmobilitiivaaprea cretereanumbrel,caracteristicpentruL.monocytogenes.Multiplicarealatemperaturi extreme(245C)poatefiutilpentruidentificare. Caracterebiochimice: L.monocytogenesproduceozondiscretdebhemoliz. UtilizareaunortulpinistandarddeStaphylococcus aureus(pentruL.monocytogenesiL.seeligeri)saudeRhodococcusequi(pentruL.ivanovii)n cadrultestuluiCAMPesteutilpentruidentificare. L.monocytogenesestecatalazopozitivifermenteazoseriedecarbohidrai(fr produceredegaz). Sepotutilizatrusecomercialemanuale(ex.APIListeriasauAPI20Strep)irespectiv truseautomate(ex.rapidID32Strep)carepermitidentificareaL.monocytogenesn424deore,n funciedetrusautilizat. Caractereantigenice: Seutilizeazseruricuanticorpicunoscuipentruidentificareatulpinilor deListeriamonocytogenes,printehniciimunologice,nfunciedeAgsomaticesau flagelare.Serotipareaesteutilnscopepidemiologic.Exist13serotipuri(serovaruri)majoritatea

tulpinilorizolatelaomaparinndtipurilorIa,IbiIVb. Sensibilitatealabacteriofagi:Lizotipareaestefoarteutilnscopepidemiologicexist tulpinicarenupotfitestateprinaceastmetod. Caracteredepatogenitate:ngeneral,tulpiniledeListeriamonocytogenesizolatedela pacienisuntvirulente.nlaboratoaredereferinpotfiefectuatensitestedepatogenitate.Dintre acesteaovariantestereprezentatdecultivareanbuliontimpde24deore,urmatdeinocularea uneipicturideculturnsaculconjunctivallaiepuresaucobaitulpinavirulentvadetermina apariiauneiconjunctivitepurulenten13zile.Altemodalitidestudiereaviruleneitulpinilor izolatesuntreprezentatedeinoculrilaoareciimunocompromii(inoculareintraperitoneal)sau deinoculareamembraneichorioalantoidianaouluiembrionatdegin. Altetesterezervatecentrelordereferin:nscopepidemiologicsauncadrulunorstudii taxonomicesepotutilizaMultilocusEnzymeElectrophoresis(MLEE),analizamacrorestriciei ADN,RFLPsauRAPDPCR. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)poatefinecesariserealizeazdeobiceiprinmetodedifuzimetrice.ncazul infeciilorgravesevordeterminaCMIiCMB(vezicapitolul14).

42. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Mycobacterium

ElementeleminimenecesarestabiliriiaparteneneilagenulMycobacteriumsuntreprezentate de:1.rezistenaladecolorareacuacidalcool(baciliacidalcoolrezisteni,BAAR)2.prezenaunor acizimycolicicareconin6090atomidecarbonicarepotficlivaiprinpiroliznacizigraicu22 irespectiv26atomidecarbon3.unconinutprocentualdeG+Cde6171%. nafardeM.tuberculosisiM.leprae,aufostdescoperiteoseriedealtemycobacterii considerateanteriorsaprofitedarcarefiindcondiionatpatogene,suntrelativfrecventimplicaten patologiagazdelorimunocompromise(mycobacteriinetuberculoase,atipiceetc). Genulmycobacteriumincludepeste80despeciidiferite,multedintreacesteafiindlargrspndite nnatur.ncontinuarevomdiscutaaspectelelegatedediagnosticuldelaborator(microbiologic)n infeciileprodusedeM.tuberculosis,variantahominis. Tuberculozapoateavealocalizrivariate,darceamaifrecventntlnitestetuberculoza pulmonar.Dinpunctdevedereepidemiologic,pacieniicutuberculozpulmonar(careeliminprin sputBAAR)reprezintsursadeinfecieceamaiimportant.Diagnosticul,tratamentulcorecti completalacestorpacieniesteesenial. Diagnosticulpoatefisugeratdeelementeclinice,paraclinice(ex.radiologice),alteelementede laborator,dartrebuieconfirmatprinizolareaiidentificareaM.tuberculosis. Diagnosticuldelaboratormicrobiologicestenmodesenialbacteriologic,direct,lacaresepot

adugadateleobinutencadruldiagnosticuluiimunobiologiciserologic.Diagnosticuldelaborator bacteriologicincludeetapelecunoscute. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibiotice,ctmairapid icorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsiei antisepsieinclusivproteciapersonaluluimedicalimplicatetc).nfunciedeformaclinicde tuberculozsepotrecoltaurmtoareleprodusepatologice:sput,lichiddesplturbronic,LCR, urin,lichiderecoltateprinpunciearticular,peritoneal,pleural,pericardic,probeobinuteprin biopsie,puroietc.Uneoriestenecesarconcentrareap.p.princentrifugare.ncontinuarevom discutacazulncarep.p.estereprezentatdesput(veziicapitolul6).Sputatrebuie decontaminat(deex.printratarecuNaOH4%)ineutralizatnvedereabaciloscopieiicultivrii. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaaminimtreifrotiuridin produsulpatologicrecoltatitransportatcorespunztor,caresevorcoloracuAM,Grami respectivZiehlNeelsen.Frotiurileseexamineazlamicroscopulopticcuimersieisenoteaz prezenacelulelordelanivelultractuluirespirator(ex.macrofagealveolare),prezenacelulelor inflamatorii(ex.leucocite)iprezenaBAAR.nesuturileanimalelorbolnavebaciliituberculoi aparcabastonaesubiri,rectilinii,cudimensiuneade0,4/3,acidalcoolrezisteni(aparroiipe fondalbastru,toateceluleleibacteriilenonAARsuntcoloratenalbastru,lacoloraia ZiehlNeelsen),imobili,necapsulai,nesporulai.Sepoateutilizaicoloraiafluorescent.Examenul microscopicrmneoetapesenialndiagnosticuluneiinfeciimycobacterieneattnmomentul examinriiunuiproduspatologic(examenulmicroscopicdirect)ctinmomentulcndprin microscopieseconfirm(sauinfirm)morfologiaitinctorialitateamicroorganismelordintrocolonie izolat. Rezultateleexamenuluimicroscopic(coloraiefluorescentiZiehlNeelsen)trebuie cuantificateprinnumruldeBAARnraportcunumruldecmpuriexaminate(1030ncazul coloraieifluorescente,100300ncazulcoloraieiZN).Spreexemplu,prezenaa19bacili/10 cmpurinmicroscopiacufluorescenirespectiva19BAAR/100decmpurinmicroscopia opticpermitenotificareanbuletinuldeanalizaunuirezultatcu1+ntimpceprezenaa1090 bacili/1cmpnmicroscopiacufluorescenirespectiva19BAAR/1cmpnmicroscopia opticpermitenotificareanbuletinuldeanalizaunuirezultatcu3+(maximfiind4+,atuncicnd seidentificspreex.peste9BAAR/1cmplacoloraiaZN).Notaiasemicantitativeste obligatoriedeoareceexprimunitardensitateaBAARpefrotiuindiferentdemetodafolosit, permindcomparaiintrelaboratoarediferite,ntrebolnavidiferiiipentruacelaibolnavn momenteevolutivediferite.Dacrezultatulfinalestenedeterminattrebuiesfacemncunfrotiu dinacelaiproduspatologicisindicmrecoltareaunuinouproduspatologic.Baciloscopia negativnuexcludediagnosticuldetuberculoz. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobineoculturpur,caresevaidentifica.nmomentulactual,lanivelmondial,existomare varietatedemediidecultur.Mycobacteriilesedezvoltngeneralpemediicomplexe.Mediilede culturutilizatendiagnosticareauneiinfeciimycobacterienesempartn3grupeprincipale:medii deculturlichide(ex.bulion7H9),mediideculturpebazdeou(ex.mediulLwenstein)i mediideculturbazatepecompoziianagar(tipMiddlebrook).Pentruizolareaprimara mycobacteriilorsepotfolosimediifoartevariate,dinfiecaregrupmenionat.Mediilepebazdeou

aucaingrediente:ousauglbenudeou,findecartof,sruri,asparaginiglicerol.Mediul estesolidificatprincoagulare.Acestesubstanereprezintelementeledebazalemediuluiclasic LwensteinJensenlacareseadaugverdemalachitpentruselectivitate(nacelaiscopsepot adugaantibiotice).DezvoltareaM.bovis,M.africanumprecumiatulpinilordeM. tuberculosisrezistentelaHINestefavorizatdesuplimentareacu0,4%piruvatdesodiuamediului LwensteinJensen. Atuncicndncercmsrealizmizolareaprimar,estenecesarcamediiledecultursse incubezentroatmosferde810%CO2.Culturileseincubeazderutinlaotemperaturde 3537C.Mediiledecultursolidesevorexaminazilnicnprimasptmndupinoculareiarapoi sptmnalpnlamplinireaa6812sptmnideoarecemycobacteriiletuberculoaseauorat dediviziunede1227ore. Sepotutilizaisistemedecultivarerapid(ex.MBBact,Bactec)cudepistareacreterii mycobacterienen425dezile.nRomniaacestesistemeaunceputsfieutilizatenunele centrencepndcuanul1998.Acestesistemepermittestareasensibilitiilamedicamentele antimycobacterienepentrutulpinileizolate,conformrecomandrilorprogramuluinaional. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:nfrotiulrealizatdincoloniaizolatseevideniazBAAR Caracteredecultur:M.tuberculosisirespectivM..bovisBCGformeazcoloniiR, rugoase,neregulate,conopidiforme,grunjoase,greudeemulsionat,nepigmentate.TulpiniledeM. tuberculosisrezistentelaHINpotformacoloniidetipS. Caracterebiochimice:Identificareaspecieiserealizeazpebazaactevateste fenotipiceclasiceianume:testulproduceriideniacin,testulreduceriinitrailor,testulcatalazeila 22Cila68C,hidrolizatween80,susceptibilitatealahidrazidaacidului2tiofencarboxilic(TCH) isusceptibilitatealaacidulpaminosalicilic(PAS).Primele3testedaurezultatepozitivepentruM. tuberculosis(ntimpcepentruM.bovisnumaial3leatestestepozitiv).Testulcatalazeila68Ci respectivhidrolizaTween80suntnegativepentruambelespecii(hidrolizaTween80poatefipozitiv pentruM.tuberculosis).M.tuberculosissedezvoltpemediulcuTCHntimpceM.bovis(sauM. bovisBCGesteinhibatdectreaceastsubstan).Testulesteutilnspecialncazultulpinilor deM.boviscareprezintreaciipozitive(sauslabpozitive)laprimele2teste. Caractereantigenice:Sepotexaminancentredereferin. Caracteredepatogenitate:M.tuberculosisestepatogenpentrucobai.Inoculareap.p.la cobaiesteuneoripracticatnvedereadiagnosticului. Altecaractere/testeutilizatenidentificare:Sepotutiliza(lanivelulunorcentrede referin)testecaresebazeazpeproprietifenotipicemoleculare(ex.studiulcromatografical acizilorgraidinperetelecelular)saugenotipice(fragmentederestriciealematerialuluigenetic, sondenucelotidice,PCR).Existiposibilitateatestriisensibilitiifadeanumii mycobacteriofagietc. 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)poatefinecesariserealizeazconformrecomandrilorProgramuluiNaionalde controlaltuberculozei.Sepotutilizametodaconcentraiilorabsolute,metodaproporiilor,metoda rapoartelorderezisten,metoderadiometriceetc. Diagnosticulimunobiologicarelabazunmecanismderspunsimundetipcelular.Se

utilizeazintradermoreaciacutuberculin(PPD,derivatproteicpurificat),vezicapitolul21. Diagnosticulserologicsebazeazperspunsulimundetipumoral(anticorpii antimycobacterienipotfievideniaiprindiferitetehnici,deex.ELISA).Cutoatecmetodologianu esteperfectstandardizat,subliniemfaptulcndiagnosticultuberculozeiniciunelementnupoate ficonsideratcafiindlipsitdeimportanntrunanumitcontextclinic,paracliniciepidemiologic. *** Deinuamprezentatelementelenecesareidentificriimycobacteriilornetuberculoasedorims menionmc,ncazulutilizriiunuinumrredusdeteste,existrisculdeapuneundiagnostic eronatirespectivdeaconsideraotulpindreptMycobacteriumtuberculosis,cutoatecafost izolatomycobacterieatipic.

43. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Bacillus anthracis

GenulBacillusaparinefamilieiBacillaceaeicuprindeunnumrfoartemaredespecii,dintre carenpatologiesuntmaifrecventimplicateB.anthracis,B.cereusiB.subtilis.Germeniidin speciaB.anthracisseprezintsubformdebaciligrampozitivi,dedimensiunimari,imobili, sporulai,cusaufrcapsul.Suntaerobifacultativanaerobi. Manifestrileclinicealeinfeciilordeterminatedebacilulantraxuluisuntreprezentatede antraxulcutanat(formacelmaifrecventntlnitlaom),antraxulpulmonarirespectivantraxul gastrointestinalntoateformelepoateavealocdiseminareainfeciei.DemenionatcB. anthracisinfecteaznspecialanimaleleipoateproduceocazionalinfeciiumane.nultima perioadsediscutfrecventdespreimplicareaacestuimicroorganismnbioterorism. Diagnosticuldelaboratornantraxestebacteriologic,directitrebuierealizatctmairapid sunturmateetapelecunoscutedarexistanumiteparticulariti. Diagnosticulunuicazdeantraxpornetedeladatelecliniceiepidemiologice.Examenul bacteriologicvaconfirmadiagnosticul. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatcelmaifrecventdesecreiidelanivelul leziunilorcutanatedarsepotrecoltaiaspiratdinedemullocali/saudinganglioniiregionali, sput,materiifecale,alimenteincriminate,lichidcefalorahidian,probenecroptice,snge(pentru hemoculturi)etc,nfunciedeformaclinic.ncazulncareestedepresupuscp.p.este contaminatsepotfolosioseriedemetode,spreex.utilizareamediilorselective,tratareatermic sautratareacualcoolap.p.ncazulmediilorselective,agentulselectivmaifrecventutilizateste polimixinaB.ncazulceleideatreiavariante,utilizmetanolsterilde95.Vomsuspensionap.p. nproporieegalnetanolpentruoduratde3060minute,latemperaturacamerei,dupcarevom prelevacirca0.25mldinsuspensiepecareocultivmpemediuldeculturales.ncazulncare estimmctransportulctrelaboratorvaduramaimultde60minute,asigurmotemperaturde transportde28C.Trebuiesmenionmfaptulcatuncicndpresupunemdiagnosticulde

antrax,trebuieluatemsuridebiosecuritatespeciale. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunorfrotiuricarese coloreazcualbastrudemetileniGramcelpuinunfrotiusevapstraderezerv.Semaipot utilizaalbastrudemetilenpolicrom(McFadyean)saucoloraiaimunofluorescent,pentru evideniereacapsuleibacteriene.np.p.sepotremarcastructuritisulare,leucociteibaciligram pozitivi,cucapeteletiatedrept,dedimensiunimari(11,5mm/310mm),capsulai,dispui izolat,nperechisaulanuriscurte,incluintrocapsulcomun.ncoloraiacualbastrude metilenpolicrombaciliiaparalbatriiarcapsulaaparecaunhalodeculoareroz. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Putemutilizageloznutritivsaugelozsnge,ncondiiideaerobioz,laotemperaturde 37C(deisepoatemultiplicantre15i42C).ncazulncareestedepresupuscp.p.este contaminatsepotfolosimetodelemenionatemaisus.PentruizolareaB.anthracissepoatefolosi unmediucupolimixinB,lizozim,EDTAiacetatdethaliu,mediulPLET. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligrampozitivicudimensiunide11,5m/38m, formndlanurilungincepeprocesuldesporogenez(sporulesteoval,situatcentral,maimic dectgrosimeabaciluluirespectiv). Caracteredecultur: PemediisimpleproduccoloniidetipR,mari,cudiametrulde25mmmarginilesunt neregulate,cuprelungirilateralefilamentoasecareaupermisasemnareaacestoracucapulde meduzsaucoamadeleupemediilecusnge,poateapreaozondiscretdebhemoliz deinmodcaracteristicB.anthracisestenonhemolitic. Pemediispecialesepoatestimuladezvoltareacapsuleipolipeptidice(vezimaijos). PemediulPLETproduccoloniimici,detipS. Caracterebiochimice: Bacillusanthracisestecatalazopozitiv,producelecitinaziestesensibillapenicilin (fademajoritateaspeciilordingenulBacillus,rezistentelapenicilin)existialteteste biochimicecaresuntefectuatelanivelulcentruluidereferin Unaltcaractercaretrebuieinvestigatsereferlamotilitate,absentncazulB. anthracisiprezentlamajoritateaspeciilordingenulBacillus.nacestscopputemnsmnao coloandegelozmoale,cuincubarela37Cpentru14zileiurmrimdezvoltareaculturiifade traseulpecareamnsmnatasemntorcuinterpretareamediuluiMIUncazulenterobacteriilor Caracteredepatogenitate: Testareaproduceriicapsuleiinvitro,caracteristictulpinilorvirulentedeB.anthracisse poaterealizaprincultivare(repicare)peunmediucareconinebicarbonatdesodiu(0,7%),la37C inprezenaunuiprocentcrescutdeCO2dup24deore,tulpinilecapsulatevorproducecolonii mucoideiarprezenacapsuleisevademonstramicroscopic(ex.coloraiaMcFadyeansau Giemsa). Testareapatogenitiilaoarecelealb(vezicapitolul11) Testareasensibilitiilabacteriofagulg Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin:

diferitealtetestebiochimice examenemicroscopice(frotiuricoloratecunegruSudanpentruidentificareaprezenei globulelorlipidicedebhidroxibutirat) altetestepentrudemonstrareasensibilitiilapenicilin(ex.testulcolieruluideperle) tehnicialebiologieimoleculare(depistareaprezeneiplasmidelorpX01ipX02). 5.Antibiograma(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapice)nueste necesar.Bacillusanthracisestesensibillapenicilin,eritromicin,tetraciclin,cloramfenicol, ciprofloxacinetc. nceeaceprivetediagnosticulimunobiologic,nRomniaafostpuslapuncttehnicaIDRcu antraxin(BlteanuToma). Trebuiemenionatfaptulcestedeodeosebitimportanpunereadiagnosticuluideantraxla animale(nspecialierbivore),principalulrezervorpentruBacillusanthracis. nacestscop,sepotutilizattehnicialediagnosticuluibacteriologic(evideniereamicroscopic abacililornleziuni,obinereadeculturi,identificareaantigenelorprinreaciideprecipitaresau tehnicidetipELISApentrureaciaAscoli,vezicapitolul16)saualediagnosticuluiimunologic (intradermoreaciacuantraxin).

44. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Clostridium

GenulClostridiumincludepeste100despeciicaresegsescnintestinulanimalelorisepot eliminanmediulexteriorprinmateriilefecale,sporulnd.Suntbaciligrampozitivi(uneorila limit),dedimensiunimari,aezainperechisaulanuri,mobilicuciliperitrichi(cuexcepiaC. perfringens).Multedintrespeciisintetizeazexotoxine.nceleceurmeazvomdiscutadespre speciilecareproductetanos,botulismigangrenagazoas. TetanosulesteprodusdeClostridiumtetanipatogenprinmultiplicarelapoartadeintrarei toxinogenez(produceoexotoxinneurotrop).Neuroniimotorispinalisuntdeobiceiinhibaide ctregliciniacidulgaminobutiric.Toxinablocheazeliberareaacestormediatoriceeace determinexcitareaneuronilormotorispinali,cuapariiadespasmesevereidureroaseale musculaturiistriate(paraliziespastic).Contienaestepstrat.Toxinapoateajungelanivelul SNCiretrogradprinpropagarepecaleaxonaldelapoartadeintraresaupecalesangvin.Clinic, la45ziledelacontaminareaparspasmealemusculaturiidinzonacontaminat,apoiale muchilormasticatori,manifestateprintrismus(guranusemaipoatedeschide)ifaciesdetip risussardonicus(spasmealemusculaturiifaciale).Oricestimulexternprecipitunatacdetetanos. Moarteasepoateproduceprinasfixiemortalitateaestedecirca50%. BotulismulaparedeobiceipriningestiadealimentecareconintoxinaprodusdeClostridium botulinum,fiindotoxiinfeciealimentardetiptoxic(toxinpreformatnaliment).Toxinabotulinic esteceamaiputernicotravcunoscutdozaletalpentruomestedecirca12mg.Dup ingerare,toxinaseresoarbelanivelintestinal,ajungencirculaie,iarpeaceastcalelanivelul plcilorneuromotoriiundempiediceliberareadeacetilcolin(determinparalizieflasc).Paralizia

ncepelaextremitateacefalic(ex.paraliziamuchilorglobilorocularicareaparela1824oredela ingestieisemanifestprindiplopie)ievolueazdescendent.Decesulpoatesurveniprinasfixie (datoritparalizieimuchilorrespiratori).Botulismulinfantil(posibililaaduli)esteurmarea formriitoxineibotulinicepringerminarealanivelintestinalasporiloringerai.Mortalitatean botulismulneonatalestefoartemare.Botulismulplgilorpoateaprealapersoanecarefolosesc droguriinjectateintravenossauprezintleziunicontaminatecupmnt. Gangrenagazoasesteprodusdedousaumaimultedintreurmtoarelespecii:C. perfringens,C.novyi(C.oedematiens),C.septicum,C.histolyticumiC.sporogenes.Sporii clostridieniajunglaniveltisularprincontaminareaunorleziuni(traume).ncondiiideanaerobioz sporiigermineaz,formelevegetativesemultiplic,fermenteazzaharuriiaparegaz.Distensia tisular,obstruciamecanicastructurilorvascularenconjunciecusintezadetoxinefavorizeaz diseminareainfeciei.Enzimele(toxinele)produsecontribuieilaalterareagravastriigenerale. Gangrenagazoasestecaracterizatprinedemedure,crepitante(datoritprezeneidegaz)i necroz.Necrozatisularseextinde,multiplicareabacterianseamplific,apareanemie hemolitic,toxemieievoluie(n2080%dincazuri)ctredeces. naintedeadiscutactevaaspectelegatedediagnosticulinfeciilorprodusedeclostridiidorim smenionmfaptulcexistialtemicroorganismeanaerobedeinteresmedical(baciligram pozitivinesporulai,baciligramnegativi,cocigrampozitiviigramnegativi, spirochete).Diagnosticuldelaboratoralinfeciilorprodusedegermenii anaerobiestelaborios,costisitorideregulpoatefidefinitivatnumainlaboratoare specializatesuntnecesaredotrispecialeiunpersonalmedicalcuexperien. ncontinuarevomprezentactevaaspecteprivinddiagnosticuldelaboratorninfeciileproduse demicroorganismeledingenulClostridium. 1.Etapaderecoltareitransportap.p.esteesenialtrebuiemeninutecondiiile deanaerobioz. 2.Dinpunctdevederemacroscopicamputeamenionamirosulputridalp.p.,prezenaunor fragmentedeesutnecrotic,aunorsecreiideculoarenchis,existenadesngeipuroinplag etc. Examenulmicroscopicarerolorientativ(pentrumajoritatealaboratoareloresteiultima activitatecarepoatefirealizatatuncicndagentuletiologicesteunmicroorganismanaerob). C.tetaniaredimensiunide0,52mm/218mmipoateprezentaunsporrotundlocalizatterminal, C.botulinumaredimensiunide0,51,5mm/320mmipoateprezentaunsporovallocalizat centralsausubterminaliarC.perfringensaredimensiunide0,51,5mm/1,519mmipoate prezentaunsporovallocalizatsubterminal.Examenulmicroscopicpoatepermitenacelaitimpun controlalcalitiip.p.(evideniindprezenacelulelorinflamatoriiiacelulelorlezate)iarputeaservi laalegereaterapieiantimicrobiene. 3.Pentrucultivareap.p.vompregticelpuin3mediidecultur:bulionVF(viandefoi)cuacid tioglicolicialbastrudemetilen(caretesteazdigestiacrniidectreclostridii),mediulgeloz sngesuplimentatcuneomicin100mg/mlincubatnanaerobiozimediulgelozsnge incubatncondiiiaerobe.Pentrup.p.provenitedinabcesesaudinplgicaresugereazgangrena gazoasamputeafolosiimediulNagler(cuglbenudeou)carepermiteevaluareaproduceriide lecitinazilipaz. Pentruadistrugeformelevegetativeiareinesporiiputemprocedaaacumamartatn

capitolul10(tehnicideizolarespeciale). Incubareancondiiideanaerobiozdureaz2448deorela3537C. naintedeatrecelaetapadeidentificaretrebuiesncercmsdovedimcamizolatgermeni anaerobiisverificmpuritateaculturiicareurmeazafiidentificat.ncondiiilencarep.p.a fostnsmnatpe2plcicugelozsngeincubateaerobianaerob,esteutilsrealizm examenulmicroscopicalcoloniilor.Dacaparcoloniiasemntoarenambeleplciiardinpunct devederemicroscopicprezintcaracteresimilare,estevorbademicroorganismefacultativ anaerobe.Dacpefrotiuriledincoloniileizolatepemediulincubatnanaerobiozaparialtetipuri morfologice,nseamncexistmicroorganismestrictanaerobe.Pentruaverificapuritateaculturii obinute,naintedeatrecelaetapadeidentificare,repicmcoloniilesuspectenbulionVF regenerat(prelevmcoloniaprindecuparecugelozasubiacent).Incubmtimpde24orela3537 C.ncazulncareexistmultiplicarebacterianprocedmlaa.realizareaunuifrotiucoloratGram (icomparmrezultatelecuceleobinuteanterior)b.repicareapeopantdegeloznutritivcu incubarenaerobioz(nutrebuiesaparculturbacterianncazulncarebacteriileizolate anteriorsuntanaerobe).Dacrezultatelesuntcorecte,trecemlaidentificareamicroorganismelor. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere,aacumamdiscutatincapitoleleprecedente. Caracteremorfotinctoriale:Suntbaciligrampozitivicudimensiunilemenionatemaisus. nculturinvechitebacteriilepotfigramnegativeisepotdetectaendosporii(deformeazbacilii).n cazulncarelaexamenulmicroscopicnuevideniemsporivomrepicapemediulNagler,cu incubare48deorela3536Ciapoilatemperaturacamerei.Urmrimsporulareapeunnoufrotiu coloratGram.Putemevaluafenomenuldesporogeneziprinmetodedecultur(vezimaijos). Caracteredecultur:Speciilemobile(mareamajoritate)formeazlasuprafaamediului coloniidetipS,cumarginiondulate,neregulate,cutendindeinvadareamediului(datorit mobilitii).njurulcoloniilorremarcmprezenabhemolizei.Dacaavutlocinoculareain profunzimeamediului,coloniileauaspectpufos.Clostridiumperfringens(speciaimobil)formeaz coloniidedimensiunimari,detipS,rotunde,cumarginiregulate,convexedarcarepotaveai aspectrugos.Majoritateatulpinilorproduchemolizdubl(zonaintern,debhemoliz,estemai ngustntimpcezonaextern,deahemolizestemailarg)existitulpinicareproduczone foartelargidehemolizprecumitulpinislabhemolitice.Aacumammenionat,princultivare putemsevalumfenomenuldesporogenez(cunoscutfiindcsporiirezisttimpde10minutela temperaturade80C).DacpefrotiuldinculturcoloratGramnuevideniemspori,pregtim2 tuburicubulionpepton,glucoz,amidoniextractdelevur.Repicmcoloniilesuspectencele2 tuburiiarunuldintretuburinsupunemuneitemperaturide80C,10minute.Incubmcele2tuburi la3537Cpnaparemultiplicareabacterian.Dacbacteriilesedezvoltnambeletuburi,am doveditexistenasporilor.Dacdupoincubaredecelmult10zilenuaparemultiplicarebacterian ntubulsupuslatemperatur,nuexistspori. Caracterebiochimice:Existnumeroasecaracterebiochimicecarepotfiutilen difereniereaspeciilordeclostridii. nidentificareamicroorganismelordinacestgenutilizminiialtestareaproduceriide lecitinazilipaz.PemediulNaglerinoculmtulpinanstriu(sepottestaconcomitentmaimulte tulpini).Pentruapreciereaproduceriidelecitinazincubareadureaz48deore.ncazulncare testulestepozitiv(precipitatopacnmediuldinjurulstriuluidecultur)poatefivorbadeotulpin

deC.perfringens.TestulestenegativpentruC.tetanisaupentruC.botulinum.Pentrutulpinile lecitinazpozitive,lanivelulcentruluidereferinsemaipottestamobilitatea,fermentarealactozei, producereadelipaz,ureaz,hidrolizagelatinei,digestiacrniietc.Pentruapreciereaproduceriide lipazincubareadureaz1sptmn.ncazulncaretestulestepozitiv(filmperlat,iridescentla nivelulstriuluideculturinmediuladiacent)poatefivorbadeotulpindeC.botulinum.Testul estenegativpentruC.tetaniiC.perfringens. Testulplcilorsemineutralizatepoatefipracticatlanivelulcentruluidereferin.Folosim oplaccumediulNagler.Pejumtatedinplacetalmantitoxin(lecitinaz).Dupuscareaplcii inoculmnstriuriotulpinmartorpozitiv,otulpinmartornegativictevatulpinidetestat. Incubmtimpde1824deorela3537Cnanaerobioz.C.perfringens(caitulpinaM+)dun rezultatpozitivdoarpejumtateadeplacfrantitoxin. Cretereanlapteturnesolatsaucubromcrezolpurpur(C.perfringensproducecheag alveolarnlapteleturnesolat). Clostridiilesuntsensibilielavancomicinirezistentelacolistin.Aliautoripropun testareasensibilitiilametronidazol. Caractereantigenice:potfitestatencentreledereferin. Altetestecarepotfiefectuatelanivelulcentrelordereferin Demonstrareaprezeneitetanospasmineiprinseroneutralizarelaoareci(unanimaleste protejatcu12orenaintedetestprininjectaresubcutanata1000deUAIdeantitoxintetanic injectmlaambeleanimale0,5mldinculturapemediulichidanimalulprotejatsupravieuiete,iar cellaltvaprezentasemnetipicedetetanos) Testarea(laom)aprezeneiantitoxineitetanicentitruriprotectiveprinELISAsau hemaglutinare(T0,01UAI/ml). Demonstrareaprezeneitoxineibotulinicenalimente,materiifecale,sersaunmediide cultur.Spreex.prelevmdinbulionulVFpecareamidentificatmultiplicareabacterian, centrifugmiarsupernatantullmprimn2tuburi.Unuldintretuburilsupunemtemperaturiide 100C(toxinabotulinicestetermosensibil).Inoculmintraperitonealp.p.ladouloturide oareci.Dacoareciiinjectaicup.p.inactivattermicmor,nuestevorbadetoxinabotulinic. Urmrimoareciitimpde24zilepentruaremarcaapariiasemnelordebotulism(reducerea mobilitii,respiraiiample,contraciialemuchilorabdominaliurmatedeconvulsiiideces). Prezenatoxineibotulinicepoateficonfirmatprinseroneutralizare(protejmspreex.unanimalde laboratorcuantitoxindetipAiunaltanimaldelaboratorcuantitoxindetipBdupcarei injectmcup.p.respectivdacanimalulseroprotejatcuantitoxinadetipAsupravieuieteiar cellaltanimalmoarecusemnecaracteristicepentrubotulism,nmediuldeculturaexistatC. botulinumdetipA) Titrareatoxineibotulinice,prinmetodaDL50(folosindinjectareap.p.nvenacoziii curbestandardpentruinterpretare,pentrufiecareserotip) TitrareatoxineibotuliniceprintrotehnicdetipELISA(poatedetecta10pg) Testulinhibiieisialidazei,pozitivn26orepentruC.perfringensetc. 5.Antibiogramaderegulnuserealizeaz.Clostridiilesuntsensibilelapenicilin, cefalosporine,vancomicin,tetracicline,metronidazoletc,nstratamentulestemultmaicomplex nuneledintrebolileclostridienenuafosteficacitateatratamentuluicuantibioticesau chimioterapicenuafostdovedit.

45. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Treponema

OrdinulSpirochaetalescuprindedoufamiliiimportantenpatologiauman, familiaSpirochaetaceae(ncaresedescriugenurileTreponemaiBorrelia)i familiaLeptospiraceaecuunsingurgen,Leptospira.GenulTreponemaincludespeciaTreponema pallidumcupatrusubspeciicareproducinfeciilaom.Treponemapallidumsubspeciapallidumeste agentuletiologicalsifilisului. Sifilisulpoateficongenitalsaudobndit.ncazulsifilisuluidobnditexistmaimultestadii, respectivstadiulprimar,stadiulsecundar,stadiullatent(recent,tardivsaudeduratnelimitat)i stadiulteriar.nstadiulteriar,nfunciedeorganelesausistemeleafectateputemdiscutadespre afectareanervoas(neurosifilis),cardiovascularetc.nmodparticularsediscutsifilisul congenital,sifilisullagravideisifilisulaprutlapacieniiinfectaicuHIV. InfecianaturalcuT.pallidumestelimitatlagazdauman.Infeciasetransmitedeobicei princontactsexual,iarleziuniledeprimoinfeciesuntcantonatelanivelultegumentelori mucoaselordinzonagenital.Totuin1020%dincazuri,leziunileprimaresuntlocalizatela nivelrectal,perianalsauoral.Spirochetelesemultipliclocallapoartadeintrare,iaruneletrecde barieraganglionilorlimfaticiiajungncirculaie.n210sptmnidelainfecie,laloculinoculrii sedezvoltopapulcaresedeprimpentruaformaoulceraiecubazacurat,indurat(ancru dur)lanivelulcreiasegseteunlichidclar,nsfoartebogatntreponeme.Aceastleziune primarsevindecntotdeaunaspontan,dardupcirca210sptmniaparleziunile secundare,careconstaunleziunieritematoasemaculopapularelocalizateoriundepecorpi papuleumede,palide(condiloame)nregiunileanogenital,axilarincavitateabucal.Pot apreadeasemeneameningita,corioretinita,hepatita,nefritasauperiostitasifilitic.Leziunile secundareseremitielespontan.Attleziunileprimare,cticelesecundaresuntbogaten spirocheteifoartecontagioase. nceleceurmeazvomabordadiagnosticuldelaboratorncazulsifilisuluiprimarsau secundar.Diagnosticulpornetedelaelementecliniceiepidemiologice,dartrebuieconfirmatprin metodedelaborator. Diagnosticuldelaboratornsifilispoatefibacteriologic(direct)sauserologic. Diagnosticulbacteriologic Treponemapallidumnupoateficultivatpemediiartificiale,nlaborator.Dinacestmotiv, diagnosticulbacteriologiccuprindenumaiprimeleetapedinstructuraclasicaschemei diagnosticuluidirect.Diagnosticulbacteriologicpoatefirealizatattnsifilisulprimarctin sifilisulsecundar. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei,avndoseriedeparticulariti.Produsulpatologicpoatefireprezentatde

lichidulclar(serozitatea)delanivelulleziunilorprimarenfunciedelocalizare(penian,cervical, vaginal,perianaletc),delanivelulleziunilorsecundare(condilomalata,rozeolesifiliticeetc),dela nivelulunorleziuniumedebogatentreponemencazulsifilisuluicongenitaltimpuriusaupoatefi prelevatdinganglioniilimfaticiregionali.ncazulancrului,vomrecoltap.p.dupndeprtareacu grij(fraproducesngerare)acrustelorcareacoperleziunea.Arputeafinecesars comprimmbazaleziuniipentruastimulaacumulareadelichid(clar)dincarevomefectua23 preparatemicroscopice.Prelevmlichidulfiecuajutorulanseibacteriologice,fiecuajutorulunei pipetePasteur,fieaplicndpurisimplulamadesticlpeleziuneaumed.Acoperimcuolamel ieliminmprinuoarapsareeventualelebuledeaer.Transportultrebuiesfierealizatfoarte rapid,depreferatnmaxim20deminuteastfelnctserecomandcarecoltareasfierealizat ntrunspaiucorespunztor,nimediatavecintatealaboratorului.Esteoetapesenial. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicsepoaterealizafiecuajutorul microscopuluicufondntunecat,fieprinimunofluorescendirect(existialtetehnici,carenuvor fidiscutatenacestmanual). Pentruexamenulmicroscopicpefondntunecat,pregtim2lame(preferabil3) pentrufiecareleziunepecaredorimsoexaminm.Preparatelenutrebuiesconinhematii, leucocite,fragmentedeesutsaubuledeaer.ntimpceexaminmprimulpreparatmicroscopic vomintroducecelelalte2preparatentrocutiePetrincareexistpuinvatsauhrtiedefiltru umezit,pentruapstraatmosferaumediapreveniuscarea.Preparatulmicroscopictrebuie examinatsistematic(minim10minutencazulunuirezultataparentnegativ),iniialcuobiectivul uscat,ulterior,dupvizualizareaunormicroorganismecareparsaparingenuluiTreponema,cu obiectivuldeimersie.Estenecesarcaexaminatorulsaibexperiennacesttipdeexaminare. Microorganismelecaracteristicesuntfoartesubiriilungi(0.250.3mm/614mm),spiralate, prezentnd814spire(regulate,strnse,adnciirigide),mobile(spirelenusedeformeaz), deplasareancmpulmicroscopicnuestefoarterapiddarseamncuomicaredenurubare (existimicroorganismecaresuntimobiledarpstreazmicriledetranslaie,rotaielent, flexieuoardelauncaplacellaltsauflexiemediancurevenirecaunresort),luminoasepe fondulnegrualcmpuluimicroscopic.ncazulunuirezultatnegativputemrepetarecoltareai examinarea,nanumitesituaiisepoaterecomandancepereatratamentului,iarevoluiavafi monitorizatcliniciserologic(rezultatulnegativnuelimindiagnosticuldesifilis).Rezultatul pozitiv,atuncicndpoatefiexclusprezenaunortreponemesaprofite,punediagnosticuldesifilis primarnaintecaanticorpiispoatfidetectaiserologic. ImunofluorescenadirectpermitedifereniereaT.pallidumdealtetreponemecu ajutorulanticorpilormarcaifluorescent(reacieAgAc)unaltavantajestereprezentatdefaptulc nuestenecesarcatreponemelesfiemobile.nplus,pentrucreaciaestespecific,sepoate utilizacusuccesincazulunorleziunifoarteprobabilcontaminatecutreponemesaprofite(ex. orale,rectale).ncazulncareexaminareanupoatefirealizatimediatsecreiapoatefirecoltat ntruntubcapilarcaresenchidelaflacripoatefitransportatla+4Calternativputemrealiza frotiul,ateptmsseusucenvecintateabeculuidegaziputemsltrimitemctrelaborator. Frotiulpoateficolorat: cuAcantiT.pallidumobinuidelapacienicusifilissaudelaiepuriinfectaicuT. pallidumserulestetratatpentrucretereaspecificitiicutulpinaReiter(otulpinnepatogendeT. phagadenis)iarAcsuntapoimarcaicuizotiocianatdefluoresceinsau

cuAcmonoclonaliantiT.pallidumsubspeciapallidummarcaifluorescent. Subliniemncodatimportanaexamenuluiclinicurmatderecoltarea,transportuli examinareamicroscopicap.p. nlaboratoareledereferinarmaiputeafiutilizateialtemetodenscopdiagnostic(mairar) saupentrucercetare. Inoculareap.p.laanimaledelaboratorreprezintceamaisensibilmetodpentru detectareaT.pallidum.Pentrumeninereanlaboratoraunortreponemeviabilesaupentru determinareainfectivitiiaufostutilizatediferiteanimale(hamsteri,cimpanzeietc)nscelmaiutil esteiepurele.Iepurelepoatefiinoculat(intratesticularsaucutanat)cuoricetipdep.p.cucondiia cantremomentulrecoltriiiinocularesnutreacmaimultde60minute.ncazcontrar,p.p. trebuieadusrapidlaotemperaturdecelpuin78C(ex.nazotlichid)imeninutastfelpnn momentulinoculrii.Testulinfectivitiilaiepure(RIT)rmnemetodastandardcuajutorulRITse apreciazsensibilitateaispecificitateaoricreialtemetodecareestepropuspentrudiagnosticul sifilisului. ncentreledereferinaumaifostutilizateitehnicialebiologieimoleculare(sondele nucleotidice,PCR).TehnicaPCRarputeaaveautilitateadiagnosticatuncicndp.p.este reprezentatdelichidulamniotic. Treponemapallidumipstreazsensibilitatealapenicilin,medicamentcarermnede eleciepentrutratamentulsifilisului.Existioseriedealternative,dardorimssubliniemcn vedereatratamentuluiacesteimaladiitrebuierespectaterecomandrilefcutedectrecomisiade specialitateaministeruluisntii,pentrufiecareformdesifilisnparte. Diagnosticulserologic Diagnosticulserologicserealizeazfolosindantigenenontreponemicei antigenetreponemice.Testelenontreponemice(nespecifice)itreponemice(specifice)sunt complementarenuseexclud.Testelenontreponemicesuntutilizatenscreening,diagnostici monitorizareapacienilorncursultratamentului.nvedereastabiliriidiagnosticuluivomutilizai testeletreponemicencorelaiecucelenontreponemice(niciunuldintreceledoutipurinupot acoperidinpunctdevederediagnostictoatestadiilesifilisului).CelmaifrecventutilizmVDRLsau RPR(dinprimacategorie)cuplatcuTPHAsauFTAAbs(dinadouacategorie).Deobiceiutilizm serulprovenitdelapacientulsuspect,darnanumitesituaiitestulesterealizatfolosindplasmsau LCR. A.Reaciiserologicecareutilizeazantigenenontreponemice Antigenelenontreponemicesuntlipidecarepotfiextrasedindiferite esuturi.Cardiolipinaesteundifosfatidilglicerol.Pentrucretereasensibilitii,cardiolipinaeste cuplatcucolesterolilecitin.Anticorpiianticardiolipinaufostnumiireagine.Suntdepistain serulpacienilorla23sptmniinLCRla48sptmnideladebutulinfeciei,ncazurile netratate. ReaciadefixareaacomplementuluiBordetWasserman(RBW)afostutilizatolung perioaddetimp,ncepndcu1906.DatoritfaptuluicRFCesteometodlaborioasinspecial datoritapariieiunoraltetehnici,RBWestediscutatnprezentdinpunctdevedereistoric. TehnicaactualstandardesteVDRL(VeneralDiseaseResearchLaboratories),untest defloculare.Testeledeflocularesebazeazpefaptulcparticuleleantigenicermndispersaten serulnormal,darformeazgrunjivizibiliatuncicndsecombincureaginele.Testelesepreteaz

laautomatizareilafolosireapentruscreeningdatoritcostuluiredus.Ovarianteconomici elegantestemicroreaciaVDRLcaresepracticnplcicugodeuri. AgtipVDRLsepreparconformrecomandrilorproductorului. Pregtireaseruluidecercetatincludecontrolulaspectuluiserului(seclarificprin centrifugare),inactivareatimpde30minutela56Cionoucentrifugare(ncazulapariieiunor particulensuspensie).Nuvorfitestateserurileinfectatesauhemolizate.ncazulncaretrecmai multde4oredinmomentulinactivrii,serulvafiinactivatdinnoutimpde10minutela56C. Temperaturadincameradelucrutrebuiesfientre2329C.Testulseefectueazpe sernediluat(pentrumonitorizareaevoluieisubtratamentsepotfacediluiibinare).Sepottestamai multeseruriconcomitentiestenecesaronotareclaragodeurilor,pentrufiecaregodeunparte. Fiecaretestvaincludemartori(seruricureactivitatecunoscut,martorpentruAg).nfiecaregodeu punemcte0,05mlser(ngodeulpentrumartorAgpunemsoluiesalinfiziologic).Dupagitarea flaconuluicususpensiaantigenic,utilizndoseringcuaccalibratdepunemcteopictur(1/60 ml)nfiecaregodeu.Acoperimplacaioaezmpeunagitatorcarepoatefireglatla180turaiipe minut,peoduratde4minute. Citimimediatrezultatul,printransiluminarepefondnegru,cuajutoruluneilupe, ncepndcumartorii(negativ,slabpozitiv,pozitiv,martorulpentruAg)icontinundcuserurilede testat. Rezultatulestenegativdaclichidulnuprezintflocoaneiesteasemntormartorului negativimartoruluiAg.Rezultatulesteslabpozitivatuncicndvizualizmflocoanededimensiuni micintrunlichiduorturbidntimpcerezultatulesteintenspozitivatuncicndvizualizmflocoane dedimensiunimariiarlichidulesteclar.Repetmrezultateleslabpozitivesaudificildeinterpretat. ncazulncaresuspicionmexistenafenomenuluideprozon(inhibiiatotalsaupariala floculriiprinexcesdeAc),vomrepetatestareasevarepetapediluiideser. Rezultatulnegativnuelimindiagnosticuldesifilispacientulsepoateaflanperioada deincubaiesaupoateficazulunuisifilislatent(evideniabilprinTPHA).ncazulunuipacient suspectpentrusifilisprimar,repetmtestuldup1sptmn,1lunila3luni. Vomluanconsiderareunrezultatpozitivncorelaiecurezultatulobinutlatestul treponemic,rezultatuldiagnosticuluibacteriologic,elementelecliniceiepidemiologice.Unrezultat pozitivncondiiilencaretoatecelelaltedatesuntnegativeestedeobiceiunrezultatfalspozitiv. Potaprearezultatefalspozitivelapersoanecuhepatitviralacut,pneumoniivirale,rujeol, malarie,mononucleozinfecioas,alteinfeciivirale,lapersoanecareaufostrecentvaccinate, precumilapersoanecubolialeesutuluicolagen,persoanecaresedrogheaz,lapersoanelen vrstetc.Reaciilefalspozitivepotapreaipeparcursulsarcinii. TestulVDRLsemicantitativ,efectuatpe2probeconsecutivedeseresteutiln urmtoarelesituaii:scdereade4oriatitruluinsifilisulrecent,tratat,semnificderegul eficacitateatratamentuluicretereade4oriatitruluisugereazoinfecieactivnevoluie,o reinfeciesauineficacitateatratamentului. Altetestedefloculareutilizatenpractic TestulRPR(RapidPlasmaReagin)esteexecutatpecarduridinmaterialplasticpe careaparmaimultecercuride18mm.Antigenulestepreparatdintrosuspensieantigenictip VDRLmodificat(pentruaeliminaetapadeinactivareprincldur).Reactivulconineiparticulede crbune.AntigenulRPResteamestecatcuseruldecercetatncerculdepecard.DacaAcantiT.

pallidumsuntprezeni,secombincuparticulelelipidicedinAgiproducaglutinarealor. ParticuleledecrbunecoaglutineazcuAciduclaapariiaunorgranulenegrepefondulalbal cardului.nabsenaAcrezultunaspectgriuniform.Testulsepoaterealizacalitativicantitativ (diluiideser). TestulRST(ReaginScreenTest) TestulUSR(UnheatedSerumReagin) TestulTRUST(ToluidineRedUnheatedSerumTest) AfostpuslapunctiotehnicdetipELISAcuacesttipdeantigene. Moduldeinterpretarealtestelornontreponemicedepindeidepopulaiacareeste testat B.Reaciiserologicecareutilizeazantigenetreponemice Aufostrealizateitehniciserologicecareutilizeazantigenetreponemiceextrase dinT.Reiter(specificedegrup)detipulRFCiCIE. Deutilitatepracticsuntreaciileserologicecareutilizeazantigenetreponemice extrasedintulpinaNicholsdeT.pallidum,cuomarespecificitate. Pentruolungperioaddetimp,tehnicastandardafosttestulimobilizriitreponemelor (TPI).Tehnicaafostpuslapunctnanul1949.Seruldecercetateradiluatiamestecatcu complementitreponemevii,mobile,obinutedinancrultesticulardelaiepure.nprezenaAc specifici,treponemeleerauimobilizate,ntimpcenlipsaacestora,mobilitateaerapstrat (examinareasefceacumicroscopulpefondntunecat). Testeledeimunofluorescenindirect(FluorescentTreponemalAntibody,FTA)au nceputsfieutilizaten1957,seruldecercetatfiinddiluat1/5.Datoritrezultatelorfalspozitive, ulteriorsatrecutladiluarea1/200aserului(FTA200).Din1962anceputsfieutilizattehnicape careoavemladispoziieiastzi,FTAAbs.PorninddelatulpinaReitersaobinutprin ultrasonicareunextractantigenic,pentruandeprtaAccarenusuntspecificipentruT.pallidum. Probeledeseri/sauLCRdelapacienisuntdiluate1/5cuunextractcareconineAgtreponemice degrup(Reiter),comunetreponemelorpatogeneicomensale.AstfelsuntnlturaiAcnespecifici. ExistlamepecareafostfixattulpinaNicholsdeT.pallidum.Probeledeseri/sauLCR absorbiteimartoriicorespunztorisedepunpespoturiledepelam.Dacnser/LCRexistAc specifici,acetiasevorlegadetreponemelefixatepelamformndcomplexeantigenanticorp. Dupndeprtareamaterialuluinelegatprinsplrirepetate,Aclegaisedetecteazprinincubare cuunconjugatfluorescentantiIgumane.Dupndeprtareaprinsplareaconjugatuluinelegatde complexeleantigenanticorp,lameleseexamineazlamicroscopulcufluorescen(UV).ncazuln careseruldecercetatestepozitiv,treponemeledepelamaparfluorescente(galbenverzui). Testuldehemaglutinare(TreponemapallidumHemagglutinationTest,TPHA)afostpus lapunctnurmcu30deani.nprezenaunorAcfadeAgadsorbitepemembranalor,hematiile aglutineaznreelecaracteristiceformatedincomplexeimune.Agtreponemicesteextrasdin tulpinaNicholsiadsorbitpesuprafaahematiilordeoaiesaupasrefixate(hematiisensibilizate). DreptmartorsuntfolositehematiifrAgtreponemice(nesensibilizate).ncazulncarenserulde cercetatsuntprezeniAcantiT.pallidum,hematiilesensibilizateaglutineazhematiile nesensibilizatenuaglutineazisedepunsubformaunuibutonpefundulgodeului.Pentru cretereaspecificitii,majoritateatruselorcomercialeincludndiluentunextractdetreponeme nepatogene.Testulpoatefirealizatcalitativsausemicantitativ(diluiialeseruluidecercetat).

Existmetodeautomate,utilizatepentrutestareasngeluidonat. TehnicaELISA TehnicaELISApentrudetectareaAcdetipIgMantiT.pallidumesteutilpentru documentareainfecieintrauterine. TehnicaWesternblotpoatedetectaattAcdetipIgMctidetipIgG. Aacumammaimenionat,interpretarearezultatelorobinutesefaceinndcontdecontextul clinic,epidemiologicidelaborator.Lundnconsiderarenumairezultateledelaboratorpentru testelemenionatenacestcapitol,arputearezultamaimultevariante.Spreexemplu,dactestul VDRLestenegativitestulTPHAestetotnegativ,deregulinfeciaesteexclus.Dacnegndim cpacientulesteladebutulboliiiaranticorpiisuntncnedectabili,repetmtesteledup3 sptmni.ncazulncaretestulVDRLestepozitiviartestulTPHAestenegativ,esteposibilsne aflmnsituaiademaisus,ladebutulboliiirepetmtesteledup3sptmni.Dacrezultatele rmnnemodificate,estevorbadeoreaciefalspozitiv.Potfiluatendiscuieialteposibiliti.

46. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Leptospira

GenulLeptospiraincludemaimultespecii,dintrecaremaicunoscutesuntL.interrogansiL. biflexa.Leptospirelesuntspirochetefoartemobile,descriindmicrideburghiuimprimatede dispoziiaparticularaflagelilor,cudimensiunide0,1mm/615mm,prezentnduncrliglaunul saulaambelecapete.ncadrulspecieiLeptospirainterrogansexistpeste218serotipuri (serovarurinterminologiaanglosaxon,deex.L.icterohaemorrhagiaeunserovarincludemai multegrupe)carepotdeterminaboalalaanimaleiaccidentallaom.SpeciaLeptospira biflexareunetepeste63deserotipurisaprofite. L.interrogansestepatogenprinmultiplicareiinvazivitate.Leptospirozasecaracterizeaz prinpolimorfism,peparcursulevoluieiaspectulclinicputndusemodifica.Dupoperioadde incubaiede12sptmni,debutulboliipoatefimarcatdefebr,perioadncareleptospiraeste prezentnsnge.Microorganismulsecantoneazapoinorganeleparenchimatoase(ficati rinichi),nformaceamaigrav(sindromulWeil)putnddeterminaapariiadeicter,hemoragii, necroztisularidisfunciideorgan.Boalaestefrecventbifazic(dupoameliorareiniial urmeazfazaadouaaboliiremarcndusecretereatitruluideanticorpidetipIgM).Infecia leptospiroticpoateconducerelativfrecventlameningitaseptic(culichidclar). Diagnosticuldelaboratornleptospirozpoatefibacteriologici/sauserologic. Diagnosticulbacteriologicesterelativdificil,laborios,respectndetapelecunoscuteiestecel maifrecventrealizatlanivelulcentruluidereferin. Diagnosticulpornetedelaelementecliniceiepidemiologice.Diagnosticulbacteriological leptospirozeiestelaboriosicostisitor. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile

cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.ProdusulpatologicpoatefireprezentatdesngesauLCR(nprimele710 zile),urin(dup9ziledeladebutpnla28sptmnideboal),darsarputearecoltailichid peritoneal,pleuraletc.Datoritfragilitiileptospirelorifenomenuluideautoliz,transportultrebuie sfierealizatrapid,nmaxim13ore,latemperaturacamerei. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunuipreparatproaspt (frafolosinslamela).Preparatulseexamineazlamicroscopulcufondntunecat.Existo seriedeproceduriutilizatepentrupregtireapreparatului.ncazullichiduluiperitoneal,LCRetc, produsuldecentrifugheazla1.500gpentruoduratde30minute,utilizndusesedimentul obinut.ncazulsngelui,recoltareasefacepeanticoagulant(darnucucitrat),urmndoprim centrifugarela500gpentruoduratde5minute.Prelumsupernatantulpecarelcentrifugmla 1.500gpentruoduratde30minuteiutilizmsedimentulobinut.nacestecondiii,unmedic microbiologcuexperienarputeastabilidiagnosticulprezumtiv.Leptospireleaparcafilamente luminoase,spiralate,foartemobile,cumicridenurubareiflexiune,daricuouoar deplasarenspaiu,pefondulnegrualpreparatului. UniiautorirecomandrealizareadefrotiuricolorateGiemsaprelungitsauprinimpregnare argentic(FontanaTribondeau),maialespentrupreparatelehistopatologiceleptospireleaparca filamenteregulatspiralatecuextremitilefinngroatesubformdebuton,deculoaremaro.A fostrecomandaticolorareaimunofluorescent(IFdirect)ncazulsuspicionriidiagnosticuluide leptospiroz.nultimaperioad,porninddelap.p.(ser,urin,LCRetc)aufostpuselapuncttehnici PCR. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeazdificil,cucosturiridicate, datoritsensibilitiinmediulexterniparticularitilordemultiplicarealeptospirelor.Deregul cultivareasefacelanivelulcentruluidereferinutilizndmediideculturlichidenuobinemcolonii izolate. Existiposibilitateainoculriip.p.lacobaisaualtanimaldelaborator,intraperitoneal.Starea clinictrebuiemonitorizatzilnic.Identificareainfecieisepoatefaceprindiagnosticserologic,prin izolarealeptospirelor(hemocultur)sauanatomopatologicibacteriologicdupdecesulsau sacrificareaanimaluluirespectiv. ncazulutilizriimediilordeculturesterecomandatcatoatep.p.sfiensmnateattpe mediideculturselectivectineselective.MediuldeculturcelmaicunoscutestemediulKorthof (cuaciziialcooligrai,careconineiserdeiepure),pregtindnacestscopmaimultetuburin carensmnmcantitiprogresivedep.p.(ex.pornimdelaopictur,continumcu2picturi etc).Mediileselectiveincludneomicini/sau5fluorouracil. Realizmincubareala28C.Multiplicareabacteriannudeterminotulburareamediului (apariiaturbiditiireprezintcelmaifrecventocontaminarecuoaltbacterie).Dup3zile, respectndcustricteenormeledeasepsie,realizmpreparatenativepecareleexaminmla microscopulcufondulntunecat.ncazulncarerezultatulestenegativ,repetmaceast examinarelaintervaldecirca3zilepentruodurattotaldeminim4sptmni,saupnla obinereaunuirezultatpozitiv.ngeneralcretereabacterianarelocn314ziledelamomentul nsmnrii. Costuliduratadiagnosticuluicrescidatoritfaptuluic,pentruidentificaresuntnecesarecel puin12repicripeunaltmediulichid,dupdetectareamicroscopicaunormicroorganismecare

arputeafiimplicatepatogenic.Oalternativ(imaicostisitoare,utilizatmaialesdac presupunemcontaminareaculturiicuoaltbacterie)estereprezentatdeinocularea intraperitonealaculturiirespectivelacobai.Dup3060minute,avndnvederefaptulc leptospireleinvadeazsistemulcirculatormairapidncomparaiecualtebacterii,dup anesteziereaanimaluluiserecolteazsnge(prinpunciecardiac)irealizmohemocultur. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Realizmunpreparatproaspt(frafolosilamela)din mediuldeculturilexaminmlamicroscopulcufondntunecat.Leptospirelecudimensiunide 0,1mm/615mm,aparcafilamenteluminoase,spiralate,foartemobile,cumicridenurubare iflexiune,daricuouoardeplasarenspaiu,pefondulnegrualpreparatului.Sepotrealiza frotiuricolorateGiemsaprelungitsauprinimpregnareargentic(FontanaTribondeau)precumiprin IFdirect. Caracteredecultur: Leptospirelenepatogenesemultiplicla1113CntimpceL.interrogansnu Caracterebiochimice: Leptospirelenepatogenesuntrezistentela8azaguaninntimpceL.interroganseste sensibil Caractereantigenice: Seutilizeazseruridereferincuanticorpifadeserogrupurilecunoscuteitulpinade identificatizolatnculturpuriconcentratlaodensitatestandard,prinreaciideaglutinare microscopic,lanivelulcentruluidereferincareaelaboratprotocolulstandarddeoperarenmod similarsepoateidentificaiserovarulimplicat Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin: tehnicialebiologieimoleculare(amplificareaprinPCRafragmentelorobinuteprin restricieendonucleazicetc). 5.Antibiogramanuserealizeaz(nuafostpuslapunctotehnicnacestscop).Este cunoscutfaptulcleptospirelesuntsensibilelapenicilin,amoxicilin,tetraciclin,doxiciclinetc dartratamentulsestabiletenfunciedeformaigravitateabolii. Diagnosticulserologic Anticorpiispecificisepotevidenianserulpacienilorncepndcua46azideladebutul bolii,atingndunnivelmaximntresptmnaa36adeboal,dupcarescadprogresiv. Tehnicadereferinestereprezentatdereaciadeaglutinaremicroscopic,realizatpeseruri pereche(primulrecoltatla12sptmnideladebut,aldoilearecoltatla34sptmnidela debut).Ocreterede4oriatitruluilaadouadeterminaresemnificundiagnosticpozitiv.Un titru1/800nprezenaunorsemnecliniceestefoartesugestiv.Trebuiesmenionmcpentru uniipacieniseroconversiaarelocmaitardiv.Oaltproblemestereprezentatdefaptulcse utilizeazleptospireviincalitatedeAgcunoscut,motivpentrucareaceastreacienusepoate practicadectncentruldereferin. LanivelulaltorunitisanitaresepotpracticareaciidetipELISA,reaciadehemaglutinare indirectsaureaciadeaglutinarepelamutilizndAgpreparatedintulpinisaprofite(sensibilitatea ispecificitateaacestorreaciiestemaisczut).TehnicaELISAdeidentificareaanticorpilordetip IgMpunediagnosticulinfecieiacutedarnupoatepermitedeterminareaserogrupuluiimplicataa

cumsentmplncazultehniciidereferin.

47. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Borrelia

GenulBorreliaincludespirochetededimensiunimaimari(0,20,5mm/830mm),cuspire largiiinegale,mobile(cumicriderotaieirsucire),careinfecteaznspecialanimaleleise transmitlaomprinintermediulunorvectori.Producspreexemplufebrarecurent,boaltransmis deartropodelehematofage,borreliozaLymeetc.Borreliozeletransmiseprincpuesaupduche poartdeobiceinumeleregiuniigeograficencaresegsescpreponderent.Vomdiscutancelece urmeazaspectelegatedefebrarecurentcuagentetiologicBorreliarecurrentis,careproduce infeciiinEuropa. B.recurrentissupravieuietemaimulteluninsngelecontaminatsaunculturila4C.n anumitecpue,bacteriilesunttransferatedingeneraiengeneraie.TulpiniledeB. recurrentisizolatendiverseprialelumii,deladiferitegazdeidelavectoridiferii(cpuesau purici)auprimitdenumirivariatesauaufostcatalogatedreptsubtipurialespecieiprincipale.n urmainfecieiapareunrspunsimunumoral,putndfidetectaianticorpiaglutinaniianticorpi fixatoridecomplement.Deremarcatfaptulc,inclusivndecursuluneisingureinfeciiapar modificriantigenice,careexplicrecderile.Ultimavindecare(dup310recderi)esteasociat cuprezenaanticorpilormpotrivamaimultorvarianteantigenice.Imunitateaconsecutivinfeciei estedeobiceidescurtdurat. Dupoperioaddeincubaie(310zile),debutulestebrusc,cufrisoaneicreterearapida temperaturii.Seasociazcefaleesever,mialgii,artralgii,letargie,fotofobieitusecusaufr expectoraie.nacesttimp,spirocheteleseaflnnumrmarensnge.Potapreahemoragii (peteii,epistaxisetc)darderegulfrevoluiefatal.Febrapersist36zile,apoiscade. Perioadaafebrildureaz410zileiesteurmatdeunaldoileaatacdefrisoane,febr,cefalee intensistarederu.Potapreasuccesivpnla10asemenearecderi,acrorseveritate scadengeneralprogresiv.Puseelefebrileseasociazcubacteriemie. Diagnosticuldelaboratornborreliozarecurentestebacteriologic,directurmndetapele cunoscute.Diagnosticulserologicpoateoferiuneledate. Diagnosticulborreliozelorpornetedelaelementeclinice,epidemiologice,anumitedatede laboratoriesteconfirmatprindiagnosticbacteriologic. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatcelmaifrecventdesngedarsar putearecoltaivectori(pduchi,cpue)sauLCR,lichidsinovialetc,nfunciedemanifestarea clinic.Sngeletrebuierecoltatnperioadelefebrile.ncazulncareproduselenusepotexamina

imediat,recomandmtransportulacestoralatemperaturafrigiderului(+4C)sauinoculareaunor animalereceptive(ex.oareci)itransportulacestoractrelaborator. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunuipreparatproaspt ntrelamilamelutilizndsngelecap.p.,cuexaminarelamicroscopulcufondntunecat. Borreliilesevdcaspirocheteluminoasededimensiunimaimari(0,20,5mm/830mm),cuspire largiiinegale,foartemobile(cumicriderotaieirsucire),pefondulnegrualpreparatului.Se potrealizafrotiurisubirisauexamenulpicturiigroase,colorateGiemsaprelungit, MayGrnwaldGiemsasauWrightprecumicuacridinorangesaucuAcmonoclonalimarcai fluorescenticuexaminarelamicroscopulcufluorescen.PefrotiulcoloratGiemsaprelungit spirocheteleaparalbastre,lungi,cucapeteleefilate,situateprintrehematii.Examenulmicroscopic realizatdectreunmedicexperimentatpermiteidentificareaborreliilorncirca70%dintrecazuri,n condiiilerespectriinormelordiagnosticuluibacteriologic. Preparatelemicroscopicearmaiputeafirealizateporninddelahemolimfavectorilorinfectai (pduche,cpu).Demenionatfaptulcncazulacestuip.p.borreliileimeninpentruolung duratdetimpformaimobilitateacaracteristicentimpcensngelerecoltatdelagazdauman sufermodificridatoritprezeneianticorpilorspecifici,iarntimpipierdmobilitatea). nultimaperioadsaintrodustehnicaPCRpentruidentificareaADNuluiborrelian,pornindde laprodusulpatologic. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeazderegullanivelul centruluidereferin,existndmaimultetehnicicarearputeafiutilizate. Sepotinoculaanimaledeexperiensensibile(ex.oarecisauobolani),cuinoculare intraperitoneal.Animalelevorfimonitorizatezilniccliniciprinexaminareamicroscopica sngelui(p.p.sepoaterecoltadelanivelulveneicozii).Semaipotinoculavectori(pduchisau cpue)sauouldeginembrionat(lanivelintraalantoidiansaunmembranachorioalantoidian). Sepotutilizaimediideculturartificialespeciale(cuagenireductori,Nacetilglucozamin, acizigrainesaturaicucatenlung,serdeiepure),ncondiiidemicroaerofilie,cuincubarela 3237C.Serecomandiutilizareamediilorselectivecareincludocombinaiedeageni antimicrobieniprecumrifampicin,amfotericinBifosfomicin.Datoritfaptuluicmediilede cultursuntlichide,nuseobincoloniiizolate.Cretereamicrobiantrebuieverificatprinrealizare depreparateproaspeteexaminatelamicroscopulcufondntunecatlafiecare3zile,pentruodurat de26sptmni. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsepoaterealizapebaza: Caracterelormorfotinctoriale:Suntspirocheteluminoasededimensiunimaimari (0,20,5mm/830mm),cuspirelargiiinegale,foartemobile(cumicriderotaieirsucire),pe fondulnegrualpreparatului.PefrotiulcoloratGiemsaprelungitspirocheteleaparalbastre,lungi,cu capeteleefilate. Caracterelordecultur: Dacarelocmultiplicareaborreliilorpemediuldeculturacestarmnelimpede,fr sediment,darimodificculoarea(ex.vireazdelarouportocaliusprerozglbui) Caracterelorbiochimice: Borreliilesuntmicroaerofile,fermenteazglucozaproducndbioxiddecarboniacid lactic(daracestetestenusuntutilizatederegulndiagnostic). Altecaractere/testeutilizatenidentificarelanivelulcentrelordereferin:

tehnicialebiologieimoleculare(PCR). 5.Nuafostpuslapunctometodpentrurealizareaantibiogramei(verificareasensibilitiila antibioticeichimioterapice).Febrarecurentsetrateazcutetraciclin,cloramfenicol,penicilin saueritromicin.nurmatratamentuluipoateapreasindromulJarischHerxheimer(frisonsever, cretereatemperaturii,hipotensiune,leucopenie). Diagnosticulserologicnuestefoarteutil,datoritvariaiilorantigenice(careaulocinclusivpe parcursulbolii)icomplexitiifenomenuluiderecuren. nserpotfidecelaianticorpiaglutinani,imobilizaniifixatoridecomplement.Suntfoarte puinelaboratoarecarepracticacestereacii,deobiceinscopdecercetare.Lapacieniicufebr recurentepidemic(purttoridepduchi)potapreaaglutininefadeProteusOXKioreacie VDRLfalspozitiv. Sepoatenregistraoleucocitozdepnla25.000celule/mm3iocretereimportanta VSHului(depnla110mm/h).

48. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din familia Rickettsiaceae

Rickettsiilesuntmicroorganismecareiniialaufostncadrateprintrevirusurideoareceau dimensiunimaimicidectbacteriile(600/300nm)inmajoritatenusepotcultivadectpegazde vii.FamiliaRickettsiaceaeincludetreigenuri,genulRickettsia,genulCoxiellaigenulEhrlichia. Microorganismelesunttransmisedeobiceidectreartropode(pduche,purice,cpu) multiplicndusencorpulacestora.Celpuinpatrurickettsii(Rickettsiarickettsii,Rickettsia conorii,Rickettsiatsutsugamushi,Rickettsiaakarii)iprobabilialtelesunttransmisetransovarian nartropodecareservescdeopotrivcavectorirezervor.Rickettsiaprowazeckii,agentuletiologic altifosuluiexantematicesteconsideratcaspeciatipagenuluiRickettsia.ncelemaimulte cazuri,rickettsiozelesecaracterizeazprinasociereaunuisindrominfeciossevercuunexantem. Clasificarealorsepoatefacedupmaimultecriterii.Dupprincipalelecaractereclinicei epidemiologicerickettsiozelesepotmprinurmtoarelegrupe:a).tifosuldepduchesaupurice b).grupulfebrelorbutonoase(febrelepeteiale)reuneterickettsiozeletransmiseprincpuecare paraziteazanimaleledomesticeislbaticec).grupultifostropicalreunete rickettsiozeletransmisedelarveleunormiciacarieni.TifosulpulmonarsaufebraQarecaagent etiologicCoxiellaburnetiipoatefitransmisidecpue,contaminareaestensposibilipe calerespiratoriesaudigestiv. Microorganismelesemultiplicnceluleleendoteliuluivaselorsanguinemiciiproduc vasculite.Celuleleseumflisenecrozeaz,apartrombozealevaselorcareduclarupturi necroz.Leziunilevasculareparafibazaalterrilorhemostazei.Potapreacoagulare intravasculardiseminatiocluziivasculare.Lanivelcerebralaparagregrilimfocitare,leucocitare

ialemacrofagelorceeaceconducelaapariianodulilortifici.Seobservleziunisimilarenvasele micilanivelcardiacsaulanivelulaltororgane.Infeciilerickettsienesecaracterizeazprinfebr, cefalee,indispoziie,prostraie(staregeneralfoartealterat),rash(erupie)cutanatimrirea splineiificatului.nfebraQnuexistleziunicutanate. VomdiscutancontinuaredesprediagnosticulfebreiQdeiCoxiellaburnetiipoateproducei unsindromfebrilautolimitat(214zile),endocardit,hepatit,osteomielitetc.FebraQsepoate manifestaprinpneumonieatipic,pneumonierapidprogresivsaupneumoniencaresemnul principalestereprezentatdefebr(simptomatologiapulmonarfiindabsentiarimplicarea pulmonarputndfidemonstratparaclinic).Pornimdelaelementeclinice(nespecifice), paracliniceidelaboratorincercmstabilireaetiologieiprindiagnosticmicrobiologic (bacteriologiciserologic).Obinereadehemoculturiisputoculturinegativepentrualte microorganismeesteunelementcarencontextulcliniciparaclinicreprezintunelement sugestiv. Diagnosticulbacteriologic 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicestereprezentatcelmaifrecventdesputputem recoltaisnge(arfidepreferatcheagulsanguin),lichidpleural,lichidpericardic,fragmentede placent(ncazulunuiavort)etc.Transportultrebuierealizatrapidincondiiidemaxim siguran(ceeacetrebuierespectatntoateetapelediagnosticuluibacteriologic microorganismeledinfamiliaRickettsiaceaeprezintungradnsemnatdeinfeciozitateprin aerosoli).ncazulncarep.p.nupoatefiprocesatiinoculatimediatesterecomandatmeninerea la20C(inclusivpeparcursultransportului). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicesterareoriutilpentrudiagnostic.n sput,maialesdacesterecoltatprinbiopsietransbronic,putemremarcaprezena macrofageloralveolareiarprintreacesteaprezenaunorcocobacilidedimensiunimici.Porninddela genapentrusuperoxiddismutazaufostobinuiprimeri(amorse)utilizainamplificareagenetic, porninddelaprodusulpatologic. 3.Cultivareapeprodusuluipatologicsepoaterealizanumaipegazdevii,lanivelulunui laboratordereferin.Trebuieluatetoatemsuriledeprevenireauneiinfeciinlaborator.Coxiella burnetiipoatecultivapeanimaldelaborator(cobai),culturidecelulesauoudeginembrionat(la nivelulsaculuivitelin).nafardep.p.menionatemaisusamputeafolosipentruinocularei artropode.LanivelulsaculuivitelinC.burnetiisuferovariaiedefaz,ntructvasimilarvariaieide laformaSlaformaRntlnitlaaltebacterii.TulpinilerecentizolatesuntnfazaIntimpcedup subcultivareseobintulpinicuvirulensczut,nfazaII. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizaastfel: Caracteremorfotinctoriale: evideniereaprinimunofluorescendirectamicroorganismelornhemolimfaanimalelor infectatesaulanivelulsaculuivitelinalouluideginembrionat realizareadefrotiuricolorateprinmetodaGimenez(microorganismeleapardeculoare roiepefondulverdealfrotiului)sauMachiavello(microorganismeleapardeculoareroiepefondul albastrualfrotiului)sepoateutilizaimetodaGiemsa EvaluareaprezeneianticorpilorantiC.burnetiilaanimaleledelaboratorinoculatecu

p.p. Tehnicialebiologieimoleculare(PCR)etc. 5.Testareasensibilitiilaantibioticenuserealizeazderutin.Cercetriefectuatedup cultivareaC.burnetiipeliniidecelulefibroblasticeL929aupermisautorilorsafirmectulpinile studiateaufostsensibilelachinolone(nspecial)irifampicindarmaipuinlacloramfenicol, doxicilinitrimetoprim.Totui,tratamentulfebreiQsepoatefacecusefacecutetraciclinsau macrolidenasocierecurifampicin. Diagnosticulserologic Datoritdificultiiiriscurilordiagnosticuluibacteriologic,celmaifrecventnpracticse utilizeazdiagnosticulserologic.ExistmaimultetehnicidelaboratorcarepotfiutilizatedarRFC rmnencontinuaremetodadereferin.Ocreterede4oriatitruluilaa2adeterminareajutla punereadiagnosticuluipozitivnfebraQ.Maiputemutilizareaciademicroaglutinare,reaciade microimunofluorescenindirect,otehnicdetipELISAsaureaciadelatexaglutinare(pozitivn infeciaacut).Reaciademicroimunofluorescenindirectprezintunnivelridicatdesensibilitate ispecificitatencondiiilencarepersonaluldelaboratorestebinepregtitiareexperienn acesttipdediagnostic.nceeaceprivetedepistareaspecificaAcdetipIgM,nacestcaznu esteutildeoareceIgMpotpersistantre1i2anidupinfeciaacut. ndiferitestudiiepidemiologiceafostutilizatireaciadeseroneutralizare.Injectndla oareceserspecificantiC.burnetii,acestavaneutralizaefectulinoculriidemicroorganismeviipe caleintraperitonealsauintravenoas.Pentruultimametodreamintimnecesitatealuriituturor msurilordeprevenireauneiinfeciiapersonaluluidelaborator.

49. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Chlamydia

Chlamydiilesuntbacteriidedimensiunimici(0,251mm),gramnegative,strictparazite,

imobile,caresemultiplicncitoplasmacelulelorgazdprintruncicludedezvoltarecaracteristic. Datoritimportaneipentrudiagnostic,vomprezentacicluldedezvoltarealchlamydiilor.Dupce ptrundeninteriorulceluleigazd,particulainfecioas(corpuscululelementar,formcocoid,cu diametrulde0,250,3mm)setransformntroparticulmaimare(corpusculreticulat,cudiametrul de0,51mm).Corpusculiireticulaisereunescisemultiplicprindiviziunebinar,formndcolonii (incluzii)intracitoplasmatice.Dupoperioadvariabilnfunciedespeciadechlamydiiide celulaparazitat,delanivelulincluziiloraparnoicorpusculielementari,caresuntexpulzai,urmnd sparazitezealtecelule.ntregulcicludureaz2448ore. Genulconinetreispeciicarepotfiimplicatenpatologiauman.Deregulinfeciaeste subclinic,boalareprezentndoexcepielagazdelenaturalealeacestorgermeni.Transmitereade lapsrilaomfavorizeazapariiabolii.C.trachomatisproduceincluziicompacte intracitoplasmatice,cuglicogen.Includetulpinicaredeterminpneumonielaoareceicteva afeciuniumane:trahom(serovarurileA,B,BaiC),conjunctivite,uretritenongonococice, salpingite,cervicite,pneumoniilanounscui(serovarurileDK)ilimfogranulomatozavenerian (serovarurileL1L3).C.psittaciproduceincluziiintracitoplasmaticedifuze,sracenglicogen. Includetulpinicaredeterminpsitacozauman,ornitozelapsri,meningit,pneumonielafelinei multealteafeciunialeanimalelor.(provoacinfeciilaanimaledarpoatefitransmisomului).C. pneumoniaepoateprovocalagazdaumanpneumoniiatipicelafelcaiC.psittaci,Coxiella burnetiisauMycoplasmapneumoniae.UniiautoriclasificC.psittaciiC.pneumoniaen genulChlamydophila. Diagnosticuldelaboratorninfeciilechlamydienepoatefibacteriologiciimunologic. Infeciozitatea(prinaerosoli)esteimportantastfelctrebuieluatetoatemsurilenecesarepentru prevenireaapariieiunorinfeciilapersonaluldelaborator. Diagnosticulbacteriologic Diagnosticulbacteriologiccompletpoatefirealizatlanivelulunorcentredereferin. 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapieiirespectndmsuriledeprecauie.Produsulpatologicpoatefireprezentat deraclatconjunctivalsaudelanivelulaltormucoase(ex.cervival),urin,sperm,secreie purulenturetral,secreiinazale,secreiifaringiene,sput,aspiratganglionar,puroidinfistuletc. NevomreferincontinuareladiagnosticulinfecieiprodusedeC.trachomatis.ncazulncarespre ex.secreiauretralnuesteevident,putemutilizauntamponsubirepecarelintroducemcu blndee35cmnuretr,rotinduluor.Indiferentdep.p.recoltat,tampoanelenutrebuiesfiedin vatsaualginatdecalciucidinDacron.Produsultrebuiesfieprelucratimediat.Dacacestlucru nuesteposibil,transportulsevafacenmediispecialedetransportsaulacelpuin20C (preferabil70C). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicincluderealizareaunorfrotiuripecarele colormdupcumurmeaz.Ceamaisensibilispecificmetodpentrupunereanevidena incluziilorintracitoplasmaticesaucorpusculilorelementariesteimunofluorescena.Frotiuleste uscat,fixatchimic(cuaceton,la20C)icoloratimunofluorescent(metodadirectsau indirect).Urmrimprezenacelulelorinflamatorii(PMN)iacelulelorcaracteristiceesutuluidela nivelulcruiaamrealizatrecoltarea.Incluziileaparcaomasbinedefinit,cufluorescendeex. galbenverzui,ninteriorulcelulelorepiteliale.Frotiulvafiexaminatcelpuin3minutencazuln

careparesfienegativ.nafardeCelelaltefrotiurileputemcoloraprinmetodaGimenez (corpusculiielementariaparaglomeraiideculoareroiepefondulverdealfrotiului),culugol (incluziiledeC.trachomatisconinglicogenaparcaomasdeculoarebrun)sauMachiavello (corpusculiielementariaparaglomeraiideculoareroiepefondulalbastrualfrotiului).Uniiautori menioneazcexamenulcitologic,cupunereanevidenaunorlimfocitetransparenteiaunui numrcrescutdehistiociteestesugestivpentruinfeciacuC.trachomatis.Printehnicidetip ELISAsepotpunenevidenantigenenp.p.Existitehnicialebiologieimolecularecarepotfi aplicatedirectpep.p.(sondenucleotidice,PCRetc). 3.Pentrucultivareaprodusuluipatologicamputeautilizaouldeginembrionat(lanivelul saculuivitelin)darderegulsefolosescculturiledecelule.PentruChlamydiatrachomatissepot utilizaliniilecelulareBGMK,HeLa229(tratatecudextranicicloheximid),McCoy(tratatecu cicloheximid1mg/ml),pentruChlamydiapneumoniaesepotutilizaliniilecelulareHeLa,HEp2, pentruChlamydiapsittacisepoateutilizaliniacelularMcCoyetc.naintedeinoculareapeculturile decelule,p.p.estecentrifugat(3000g,timpde60minute).Sepotutilizaculturiledecelulen sistemulclasicsaumicrometodadecultivarepeculturidecelulengodeuri.Incubareadureaz 4872deore.Tehnicaincubriiestedestuldecomplex(incubrirepetate,ncondiiidiferite)i trebuiesrespectestrictprotocoluldelucru. 4.Identificareasevarealizadifereniat.ncazulncaresautilizatmicrometoda,godeurilese examineazmicroscopicdupcolorareculugolsauprinimunofluorescen.ncazulcultivriiprin metodaclasic,realizmfrotiuripecarelefixmchimic(deex.cumetanol).Unfrotiuvaficolorat culugol(incluziiledeC.trachomatisconinglicogen)iaraltulcuAcmonoclonalimarcai fluorescent.Sepotaplicaitehnicidebiologiemolecular. 5.Nuexisttehnicistandardizatedestabilireasensibilitiilaantibioticeichimioterapicea tulpinilordeChlamydiaspp.ntratamentsepotfolosieritromicina(saualtemacrolide),tetraciclinele saufluorochinolonele. Diagnosticulserologic Diagnosticulserologicimplicutilizareareacieidefixareacomplementului,reacieide microimunofluoresceniatehnicilordetipELISA.Seconsidercuntitru1/64estesugestivn timpceocreterede4oriatitruluindinamicpermitediagnosticulpozitiv.Identificareaprezenei AcdetipIgMlanounscuipermitediagnosticuldepneumoniecuC.trachomatis.Tehnicile imunologicesuntfrecventutilizatenscopepidemiologic(studiideseroprevalen). Diagnosticulimunobiologic Utilizareaintradermoreaciei(IDRFrei)aintratnistoriamedicinii.

50. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Mycoplasma

ClasaMollicutesincludepatruordine.OrdinulMycoplasmataceaeinclude genurileMycoplasma(circa100specii)iUreaplasma(6specii).Ctevadintrespeciileacestor genuriprezintinteresmedical.Mycoplasmelesuntcelemaimicimicroorganismecarepottriliber nnatur(125250nm)isepotmultiplicapemediidelaborator.M.pneumoniaeesteimplicatn infeciirespiratorii,M.hominispoateproduceinfeciiculocalizaregenitalinclusivinfecii postabortumipostpartumntimpceU.urealyticumafostizolatdinuretritenongonococicei dinalteinfeciiurogenitale. Diagnosticuldelaboratorpoatefibacteriologici/sauserologic,nfunciedelocalizarea infecieiispeciaimplicat. Diagnosticulinfeciilorrespiratoriipornetedelaelementecliniceiparacliniceipoatefi confirmatetiologicprindiagnosticulmicrobiologic. Diagnosticulbacteriologic 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndregulile cunoscute(vezicapitolul6),nspecialrecoltareactmairapiddupdebutulboliiinaintede iniiereaantibioterapiei.Produsulpatologicpoatefireprezentatdeexsudatfaringian,secreiinazale, sput,secreiigenitale,urinetcdarncontinuarevomdiscutanumaidiagnosticuldelaboratorn infeciilerespiratorii.Transportultrebuierealizatlarece(la+4C)ctmairapidposibil,fradepi unmaximde34oredelarecoltare.Oalternativestereprezentatdeutilizaremediilorspecialede transportcarepotasiguraconservareap.p.pentrucelmult24deore.Utilizareaazotuluilichid(70 C)permiteconservareaprobelortimpdemaimulteziledarnuestencaccesibil(cufoartepuine excepii)sistemuluisanitarromnesc. 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicnupermiteobinereaunorrezultateutile,M. pneumoniaecaicelelaltespeciialeordinuluiaredimensiunifoartereduse.Uniiautorirecomand realizareadefrotiuricolorateimunofluorescent.Porninddelap.p.sarputearealizaamplificarea genetic(PCR)cuosensibilitatefoartebun.PrintehnicidetipELISApotfipusenevidenAg deM.pneumoniaensput. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicsepoaterealizautilizndtehnicii mediispeciale.Unuldintremediiledeculturcunoscutestemediulmbogit,pebazdeinfuziede cordbovinnumitgenericPPLO.Acestmediuincludeattsubstanenutritive,sursedeenergie, indicatordepH(roufenol)ctisubstanecareiasigurselectivitatea(penicilini/sauacetatde taliu).Ceimaimuliautorirecomandnsmnareap.p.attpeunmediudecultursolidctipe unmediudeculturlichid(ex.bulionPPLO).Vomrealizaoincubarela37Cnatmosferde5% CO2iurmrimculturilepemediullichidpentruasesizactmairapid(darnumaidevremede 4872oredeincubare)modificriledeculoarecaretrdeazvirajulpHului.Mediuldevineacidprin fermentareaglucozeincelmult34sptmni.Esterecomandatsrealizmrepicripemedii solideilichidectmaicurnddupceamobservatvirajulpHului. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: CaracteremorfotinctorialenusuntutilenidentificareaM.pneumoniae Caracteredecultur: Sepotexaminalastereomicroscop(cumriredeminim25).nscopulidentificrii trebuiescitimplacacumediuagarizatdecelpuin2oripesptmn.Potapreacoloniide dimensiunifoartemici(cudiametrudela10mmpnla200mm),cuaspectmuriform.Sunt

descriseicoloniicuaspectdeouochi,cucentruldens,opac,nconjuratdeozonperifericmai clarpecareuniiautorileconsiderdrepttipicepentruMycoplasma(astfeldecoloniiarmaiputeafi produsedebacteriinformLinecesitrealizareadiagnosticuluidiferenial). Sepoaterealizaicultivareapeouldeginembrionat(inoculareintravitelin)saun culturidecelule. Caracterebiochimice: Fermenteazglucoza,numetabolizeazarginina,nuhidrolizeazureeadarreduce(n aerobioz)tetrazoliul.Acestaesteuncompusincolor,iarncazulncareestereduslaformazan, culoareadevineroie.Testulsepoaterealizadirectpeplacapecarepresupunemprezena coloniilordeM.pneumoniae. Altecaracterecarearputeafiutilizatenidentificaresunt Fenomenuladsorbieihematiilordecobai Colorareaimunofluorescentacoloniilorcuserurispecificemarcatecufluorocromi Inhibareadezvoltriicoloniilornjurulunordiscuriimpregnatecuanticorpispecifici Tehnicialebiologieimoleculare(sondenucleotidice,PCR)etc. 5.Nuexistostandardizareatehnicilorpentrudeterminareasensibilitiilaantibioticei chimioterapice.TratamentulpneumonieicuM.pneumoniaesepoatefacecueritromicinsaualte macrolidesaucutetracicline.Duratatratamentuluiestedecirca3sptmni. Diagnosticulserologic ncursulinfecieiseproducAcdindiferiteclase,uniifiindutilipentruneutralizareaM. pneumoniaentimpcealiiacioneazcaautoAc.Dintreacetia,aglutininelelarecesuntAcde tipIgMoligoclonalicarereacioneazcuunAgdelasuprafaahematiilorpacienilorinfectaicuM. pneumoniae.Cutoatecexistialtemaladiincareaparaglutininelarece,iarpedealtparte acetianusepotidentificalatoipacieniiinfectaicuM.pneumoniae,demonstrareaaglutininelorla rececontinusfieutilndiagnosticulserologic.Utilizmserulpacientuluipecarelamestecm cueritrociteprovenitedelapacienidegrupO,incubmla0Cctevaminuteiurmrimapariia aglutinrii.Dacapareaglutinarearepetmtestulrealiznddiluiideserpentruadeterminatitrul. Untitru1/32estesugestivpentruinfeciacuM.pneumoniae. SepoateutilizaiRFC,darpentrucAcfixatoridecomplementapartardivesteutilnstudii epidemiologice.TehnicadetipELISApoatedeterminaAcdetipIgMiesteutilninfeciaacut.

51. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Candida

Diagnosticulinfeciilorfungicenuesteundiagnosticfacil,darestefoarteimportantpentruc

trebuiesavemnvederecacesteafeciunisuntmultmaifrecventedectsuntraportatenara noastr.Oricarelaboratorclinicartrebuispoatrealizacelpuinexaminareamicroscopicn vedereaevidenieriilevurilorsaustructurilormicelienesaupseudomicelieneprecumitestul filamentrii.Dintreinfeciilefungicevomdiscutadoardespreinfeciileprodusedelevuriidintre acesteanumaidespreinfeciileprodusedelevuriledingenulCandida,maiprecisdespeciaCandida albicans. nceeaceprivetediagnosticuluneiinfeciicuCandidaspp.(respectivC.albicans)exist anumiteparticularitidecaretrebuieinutcontatuncicndsediagnosticheazocandidoz localizatlanivelmucocutanatncomparaiecuocandidozlocalizatprofund.Diagnosticulpoate fimicologic(direct)sauimunologic(indirect). Diagnosticulmicologic 1.Recoltareaitransportulprodusuluipatologictrebuiesserealizezerespectndoseriede reguli(ctmaiaproapededebutulbolii,naintecapacientuluisfiprimitantibioticeantifungice,ct mairapidicorectdinpunctdevederealtehnicilorutilizate,respectndtoatenormeledeasepsie iantisepsieetc).ncazulcandidozelorsuperficiale,dupantiseptizareasuprafeeileziuniiraclm spreex.tegumentulicolectmscuamelerezultatentrunrecipient.Maiputemrecoltafiredepr, fragmentedeunghieetc.nprincipiuputemintroducep.p.recoltatnpachetdehrtie,introdusla rndulluintrocutiePetri.Transportultrebuiesdurezemaxim48deore.ncazul candidozelorprofundecaincazulcandidozelorlocalizatelanivelulmucoaselortrebuies evitmuscareap.p.peparcursultransportului.Vomutilizarecipientecaresepotnchideermetici dacestimmctransportulvaduramaimultde12oreintroducemnrecipientuntampondevat sautifonumezitcusoluiesalinfiziologic.Pentruaprevenimultiplicareabacterianputem adugap.p.antibiotice(ex.penicilin,streptomicin,cloramfenicol).Estebinecavolumuldep.p. recoltatsfiectmaimare.ncazulcandidozelorprofundeprefermcarecoltareasfie urmatimediatderealizareapreparatelormicroscopiceinsmnarepemediidecultur(lapatul bolnavului). 2.Examinareamicroscopicaprodusuluipatologicserealizeazdiferit,nfunciedep.p. prelucrat,darfacepartedinoriceexamenmicologic. ncazulncareexaminmosecreiesauunprodusobinutprinraclaredelanivel tegumentarsaufragmentedeunghievomrealizaunpreparatproaspt(umed),montatnsoluiede 1030%KOHglicerol.Putemutilizapentrucolorarecalcofluoralb,unfluorocromcarepermite evidenierealevurilordatoritfaptuluicauncompoziiechitin(lanivelulpereteluicelular). Elementelefungice(levuriovoide,cudimensiuneade4/6mm,pseudomiceliiimicelii)apar galbenverzuisaualbalbstruinfunciedelungimeadeundaradiaieideexcitaie.Punerean evidenaformaiunilormenionatemaisuspermitesuspicionareaprezeneiCandidaspp.,dar pentruconfirmareaprezeneiC.albicansestenecesarobinereaculturilorpureiidentificarea acestora. ncazulncareexaminmsecreiidelanivelulmucoaselorvompregtiattpreparate umedectifrotiuripecarelevomcolora(Gram,AMsauGiemsa).Pentrucretereasensibilitii examinriipreparatelorumede,acesteavorficoloratecucalcofluoralbsauculactofenolalbastru cotton.Indiferentdemetodautilizat,punereanevidenalevuriloripseudomiceliilorridico suspiciune,nsdatoritprezeneiCandidaspp.,nfloramicrobiannormal(ex.bucal,vaginal etc)doarpunereanevidenamiceliiloralturideprezenaformelorlevurice(grampozitivela

coloraiaGram)poatepermiteconfirmareainfeciei.Estenecesarobinereaculturilorpurei identificareaacestora.Pedealtparte,dorimsmenionmcoculturpozitivnabsenaunui examenmicroscopicpozitivridicsemnedentrebareprivinddiagnosticulinfeciecuC.albicans. ncazulcandidozelorprofunde,interpretareasevafacedifereniat.Atuncicndp.p.este normalsteril(recoltatprinpuncielombar,lavajbronhoalveolar,punciebiopticetc),identificarea structurilorfungice(levuri,micelii)estefoarteimportantpentrudiagnostic.Dacp.p.este reprezentatdeurin,materiifecale,sputsaualtproduspotenialcontaminatdefloramicrobian normal,interpretareaestemaidificilnceeaceprivetesemnificaiastructurilorfungice observate.Pentruexaminareap.p.recoltatedelapacienicareprezintcandidozeprofundevom realizaattpreparateumedectifrotiurifixate,colorateprinmetodeleamintite.Esteposibilca elementelefungicesapardeformatedatoritfixriiprecipitatelordecolorant,pefrotiulcolorat Gram.ncazulbiopsiilortisulareamputeautilizacoloraiilehistochimice. 3.Cultivareapemediideculturaprodusuluipatologicserealizeaznaafelnctsse poatobinecoloniiizolateirespectivoculturpur,caresevaidentifica(veziicapitolele9i 10).Existmaimultemediideculturcarepotfiutilizate.Celmaicunoscuteste mediulSabouraud(agar,glucozsaumaltoz,polipepton)produsideINCDMICantacuzino.n cazulp.p.contaminatevomfolosiimediiselective,deex.mediulSabouraudcuantibiotice (cloramfenicol,gentamicini/sautetraciclin)i/saumediulSabouraudcucicloheximid.Dorims menionmcncazulp.p.necontaminaterealizmcultivareanumaipemediulSabouraud neselectivntimpcencazulp.p.contaminatevomrealizacultivareaattpemediulneselectivct ipemediileselective.Putemincubaplcilela2230C,darmaifrecventincubareaserealizeaz la28C(saulatemperaturacamerei)ila3537C,timpde2496orencazulcandidozelor superficialeipnlamaxim3sptmnincazulcandidozelorprofunde. 4.Identificareamicroorganismuluiimplicatpatogenicsevarealizapebazamaimultor caractere: Caracteremorfotinctoriale:Examenulmicroscopicalculturilordelevuriserealizeaz asemntorcuceeaceamdiscutatncazulidentificriibacteriilor.Existnsianumite particulariti. Vomrealizaattpreparateproaspete,coloratedeex.culactofenolctifrotiurifixatei colorate.Vomputearemarcaprezenalevurilor(blastoconidii),rotunde,ovoidesaupuinmai alungite,grampozitive,putndprezentamuguriipseudomicelii.Prinexamenulmicroscopic dovedimipuritateacoloniei. Duprepicareapeagarcufindeporumbsauagarcuextractdecartof(mediisrace dinpunctdevederenutritiv),examinareamicroscopicapreparatuluiproasptvademonstra producereadechlamidoconidii(chlamidospori)careaparlaextremitateapseudomiceliilor. Testulestenegativnnumai34%dintrecazuri. Caracteredecultur: ProduccoloniidetipS,rotunde,bombate,netede,asemntoarecuunelecolonii bacterienedarcudimensiunimaimari.Coloniileaparn14zile,auoculoarealbsaualbglbuie iconsistencremoas.ntimpsuprafaacoloniilorcaptunaspectzbrcit. Caracterebiochimice: Auxanograma:Levurileprezintunanumitechipamentenzimaticcuajutorulcruiapot sutilizezeunanumitcarbohidratcaunicsursdecarbon.Dezvoltareapeunmediuncareeste

inclusunsingurcarbohidratdemonstreazutilizareaacestuiacaunicsursdecarbon.nmod asemntorsepoatetestacapacitateaasimilriiunorsubstaneazotate.C.albicansasimileaz glucoz,maltoz,trehaloz,galactozetc(veziicapitolul12). Zimograma:Testareafermentriiunorcarbohidrai UtilizareaunortesteprodusecomercialprecumAPI20C,API32C,Viteketc Relativrecentaufostpuselapunctmediicromogene(ex.CHROMagar)caretesteaz producereaanumitorenzimeisuntutilenidentificareaC.albicans,C.kruseiiC.tropicalis. Caractereantigenice: Sepotutilizareaciadeaglutinarepelam,reaciadelatexaglutinaresauELISA folosindantiseruricunoscute.Ultimeledoutehnicisuntfolositeinscopulidentificriiprezenei AgdeCandidaspp.ndiferitep.p. Caracteredepatogenitate: Porninddelaoculturde24deorenmediulSabouraudlichidseparmsedimentuli realizmosuspensie0,2%aacestuiansoluiesalinfiziologicsterilinoculmnvenelecoziila unlotdeoareci(cte0,20,8mlpentrufiecareanimal)suspensiaobinutiurmrimevoluia animalelortimpde410ziledacestevorbadeotulpindeC.albicanspatogen,animalelevor muridupcirca1sptmn(anatomopatologicvomputeaevideniaabcesemiliarerenale, splenice,hepatice)etc. Altetestecepotfistudiatenscopulidentificriigermenilor: Testulfilamentrii(testulproduceriidetubigerminativi):Verificmcapacitatea blastoconidiilordeaproduce,nanumitecondiii,tubigerminativi.Repicmtulpinadestudiatpe mediicareconinserdeiepuresaudeberbec.Laintervalede60deminuterealizmpreparate proaspete(ntrelamilamel),examinmmicroscopicpentruaidentificaapariiatubilor germinativi.C.albicansproducenmaxim4orepseudofilamente(tubigerminativi)relativscurte, frstricturi,cuacelaicalibru. Detectareaunormetaboliipringazlichidcromatografie(GLC) Testedebiologiemolecular(sondenucleotidice,PCR). 5.Antifungigrama(verificareasensibilitiilaantibioticeichimioterapicenvedereastabilirii tratamentului)afostpuslapunctrelativrecent.Eforturiledepusenvedereastandardizriiacestei tehniciauavutlabazcretereainteresuluifadeinfeciilefungiceprecumiapariiafenomenului derezistenlamedicamenteleantifungiceatulpinilorizolate.MetodarecomandatdeNCCLSeste ceaadiluiilornbulion. Diagnosticulimunologicpoatefiserologiciimunobiologic. Diagnosticulserologic Cutoatecoseriedeautoriconsiderdreptnerelevantacesttipdediagnostic,diferitestudii aratcidentificareaititrareaAcantiC.albicanspoatefiutilndiagnosticulcandidozelor profunde.IniialaufostutilizatetehnicideaglutinarepentrudetectareaprezeneiAcantimanan. UlterioraufostpuselapuncttehnicipentrudetectareaprezeneiAcfadeAglocalizaten citoplasmaC.albicans.Aufostutilizateimunodifuziangel,contraimunoelectroforeza,ELISAi tehnicadelatexaglutinare. Diagnosticulimunobiologic Intradermoreaciacucandidinestepozitivlapractictoatepersoaneleadulte,fiindastfelutil nundiagnosticareauneiinfeciicuCandida,cinapreciereaRIC.Semaipoateutilizatestul

transformriiblasticealimfocitelornprezenaunorAgdeC.albicans. Trebuiesmenionmcexistoseriedeproblemeprivindstandardizareaiinterpretarea tehnicilordiagnosticuluiimunologic.Cutoatecprinacestemodalitiutilizateizolatnuputem punediagnosticuldecandidoz,interpretareaansambluluirezultatelordelaboratorobinutepoatefi defolosnelucidareaimplicriipatogeniceatulpinilordeCandidaalbicans.