Prosiding Small World Animal Veterinary Association Sydney, Australia - 2007 Hosted by:

METODE DNA DARI MENDIAGNOSA PENYAKIT PADA HEWAN. Alan Wilton, BSc (Hons), PhD Sekolah Bioteknologi dan Ilmu Molekuler, University of New South Wales, Sydney NSW 2052, Australia

Pengantar Kita sedang memasuki era ketika tes DNA akan mungkin untuk berbagai sifat pada hewan. Saat ini, banyak tes yang tersedia untuk penyakit genetik dan masih terus dikembangkan, namun karakteristik lain seperti warna bulu, temperamen, perilaku, kerentanan terhadap hip dysplasia, katarak, kanker, parasit atau penyakit menular, akan tersedia berdasarkan teknologi yang sama. Tes DNA untuk penyakit genetik tidak hanya dapat mengkonfirmasi diagnosis suatu kondisi yang sulit untuk mengidentifikasi, tetapi juga dapat digunakan untuk mendeteksi status carrier penyakit genetik yaitu hewan yang tidak menunjukkan tanda-tanda luar tapi membawa satu salinan cacat gen untuk gangguan resesif. Tes tersebut memungkinkan peternak untuk menghilangkan penyakit ini dari berkembang biak dengan pengujian dan pembiakan selektif. Salah satu tes tersebut pertama yang tersedia pada anjing adalah toksikosis tembaga di Bedlington terrier, tapi sekarang ada daftar panjang tes yang tersedia pada keturunan yang berbeda. Daftar tes panjang (misalnya Brooks dan Sargan 2001, Galibert et al, 2001) dan sebagian besar tes yang khusus untuk satu atau beberapa keturunan, jadi cara terbaik untuk mengidentifikasi tes yang tersedia adalah pencarian web. Asal-usul penyakit genetik Penyakit genetik akan selalu menjadi masalah pada hewan domestik karena pemuliaan struktur ekstensif menggunakan hewan juara dan perkawinan berikutnya antara keturunan (inbreeding). Setiap cacat genetik resesif yang dibawa oleh hewan yang juara, (kita semua memiliki 5 atau lebih gen yang

cacat namun keberadaan salinan normal lain berarti tidak ada konsekuensi yang merugikan), akan muncul ketika keturunan mewarisi kedua salinan gen ini diwariskan dari silsilah darinya. Konsekuensi dari keadaan homozigot (kedua salinan yang sama - sama demi keturunan) untuk salinan cacat gen (alel penyakit) adalah penyakit genetik. Jadi, penyakit yang paling genetik dalam struktur pemuliaan tersebut dapat ditelusuri kembali ke individu di mana mutasi terjadi atau mewarisi mutasi dan membuatnya umum dalam berkembang biak. Sebagai contoh, penelitian di lab saya mengembangkan tes untuk lipofuscinosis ceroid (CL) dalam collie Perbatasan (Melville dkk., 2005). CL adalah penyakit penyimpanan lisosomal dengan degenerasi saraf dari sekitar 12 bulan dan menghasilkan perubahan perilaku, ataksia, tremor dan akhirnya kematian oleh sekitar 2-3 tahun. Tidak ada pengobatan, dan beberapa obat yang dapat meringankan gejala. Di Perbatasan collie menunjukkan anjing di Australia, penyakit itu mengkhawatirkan umum. Tes DNA menunjukkan bahwa sekitar 3% dari hewan membawa salinan yang rusak dari gen CL. Sumber gen cacat dapat ditelusuri kembali ke satu individu dari tahun 1950 yang merupakan nenek moyang bagi semua kasus yang diketahui. Penggunaan yang luas dalam pemuliaan juara anjing yang pembawa cacat membuatnya umum dalam populasi. Silang, kawin dua keturunan dari itu juara hasil anjing dalam proporsi anak anjing yang terkena dampak (untuk gangguan resesif seperempat diharapkan akan terpengaruh pada operator manapun dengan kawin carrier). Tes DNA telah memungkinkan diagnosis penyakit yang merusak, yang hanya dapat diidentifikasi sebelumnya oleh patologi pada biopsi otak pada anjing dewasa. Sekarang hal itu dapat dilakukan pada anakan saat lahir menggunakan penyeka pipi noninvasif. Lebih penting lagi, telah digunakan untuk mendeteksi pembawa cacat genetik, peternak dipandu dalam memilih perkawinan sehingga tandu yang terkena dampak tidak dilahirkan, dan cacat genetik secara bertahap dapat dibesarkan keluar. Konsekuensi lain dari struktur pemuliaan pada hewan domestik adalah bahwa resesif ini cacat genetik akan menjadi unik untuk berkembang biak atau sekelompok kecil terkait keturunan. CL terjadi di berbagai ras anjing, misalnya Border Collie, setter Inggris, Amerika bulldog, tapi cacat yang berbeda di setiap berkembang biak. Dalam kasus ini, bahkan gen yang terlibat dalam penyakit yang berbeda (Melville et al, 2005; Katz et al 2005, Awano et al 2006) tetapi dalam kasus lain, mungkin mutasi yang berbeda pada gen yang sama. Oleh karena itu, tes DNA yang dirancang untuk satu jenis mungkin tidak akan berguna dalam jenis lain kecuali mutasi mendahului perkembangan keturunan, misalnya anomali mata collie (CEA / CH) ditemukan dalam semua trah collie dan disebabkan oleh penghapusan besar yang

sama DNA pada kromosom anjing CFA37 (Heidi Parker, FHCRC, di ISAG 2006; Graves 2006) yang tersedia melalui pengujian Optigen. Bagaimana tes DNA dilakukan? Tes DNA pada hewan menggunakan teknik forensik yang sama yang digunakan pada manusia untuk identifikasi dan pengujian paternitas. Pengujian dapat dilakukan untuk perubahan DNA tertentu yang mengakibatkan penyakit genetik atau identifikasi hewan dan ayah. Kedua jenis tes menggunakan polymerase chain reaction (PCR) untuk memperkuat jumlah yang sangat kecil dari DNA ke jumlah yang dapat dianalisis. Bahan awal biasanya baik darah atau penyeka mulut, tetapi sejumlah kecil jaringan apapun dapat digunakan. DNA diekstraksi dan satu atau dua microlitres digunakan sebagai template untuk PCR. Reaksi mengandung enzim untuk menyalin DNA (Taq polymerase), blok bangunan DNA (nukleotida), buffer dan oligonukleotida primer, yang menargetkan DNA untuk diperkuat. Primer memungkinkan hanya sepotong kecil (<1000 basa) dari 2,500,000,000 dasar genom harus diperkuat, yang merupakan kunci sukses tes. PCR berjalan melalui sekitar 30 putaran amplifikasi eksponensial. Isi DNA dari produk PCR kemudian harus diperiksa. Untuk identifikasi atau ayah ini dengan ukuran produk yang dihasilkan di daerah ulangi mikrosatelit. Untuk pengujian penyakit, ini adalah dengan mengidentifikasi perubahan dalam basa DNA atau bagian yang hilang dari DNA. Sekuensing DNA dari produk PCR akan mengidentifikasi perubahan tetapi metode lain yang sering digunakan untuk memeriksa perubahan tertentu. Kebanyakan pengujian membutuhkan akses ke mahal besar DNA sequencer otomatis untuk mendeteksi fluorscently berlabel produk PCR dipisahkan berdasarkan ukuran. Jika hasil mutasi pada perbedaan dalam DNA, mungkin diidentifikasi dengan enzim yang sekuens DNA spesifik membelah (enzim restriksi). DNA membawa mutasi akan memberikan pola yang berbeda dari pemotongan untuk DNA dengan DNA normal dan ini dapat diidentifikasi dengan elektroforesis gel, misalnya pengujian CL di collie Perbatasan di gen CLN5. Metode lain khusus memperkuat DNA dengan mutasi atau DNA normal, dalam PCR kompetitif. Ketika primer diberi label dengan pewarna yang berbeda, satu produk warna PCR akan menunjukkan adanya salinan mutasi gen, sementara yang lain mewakili kehadiran salinan normal gen. Kedua affecteds dan operator dapat diidentifikasi dari warna produk.

Bagaimana tes DNA untuk penyakit genetik dikembangkan? Untuk mengembangkan diagnostik sampel tes DNA harus dikumpulkan dari sejumlah keluarga dengan penyakit. Penanda genetik, seperti mikrosatelit yang digunakan dalam pengujian paternitas, dianalisis, dan asosiasi dicari antara milik pusaka penanda dan warisan dari gen penyakit (linkage analisis). Jika ada calon gen penyakit diketahui dari organisme model seperti manusia, yang memiliki kekayaan data klinis dan genetik, maka mereka dapat diuji dengan menggunakan spidol dari kawasan yang sama dengan gen dalam genom anjing. Jika tidak ada calon yang dikenal untuk gen penyakit, maka seluruh genom dapat dipindai dengan menguji 300 hingga 400 penanda tersebar merata di seluruh kromosom anjing. Analisis keterkaitan akan mengungkapkan penanda dekat dengan gen penyakit. Setelah gen penyakit berada, maka DNA dari hewan yang terkena harus diurutkan dan dibandingkan dengan anjing sehat untuk mengidentifikasi mutasi yang menyebabkan penyakit. Proses ini dapat memakan waktu dan mahal. Namun, penyelesaian genom anjing

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/dog/index.html dan Lindblad-Toh et al, 2005) telah sangat memfasilitasi jenis penelitian. Sekarang jauh lebih mudah untuk pergi dari kelompok hewan yang sakit dalam jenis tanpa diketahui penyebabnya dengan tes DNA. Sebagai contoh, butuh 12 tahun untuk mengidentifikasi penyebab CL di collie Perbatasan sebelum proyek genom anjing dan hanya 2 tahun untuk mengidentifikasi gen yang terlibat dalam neutropenia turun-temurun (Terjebak neutrofil Syndrome) setelah. Penelitian gen penyakit memerlukan sampel dari berbagai silsilah dengan keturunan yang terkena dampak, saudara mereka, orang tua mereka dan kakek-nenek dan hubungan dengan kasus lain dari penyakit ini. Lima atau lebih familles tersebut biasanya diperlukan untuk mendapatkan data yang cukup untuk hasil yang signifikan secara statistik. Karena sampel tersebut sulit untuk mengumpulkan disarankan untuk menyimpan DNA dari setiap silsilah dengan kondisi klinis yang tidak biasa yang dibantu oleh penelitian gen penyakit dan tes DNA. Perbankan DNA tersebut dapat sederhana dan murah dicapai. Darah terlihat ke kartu FTA akan mempertahankan DNA selama lebih dari 10 tahun dan kartu dengan mudah disimpan di tempat kering seperti lemari arsip sampai mereka dibutuhkan untuk penelitian.

Pembangunan masa depan tes genetik Sudah bentuk informasi genom anjing telah dimanfaatkan untuk mengembangkan alat-alat baru untuk identifikasi gen penyakit. Affymetrix microarray chip yang dapat memeriksa 26.000 polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) pada anjing telah dikembangkan oleh Institut Broad (Lindblad-Toh et al, 2005, Graves 2006) untuk melihat gen yang terlibat dalam kanker pada anjing http://www.broad .mit.edu / mamalia / anjing / donate.html dan penyakit lainnya. Ini mengandung banyak variasi genetik yang umum ditemukan pada anjing. SNP tersebar di seluruh genom anjing dan dapat digunakan untuk mencoba untuk menemukan setiap gen penyakit. Hanya 10 sampai 20 anjing yang terkena dampak dan jumlah yang sama kontrol yang diperlukan untuk pendekatan ini. Jika kedua salinan dari gen penyakit yang diwarisi dari nenek moyang yang sama semua gen dalam wilayah kromosom akan homozigot (yaitu dua salinan identik). Memindai seluruh genom akan mengidentifikasi wilayah homozigositas yang posisi kemungkinan gen penyakit. Masih gen yang tepat yang terlibat dalam penyakit dan mutasi pada gen yang perlu diidentifikasi oleh sekuensing DNA yang terkena dan kontrol. Sebuah proyek seperti ini dapat dilakukan dalam beberapa bulan setelah sampel yang tersedia. Slide mircoarray umumnya tidak tersedia belum tapi para peneliti seperti saya ingin menerapkannya pada penelitian kami, misalnya kita sedang mencari gen yang menyebabkan ataksia kelpie bekerja. Pendekatan high-throughput seperti, meskipun memerlukan dana penelitian besar jauh akan memperpendek panjang dari proyek penelitian. Kesimpulan Era tes DNA ini kepada kami. Apakah itu pengujian untuk warna bulu pada anjing, seperti yang tersedia melalui Vetgen, poin berwarna pada kucing (Lyons et al 2005) atau penyakit yang mengancam kehidupan genetik metode sekarang tersedia dan peningkatan sejumlah tes yang dibuat tersedia. Sumber daya yang paling berharga dalam jenis penelitian adalah spesimen klinis. Penelitian tidak dapat dilakukan tanpa sampel dari anjing yang terkena dampak dan keluarga mereka. Vets dapat terlibat dalam jenis penelitian dengan menjaga DNA dari kasus menarik. Ini adalah yang sederhana seperti bercak beberapa darah ke kartu kertas FTA blotting dan pengajuan itu pergi dalam undian. Sekarang adalah waktu untuk memulai DNA ini perbankan dari kasus klinis, dan juga beternak hewan penting dalam setiap berkembang biak sehingga ketika penelitian datang ke penyakit genetik yang berkembang biak (mereka semua memiliki sesuatu dan yang baru akan muncul sepanjang waktu sementara penangkaran saat ini struktur tetap) garis membawa cacat genetik dapat dengan mudah diidentifikasi.

Referensi Awano T et al. Sebuah mutasi pada gen cathepsin D (CTSD) di American Bulldogs dengan neuronal lipofuscinosis ceroid. Mol Genet Metab. 87:341-348, 2006 Brooks M, Sargan DR. Genetika aspek penyakit pada anjing. Dalam Genetika dari Anjing. Sebuah Ruvinsky, J Sampson eds. CABI Publishing, Wallington, pp191-266, 2001. Graves K, Konferensi ISAG 2006, Porto Seguro, Brasil. Anjing Genome Pemetaan Lokakarya http://www.isag.org.uk/ISAG/all/ISAG2006_DogMapping.pdf Galibert F et al. Model anjing dalam genetika medis. Dalam Genetika of the Dog. A Ruvinsky dan J Sampson eds. CABI Publishing, Wallington, pp505-520, 2001. Katz ML dkk. Sebuah mutasi dalam gen CLN8 pada anjing Setter bahasa Inggris dengan ceroidlipofuscinosis saraf. Biochem Biophys Res Commun. 327: 541-547, 2005. Lindblad-Toh et al. Urutan genom, analisis komparatif dan struktur haplotipe anjing domestik. Nature 438, 803-819, 2005 Lyons LA dkk mutasi HTyrosinase terkait dengan Siam dan Burma pola di kucing domestik (Felis catus) HAnimal Genetika 36: 119-126, 2005. Hdoi: 10.1111/j.1365-2052.2005.01253.x Melville SA et al Sebuah mutasi dalam anjing CLN5 menyebabkan lipofuscinosis ceroid neuron di Border Collie anjing. Genomics 86: 287-294 2005 VetGen: Layanan Genetik Hewan www.vetgen.com / anjing-coat-color.html Diterbitkan dalam IVIS dengan izin dari Tutup WSAVA untuk kembali ke IVIS Prosiding Kongres WSAVA, Sydney, Australia 2007