PCR

Polymerase Chain Reaction

Komponen dalam reaksi PCR

DNA Primer
dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates)

Polymerase DNA

Buffer reaksi PCR

Teknik dasar PCR

Denaturasi
900 950 C

Annealing
Penempelan primer
500 600 C

Extension
Perpanjangan 720 C

Faktor keberhasilan teknik PCR

Size
Fragmen yang akan diamplifikasi terbatas oleh polimerase yang digunakan dan rantai yang terlalu panjang akan mempengaruhi cycle time.

Sequence Heterogenity

Heterozygosity Population heterogeneity DNA damage and polymerase error

Contamination

pemurnian DNA sampel dilakukan secara aseptik untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang menyebabkan kesalahan pada amplifikasi DNA target.

Jumping PCR

Kesalahan pada annealing setelah cycle 1 , dapat merugikan karena menghasilkan product yang tidak diinitial sebelumnya (atau tidak diinginkan.

Temperatur Annealing dari kedua primer

Ukuran dan komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan primer terhadap untaian DNA target.

Enzim Polymerase

Pada umumnya konsentrasi optimum berkisar antara 1,0 2,5 unit enzim setiap volume reaksi 50 miuL

Konsentrasi dan kualitas DNA

DNA harus bebas dari pengotor seperti protein atau bahanbahan yang tersisa ketika pemurnian. Efisiensi amplifikasi dapat lebih tinggi ketika menggunakan DNA yang sudah dilinearkan dengan enzim restriksi (sambrook et, 1989)

Konsentrasi dan kualitas primer

Konsentrasi primer yang melebihi 1,0 miuM dapat menyebabkan terakumulasinya hasil polimerisasi yang nonspesifik. Umumnya konsentrasi 20 pmol sudah cukup untuk amplifikasi PCR. Siklus yang berlebihan akan membuat konsentrasi hasil tidak spesifik sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas hasil.

Jumlah siklus PCR

Deoksinkleotida triphosphate (dNTP)

Konsentrasi dNTP yang menghasilkan keseimbangan optimal yang terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP sebesar 10-20miuL. Konsentrasi yang tidak sama dari keempat komponen tersebut mengakibatkan kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerisasi.

Materi Pendukung

Materi pendukung berupa larutan penyangga (buffer PCR) seperti, Tris HCL 10-50 mM dengan PH 8,3 - 8,8 (suhu 20 0 C), KCL 10-20 mM (dapat membantu proses annealing), (NH4)2SO4 10mM, gelatin atau albumin serum, ion deterjen 100miug/ml.

Modifikasi Teknik PCR

Modifikasi (peningkatan Spesifikasi)

Hot start PCR Untuk mengurangi pembentukan amplimer non spesifik. Dalam hal ini sistem enzim untuk polimerase dihambat dengan menggunakan antibodi atau inhibitor. Polimerase akan berjalan ketika antibodi atau inhibitor terdenaturasi.

Touch-down PCR Untuk meningkatkan spesifikasi pada target, yaitu dengan menurunkan suhu secara bertahap pada annealing. Suhu yang lebih tinggi memberikan spesifikasi yang lebih besar untuk mengikat primer sedangkan suhu yang lebih rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk awal selama siklus awal.

 Nested PCR Menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Mekanismenya adalah fase pemanjangan produk pertama dari PCR dijalankan pada pada proses PCR kedua dimana pasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuens DNA spesifik yang berada didalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian diantara kedua primer tersebut..

Q-PCR (real time PCR)

Q-PCR Prinsip dari teknik ini mengikuti prinsip dasar PCR kemudian Dna yang telah diamplifikasi dihitung secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Kuantifikasi hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda).

Hard copies

Inverse PCR
Modifikasi ini digunakan untuk mengamplifikasi daerah yang belum diketahui sekuensnya yang terletak tepat diatas atau dibawah daerah yang sudah diketahui sekuensnya.

Reverse transcriptase PCR

Modifikasi yang digunakan untuk memperkuat DNA dari RNA. Reverse transcriptase mentranskripsi RNA menjadi cDNA yang kemudian diamplifikasi dengan PCR. Modifikasi ini digunakan dalam profiling ekspresi, untuk menentukan ekspresi gen atau untuk mengidentidikasi urutan dari transkripsi RNA, termasuk start transkripsi dan situs penghentian.

Assymmetric PCR
Menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Teknik ini digunakan dalam sequencing dan hibridisasi probing amplifikasi hanya saru dari dua untai komplementer yang diperlukan.

Mutagenesis
untuk mengintroduksi mutasi pada sekuens DNA yang telah diketahui.

Aplikasi PCR

DNA Sequencing

Diagnostic

Arccheologic and evolution

DNA Sequencing

Forensic

Daftar pustaka
Sambrook, J; Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbour : Laboratory Press Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. Second Edition. Cambridge University Press.