USULAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA

INOVASI BIOREAKTOR SISTEM ASEPTIS PADA PENAMBAHAN SKUALEN TRITERPEN LINEAR TAK JENUH TERHADAP PENINGKATAN KANDUNGAN SENYAWA TRITERPENOID AZADIRAHTIN DALAM KULTUR SUSPENSI SEL TANAMAN NIMBA ( Azadirachta indica A.Juss ) SEBAGAI PRODUKSI BIOINSEKTISIDA

BIDANG KEGIATAN: PKM GT

Diusulkan oleh :

Mangasa Tua P.S Jepri Agung P

24020110130048 24020110110033

(2010, Ketua kelompok) (2010, Anggota kelompok)

UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2012

HALAMAN PENGESAHAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA 1. Judul kegiatan : Inovasi Bioreaktor Sistem Aseptis Pada Penambahan Skualen Triterpen Linear Tak Jenuh Terhadap Peningkatan Kandungan Senyawa Triterpenoid Azadirahtin Dalam Kultur Suspensi Sel Tanaman Nimba (Azadirachta Indica A.Juss ) Sebagai Produksi Bioinsektisida. 2. Bidang Kegiatan 3. Bidang Ilmu : ( ) PKM-AI :( ( ( ( ) Kesehatan ) MIPA ) Sosial Ekonomi ) Pendidikan ( ) PKM-GT ( ) Pertanian

4. Ketua Pelaksana Kegiatan a. Nama Lengkap b. NIM c. Jurusan d. Universitas/Institut/Politeknik e. Alamat Rumah dan No Tel./HP f. Alamat Email 5. Anggota Pelaksana Kegiatan 6. Dosen Pendamping a. Nama Lengkap dan Gelar b. NIP c. Alamat Rumah dan No Tel./HP

: Mangasa Tua P. S : 24020110130048 : Biologi : Universitas Diponegoro : Jl. Banjarsari Gg. Maerasari No 2, Semarang Jawa Tengah / 085246868471 : mangasa_siregar@yahoo.co.id : 1 Orang : Dr. Erma Prihastanti, Msi : 196802191991032001 : Perum Payung Mas Blok D No 97 RT 06 RW 14 Pudak Payung Semarang / 08157613799 Semarang, 27 Februari 2012

Menyetujui Pembantu Dekan III Bidang Kemahasiswaan Penulis Pelaksana Kegiatan

(Ngadiwiyana S.Si, M.Si.) NIP.19690620199903002 Pembantu Rektor III Bidang Kemahasiswaan

( Mangasa Tua P.S ) NIM. 24020110110033 Dosen Pembimbing

(Drs. Warsito, SU) NIP.195402021981031014

(Dr. Erma Prihastanti, MSi) NIP. 196802191991032001

ii

Kata Pengantar Segenap puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Kuasa, Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga kami dapat menyelesaikan karya tulis yang berjudul Inovasi Bioreaktor Sistem Aseptis Pada Penambahan Skualen Triterpen Linear Tak Jenuh Terhadap Peningkatan Kandungan Senyawa Triterpenoid Azadirahtin Dalam Kultur Suspensi Sel Tanaman Nimba ( Azadirachta Indica A.Juss ) Sebagai Produksi Bioinsektisida. Karya tulis ini ditujukan untuk mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa Gagasan Tertulis (PKM-GT) 2012 yang diadakan oleh DIKTI. Melalui karya tulis ini, penulis ingin memberikan solusi terhadap permasalahan pertanian yang difokuskan pada peningkatan kualitas biopeptisida alami yang dihasilkan oleh suatu tanaman yang bersifat antifeedant. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya kami sampaikan kepada Ibu Dr. Erma Prihastanti, MSi selaku dosen pendamping yang telah memberikan banyak bimbingan dan arahan kepada kami dalam penyusunan karya tulis ini. Tidak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dan memberikan dukungan pada kami. Kami menyadari terdapat banyak kekurangan baik dari segi materi, ilustrasi, contoh, dan sistematika penulisan dalam pembuatan karya tulis ini. Oleh karena itu, saran dan kritik dari para pembaca yang bersifat membangun sangat kami harapkan. Besar harapan kami karya tulis ini dapat bermanfaat baik bagi kami sebagai penulis dan bagi pembaca pada umumnya terutama bagi dunia pertanian Indonesia.

Semarang, 27 Februari 2012

Penulis

iii

Daftar Isi Halaman HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................... KATA PENGANTAR .............................................................................................. . DAFTAR ISI.............................................................................................................. DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................. RINGKASAN ............................................................................................................ PENDAHULUAN ..................................................................................................... Latar Belakang ...................................................................................................... Tujuan Penulisan ................................................................................................... Manfaat Penulisan ................................................................................................. GAGASAN ................................................................................................................ Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) .................................................... Inovasi Bioreaktor Sistem Aseptis......................................................................... Kultur Suspensi Sel Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ).................... Analisis Kultur Kalus............................................................................................. Analisis Kultur Suspensi Sel.................................................................................. Ekstraksi Sel Dan Medium..................................................................................... Analisis Kualitatif Dan Kuantitatif........................................................................ Pengaruh Penambahan Skualen Terhadap Kandungan Azadirahtin...................... Peranan Zat Azadirahtin Sebagai Biopestisida Yang Bersifat Antifeedant.......... ii iii iv v vi 1 1 2 2 3 3 3 4 4 5 5 5 5 6

KESIMPULAN .......................................................................................................... DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ DAFTAR RIWAYAT HIDUP PENULIS................................................................... LAMPIRAN ...............................................................................................................

8 9 10 12

iv

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Gambar. Daun, Bunga, dan Buah Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) Gambar. Struktur Molekul Azadirahtin Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) Gambar. Pengaruh Azadirahtin Pada Tanaman Nimba Terhadap Metamorfosis Serangga Gambar. Struktur suatu bioreaktor 12 12 13 13

RINGKASAN Tanaman nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) mengandung senyawa bioaktif yang sangat potensial sebagai bahan pembuatan pestisida alami ( Bioinsektisida ). Kandungan Racun yang terdapat pada Tanaman Nimba adalah azadirahtin, salannin, meliantriol, dan nimbin, yang terutama terdapat dalam biji dan daun tanaman. Zat azodirachtin memiliki daya bunuh terhadap serangga hama. Kandungan bahan aktif tanaman nimba. Daun dan biji nimba mengandung berbagai senyawa kimia, misalnya fenol, quinon, alkaloid dan substansi nitrogen lain, asam-asam, dan terpena. Senyawa yang diyakini sebagai bahan bioaktif bioinsektisida nabati adalah nimbin (nimbinen), thionemon, meliantriol, azadirachtin, dan salannin, yang merupakan senyawa kimia dari kelompok terpena. Selain senyawa-senyawa yang bersifat pestisida, tanaman nimba juga mengandung protein yang tinggi, mencapai l5%, dan serat yang rendah (Crocomo, 1981). Menurut Crocomo, (1981) Tanaman nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) mengandung zat toksik bagi serangga hama. Serangga yang menjadi hama di lapangan maupun pada bahan simpan mengalami kelainan tingkah laku akibat bahan efektif yang dikandung pada nimba. Berbagai zat aktif terkandung dalam nimba diantaranya adalah azadirachtin, salanin, meliantriol, nimbin, dan nimbidin. Semua zat aktif tersebut bermanfaat bagi kehidupan manusia. Bioreaktor sistem aseptis digunakan untuk produksi sel dan produksi metabolit. Hal ini akan meningkatkan kualitas produksi metabolit secara maksimal sehingga peningkatan kandungan senyawa triterpenoid azadirahtin dalam kultur suspensi sel tanaman nimba akan meningkat pula. Tanaman nimba mengandung bahan aktif azadirahtin (C35H44O16), meliantriol dan nimbin. Azadirahtin mengandung sekitar 17 komponen sehingga sulit untuk menentukan jenis komponen yang paling berperan sebagai pestisida. Kematian hama akibat dari penggunaan nimba terjadi pada pergantian instar-instar berikutnya atau pada proses metamorfosis. Nimba tidak membunuh hama secara cepat, tetapi berpengaruh terhadap hama pada daya makan, pertumbuhan, daya reproduksi, proses ganti kulit, hambatan pembentukan serangga dewasa, menghambat perkawinan, menghambat pembentukan kitin dan komunikasi seksual. Biji dan daun nimba mengandung beberapa jenis metabolit sekunder yang aktif sebagai pestisida, diantaranya azadirachtin, salanin, meliatriol, dan nimbin. Senyawa kimia tersebut dapat berperan sebagai penghambat pertumbuhan serangga, penolak makan (antifeedant), dan repelen bagi serangga. Metabolit lain yang terdapat di dalam mimba adalah mimbandiol 3-desasetil salanin, salanol, azadiron, azadiradion, epoksiazadiradion, gedunin, dan alkaloid. Kematian serangga dapat terjadi dalam beberapa hari, tergantung dari stadia dan siklus hidup serangga target. Akan tetapi, apabila termakan dalam jumlah kecil saja mengakibatkan serangga tidak bergerak dan berhenti makan. Aktivitas residu insektisida dari azadirachtin ini umumnya terjadi antara 7-10 hari atau lebih lama lagi, tergantung dari jenis serangga dan aplikasinya. Efek primer dari zat azadirahtin terhadap serangga adalah berupa antifeedant dengan menghasilkan stimulan deterren spesifik berupa kimia ( khemoreceptor ) pada bagian mulut yag bekerja bersama-sama dengan dengan reseptor kimia lainnya yang mengganggu presepsi ransangan untuk makan. Sedangkan efek sekunder dari zat azadirahtin terhadap serangga adalah berupa pengaturan perkembangan dan reproduksinya, akibat efek lansung pada sel somatik dan jaringan reproduksinya serta efek tidak lansung yang mengganggu pada proses neuroendocrine, zat azadirahtin menyebabkan ecdysone blocker yang menghambat serangga memproduksi dan melepas hormon hormon fital dalam metamorfosis. Akibatnya serangga tidak dapat mengganti kulit sehingga siklus hidupnya terganggu (Crocomo, 1981).

vi

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) adalah salah satu jenis tanaman yang menghasilkan berbagai zat aktif, salah satu bahan aktif tersebut adalah azadirahtin, suatu senyawa triterpenoid yang berguna sebagai sumber terbaik untuk bioinsektisida. Azadirahtin dapat digunakan sebagai bioinsektisida karena bersifat antifeedant atau biasa lebih dikenal sebagai penolak makan pada serangga dan mengganggu pertumbuhan serta reproduksi serangga (ecdysone blocker). Sampai saat ini, produksi bioinsektisida dari tanaman nimba dilakukan dengan cara mengisolasi langsung dari tanaman utuh, terutama dari bijinya. Setiap gram biji nimba mengandung 3,6 mgazadirahtin, sehingga dapat digunakan secara langsung. Namun keberadaan nimba di Indonesia relatif sedikit karena daerah penyebarannya terbatas, hanya khusus di Jawa dan Bali. Disamping itu, nimba juga digunakan sebagai sumber obatobatan dan bahan bangunan (Veeresham,2001). Eksploitasi terhadap tanaman ini menyebabkan penurunan populasinya di alam yang secara langsung mengakibatkan berkurangnya sumber bioinsektisida, khususnya azadirahtin. Untuk mengatasi masalah tersebut diperlukan metode alternatif, yaitu dengan menggunakan kultur jaringan. Salah satu tipe kultur yang dapat digunakan untuk menghasilkan metabolit sekunder pada tanaman adalah kultur sel. Serta dengan melakukan inovasi bioreaktor sistem aseptis yang digunakan untuk memacu produksi sel dan produksi metabolit. Hal ini akan meningkatkan kualitas produksi metabolit secara maksimal sehingga peningkatan kandungan senyawa triterpenoid azadirahtin dalam kultur suspensi sel tanaman nimba akan meningkat pula. Untuk bioreaktor sistem aseptis diperlukan sterilisasi bioreaktor pada suhu dan tekanan yang tinggi (Veeresham,2001). Salah satu metode pendekatan yang dapat digunakan untuk meningkatkan produksi metabolit sekunder dalam kultur in vitro adalah dengan penambahan prazat. Penambahan prazat ke dalam medium kultur dapat merangsang aktivitas enzim tertentu yang terlibat dalam jalur biosintesis, sehingga dapat meningkatkan produksi metabolit sekunder. Prazat yang dapat digunakan untuk meningkatkan kandungan senyawa triterpen secara in vitro adalah skualen, yang merupakan senyawa triterpen linear tak jenuh dan prazat untuk semua triterpen. Penambahan skualen sebagai prazat kedalam kultur sel Azadirachta indica A.Juss diharapkan dapat meningkatkan kandungan azadirahtin secara in vitro. Kandungan azadirahtin terdeteksi pada kalus yang diinduksi dari eksplan daun (2,68%BK), pada umur kultur 20 minggu dan eksplan bunga ( 2,48%BK ) pada minggu ke 12. Namun, informasi mengenai kandungan azadirahtin di dalam kultur suspensi sel Azadirachta indica A.Juss sampai saat ini belum diperoleh. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui umur kultur yang optimum untuk memperoleh produksi azadirahtin tertinggi dalam kultur suspensi sel Azadirachta indica A.Juss dan pengaruh penambahan skualen terhadap produksi azadirahtin didalam kultur susupensi sel Azadirachta indica A.Juss dengan inovasi inovasi bioreaktor sistem aseptis. (Veeresham,2001).

2 Tujuan Penulisan Tujuan penulisan karya tulis ilmiah ini adalah : 1. Mendapatkan hasil produksi yang dapat dimanfaatkan untuk peningkatan metabolit sekunder. 2. Mengetahui umur kultur yang optimum untuk memperoleh produksi azadirahtin tertinggi dalam kultur suspensi sel Azadirachta indica A.Juss dan pengaruh penambahan skualen terhadap produksi azadirahtin didalam kultur susupensi sel Azadirachta indica A.Juss dengan inovasi inovasi bioreaktor sistem aseptis. 3. Mendapatkan zat aktif azadirahtin dari kultur suspensi sel tanaman Nimba sebagai bahan dasar Bioinsektisida yang bersifat antifeedant dan mengganggu pertumbuhan serta reproduksi serangga (ecdysone blocker). Manfaat Penulisan Karya tulis ini diharapkan dapat memberikan manfaat antara lain: 1. 2. Bagi pemerintah, gagasan ini dapat digunakan oleh pemerintah dalam pengambilan kebijakan untuk mengatasi peningkatan hama pada bidang pertanian yang dapat merugikan petani. Bagi masyarakat, gagasan ini dapat memberikan informasi ilmiah dan dapat diterapkan secara langsung oleh masyarakat terutama pada kalangan petani secara khusus, sebagai solusi mengatasi serangan hama dengan menggunakan bioinsektisida alami. Bagi akademisi, gagasan ini dapat mendorong akademisi untuk mengkaji lebih lanjut mengenai manfaat tanaman nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) yang berperan penting sebagai bahan bioinsektisida alami.

3.

3 GAGASAN Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) Pohon mulai berbunga setelah berumur 5 tahun, pada umumnya berbunga pada musim kering dan berbuah mendekati musim penghujan. Lamanya proses pembungaan sampai buah masak 10 12 minggu; rata-rata buah mencapai tingkat masak memakan waktu 1- 2 bulan. Daun: Daun Mimba merupakan daun majemuk 7 17 pasang per tangkai, berbentuk lonjong dan bergigi, panjang 6 8 cm, lebar 1 3 cm. Bunga: Bunga berbentuk malai dengan panjang 10 30 cm, warna putih sampai krem Buah: Buah berbentuk elips, berdaging tebal dengan panjang 1,2 2 cm. Pada saat masak buah berwarna hijau/kuning dengan lapisan kutikula yang keras dan daging buahnya berair. Pohon yang berukuran sedang (kira-kira berumur 10 12 tahun) menghasilkan benih 37 55 kg buah sgar per tahun atau sekitar 25 kg benih. Benih/Biji: Berisi 1 2 butir biji per buah. Jumlah benih per kg 1700 butir, namun di India dalam 1 kg jumlah benih dapat mencapai 3500 9000 butir (Veeresham,2001). Tanaman nimba mengandung senyawa bioaktif yang sangat potensial sebagai bahan pembuatan pestisida alami. Kandungan Racun yang terdapat pada Tanaman Nimba adalah azadirahtin, salannin, meliantriol, dan nimbin, yang terutama terdapat dalam biji dan daun tanaman. Zat azodirachtin memiliki daya bunuh terhadap serangga hama. Kandungan bahan aktif tanaman nimba. Daun dan biji nimba mengandung berbagai senyawa kimia, misalnya fenol, quinon, alkaloid dan substansi nitrogen lain, asam-asam, dan terpena. Senyawa yang diyakini sebagai bahan bioaktif pestisida nabati adalah nimbin (nimbinen), thionemon, meliantriol, azadirachtin, dan salannin, yang merupakan senyawa kimia dari kelompok terpena. Selain senyawa-senyawa yang bersifat pestisida, tanaman nimba juga mengandung protein yang tinggi, mencapai l5%, dan serat yang rendah. Bungkil atau limbah tanaman nimba diketahui mengandung nitrogen, fosfor, dan kalium Hasil pengujian yang dikutip oleh Veeresham menunjukkan bahwa produk nimba efektif untuk mengendalikan nematoda bengkak akar, baik di laboratorium maupun di lapangan (Veeresham,2001). Inovasi Bioreaktor Sistem Aseptis Bioreaktor atau dikenal juga dengan nama fermentor adalah sebuah peralatan atau sistem yang mampu menyediakan sebuah lingkungan biologis yang dapat menunjang terjadinya reaksi biokimia dari bahan mentah menjadi bahan yang dikehendaki. Komponen utama bioreaktor terdiri atas tangki, sparger, impeller, saringan halus atau baffle dan sensor untuk mengontrol parameter. Tanki berfungsi untuk menampung campuran substrat, sel mikroorganisme, serta produk. Volume tanki skala laboratorium berkisar antara 1 30 L, sedangkan untuk skala industri dapat mencapai lebih dari 1 000 L. Sparger terletak di bagian bawah bioreaktor dan berperan untuk memompa udara, dan mencegah pembentukan gelembung oksigen. Impeller berperan dalam agitasi dengan mengaduk campuran substrat dan sel. Impeller digerakkan oleh rotor. Baffle juga berperan untuk mencegah terjadinya efek pusaran air akibat agitasi yang dapat mengganggu agitasi yang seharusnya. Sensor berperan untuk mengontrol lingkungan dalam bioreaktor. Kontrol fisika meliputi sensor suhu, tekanan, agitasi, foam, dan kecepatan aliran. Sedangkan, kontrol kimia meliputi sensor pH, kadar oksigen, dan perubahan komposisi medium. ( Ratledge, 2001 ). Bioreaktor sistem aseptis digunakan untuk produksi sel dan produksi metabolit. Hal ini akan meningkatkan kualitas produksi metabolit secara maksimal sehingga peningkatan kandungan senyawa triterpenoid azadirahtin dalam kultur suspensi sel tanaman nimba akan

4 meningkat pula. Untuk bioreaktor sistem aseptis diperlukan sterilisasi bioreaktor pada suhu dan tekanan yang tinggi ( Ratledge, 2001 ). Kultur Suspensi Sel Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss ) Kultur sel merupakan suatu proses dimana suatu sel dari suatu jaringan diambil dan ditumbuhkan pada kondisi yang terkontrol dan aseptik. Sel yang digunakan untuk dikultur biasanya diambil dari jaringan eukaryota. Sel tersebut akan tumbuh dan bertambah banyak dalam kondisi in vitro. Misal sel epitelial, sel fibroblas, dan sel limfoblas yang ditumbuhkan secara in vitro, sel tersebut tidak akan memiliki fungsi in vivo-nya lagi dan dapat dikatakan sebagai sel epitelial, sel fibroblast, sel limfoblas. Sel-sel yang termasuk epitelial antara lain sel HeLa dan sel Vero. Sel-sel yang termasuk fibroblas yaitu, lung mice fibroblast (LMF). Sedangkan sel yang termasuk dalam limfoblas adalah sel Raji (Gunawan, 1987). Kultur Kalus. Kalus diinduksi dari potongan eksplan daun majemuk kedua dan ketiga tanaman Azadirachta indica A.Juss yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( Balitro ) Bogor. Eksplan ditanam pada medium padat yang ditambah zat pengatur tumbuh (ZPT) dengan komposisi 0,5; 5,0; 7,5M asam 2,4-diklorofenoksi asetat (2,4-D) yang dikombinasikan dengan 0,1; 1,0; 5,0M benzilaminopurin ( BAP ) (Wetter, 1991). Kultur Suspensi Sel. Kalus meremah terbaik yang diperoleh dari kultur kalus diinokulasikan ke dalam medium cair MS yang ditambah ZPT berupa 0,1; 0,5; 1,0M 2,4-D yang dikombinasikan dengan 0,1; 0,5; 1,0M BAP, dan sebagai kontrol digunakan medium tanpa penambahan ZPT. Kombinasi konsentrasi 2,4-D dan BAP yang menghasilkan pertumbuhan terbaik, yaitu kultur dengan berat massa sel tertinggi akan digunakan untuk pembuatan kurva pertumbuhan sel,kurva kandungan azadirahtin dan perlakuan prazat (Wetter, 1991). Kurva Pertumbuhan Sel. Kurva pertumbuhan dibuat untuk melihat pengaruh waktu ( umur kultur ) terhadap berat kering. Berat kering diperoleh setelah sel dikeringkan dengan freeze dryer hingga mencapai berat konstan. Sampling untuk pengukuran berat kering dilakukan setiap dua hari sampai pertumbuhan mengalami penurunan (Wetter, 1991). Kurva Kandungan Azadirahtin. Kurva kandungan azadirahtin ditentukan dari hasil pengukuran kandungan azadirahtin di dalam massa sel dan medium dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ). Pengukuran dilakukan setiap dua hari sekali hingga umur kultur 20 hari. Pengukuran ini bertujuan untuk mengetahui kandungan azadirahtin pada setiap fase pertumbuhansuspensi sel, sehingga waktu penambahan prazat dapat ditentukan (Wetter, 1991). Penambahan Prazat. Prazat yang digunakan adalah skualen dengan konsentrasi 10, 100 dan 1000M. Penambahan skualen ke dalam suspensi sel dilakukan pada saat kandungan azadirahtin sedang meningkat. Pemanenan dilakukan setiap dua hari sampai kultur berumur 12 hari dari waktu penambahan skualen (Wetter, 1991). Analisis Kultur Kalus Potongan daun A.indica yang ditanam di dalam medium mulai memperlihatkan respons pertumbuhan pada hari kedua, yang ditandai dengan pemanjangan eksplan. Kalus mulai muncul rata-rata pada hari ke sepuluh. Pembentukan kalus dimulai dari pinggiran eksplan yang terluka dan selanjutnya akan menutupi permukaan eksplan. Pada sel yang rusak akibat perlukaan terjadi otolisis, dan dari sel yang rusak tersebut dihasilkan senyawa-senyawa yang meransang pembelahan sel di lapisan berikutnya sehingga terbentuk kalus. Tekstur kalus yang dihasilkan berupa kalus kompak dan kalus meremah. Perlakuan yang menghasilkan kalus yang paling meremah adalah pada medium dengan penambahan 0,5 M 2,4-D + 1,0

5 M BAP. Tekstur pada kalus dapat bervariasi dari kompak hingga meremah, tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, komposisi nutrien medium, zat pengatur tumbuh dan kondisi lingkungan kultur. Pertumbuhan in vitro sangat ditentukan oleh interaksi dan keseimbangan antara zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam medium dan zat pengatur tumbuh endogen yang dihasilkan oleh sel yang dikultur ( Pierik, 1997 ). Analisis Kultur Suspensi Sel Pertumbuhan kultur suspensi terbaik dengan berat kering sel tertinggi diperoleh pada medium dengan penambahan 0,1 M 2,4-D + 1,0 M yaitu 0,259 0,087g. Pertumbuhan sel yang stabil dapat membentuk populasi sel dengan aktivitas fisiologi yang homogen, yaitu dalam mensintesis metabolit sekunder dan dalam pembentukan vakuola sebagai tempat penyimpanan metabolit sekunder. Kombinasi perlakuan ini akan digunakan untuk pembuatan kurvapertumbuhan sel, kurva kandungan azadirahtin dan untuk perlakuan skualen ( Pierik, 1997 ). Ekstraksi Sel Dan Medium Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Bahan kering ( sel ) yang telah digerus ditimbang sebanyak 0,1g, lalu diekstrak dengan 10 mL methanol teknis dalam labu Erlenmeyer yang diagitasi dengan alat pengocok pada kecepatan 120 rpm selama 48 jam. Selanjutnya ekstrak disaring dengan kertas saring Whatman no.1. Residu dibilas dua kali dengan 5 mL metanol teknis, filtratnya kemudian diuapkan dengan vaccum rotary evaporator sampai semua pelarut menguap. Ekstrak kasar yang terbentukdikeringkan dengan desikator, lalu ditimbang, kemudian dilarutkan dengan 2 mL metanol KCKT. Medium sebanyak 10 mL dikeringkan dengan freeze dryer untuk menghilangkan kandungan airnya, diekstrak dengan 10 mL metanol teknis, dan dilanjutkan dengan penyaringan menggunakan kertas saring Whatman no.1, residunya dibilas dua kali dengan 5 mL metanol teknis. Selanjutnya filtrat diuapkan dengan vaccum rotary evaporator sampai semua pelarut menguap. Ekstrak kasar yang terbentuk dikeringkan dengan desikator, lalu ditimbang dan dilarutkan dengan 2mL methanol KCKT (Endress, 1994). Analisis Kualitatif Dan Kuantitatif Analisis kualitatif dan kuantitatif azadirahtin dilakukan dengan menggunakan KCKT merk Shimadzu dengan jenis kolom Shim-pack CLC-ODS . Elusi dilakukan dengan menggunakan metanol: air (6:4) secara isokratik dengan kecepatan aliran 1 mL/menit dan diamati pada UV 214nm. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi puncak (peak) pada sampel dengan azadirahtin standar ( SIGMA ) (Croes, 1995). Analisis kuantitatif dilakukan dengan cara mengkonversi luas area sampel dengan luas area standar. Kurva standar diperoleh dari data luas area berbagai konsentrasi larutan azadirahtin standar, kemudian dibuat hubungan luas area dengan kandungan azadirahtin (Croes, 1995). Pengaruh Penambahan Skualen Terhadap Kandungan Azadirahtin Berdasarkan kurva kandungan azadirahtin didalam sel, penambahan skualen ke dalammedium kultur dilakukan pada umur kultur 6 hari, yaitu saat akumulasi kandungan azadirahtin di dalam sel hampir mencapai maksimum. Penambahan prazat eksogen untuk meningkatkan kandungan metabolit sekunder di dalam sel sebaiknya dilakukan pada saat kandungan metabolit sedang meningkat. Penambahan skualen pada konsentrasi 10, 100 dan 1000 M ke dalam medium kultur memperlihatkan peningkatan kandungan azadirahtin bila dibandingkan dengan kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa skualen mempunyai peran yang

6 nyata dalam jalur biosintesis azadirahtin. Semua senyawa triterpenoid diturunkan dari triterpen linear tak jenuh yang disebut skualen. Penambahan prazat ke dalam kultur dapat merangsang enzim tertentu dalam jalur biosintesis, sehingga dapatmeningkatkan produksi metabolit sekunder umur kultur (hari) azadirachtin (g /g BK sel ) kontrol alkohol 10 uMskualen 100 uMskualen 1000 uMskualen. Diagram batang kandungan azadirachtin di dalam sel pada kultursuspensi sel Azadirachta indica A.Juss yang ditambah skualen 10, 100 dan 1000 M dibandingkan dengan control. Kandungan azadirahtin tertinggi di dalam sel diperoleh pada penambahan 100M skualen dengan waktu pengamatan empat hari setelah penambahan atau pada kultur berumur 10 hari yaitu 0,0076 0,006 g/g BK. Kandungan azadirahtin pada perlakuan ini berbeda nyata dengan kandungan azadirahtin pada penambahan konsentrasi skualen lainnya maupun dengan kontrol. Waktu akumulasi kandungan azadirahtin pada kultur setelah penambahan skualen lebih lama bila dibandingkan dengan kandungan azadirahtin sebelum penambahan (Vickery, 1981). Hal ini menunjukkan bahwa masuknya skualen ke dalam jalur biosintesis memerlukan rentang waktu tertentu. Kandungan azadirahtin di dalam sel setelah penambahan skualen memperlihatkan peningkatan maksimum sebesar 85,366% bila dibandingkan dengan kandungan azadirahtin tertinggi pada kontrol (0,041 g/g BK). Bila dibandingkan antara penambahan 10 dan 1000 M skualen dengan penambahan 100 M ke dalam medium, terlihat bahwa kandungan azadirahtin pada penambahan 100 M skualen memberikan hasil yang lebih baik. Hal ini menunjukkan bahwa penambahan skualen ke dalam medium mempunyai kisaran konsentrasi tertentu untuk pdapat meningkatkan kandungan azadirahtin secara optimum baik didalam sel maupun kandungan. Dalam hal ini penambahan skualen ke dalam medium selain berperan sebagai substrat bagi enzim untuk pembentukan azadirahtin, konsentrasi skualen juga merupakan faktor pembatas dalam pembentukan azadirahtin. Keadaan ini diduga berhubungan dengan jumlah dan kerja enzim yang terlibat dalam jalur biosintesis azadirahtin (Vickery, 1981). Penambahan skualen juga meningkatkan kandungan azadirahtin di dalam medium. Kandungan azadirahtin tertinggi dicapai pada penambahan 100 M skualen dengan waktu pengamatan hari ke-6 setelah penambahan atau pada kultur berumur 12 hari yaitu 0,229 0,003 mg/mL. Hal ini memperlihatkan bahwa setelah penambahan skualen sekresi azadirahtin dari sel ke dalam medium tetap terjadi (Mantell, 1983). Senyawa-senyawa triterpenoid, fenol, dan beberapa alkaloid mempunyai mekanisme sekresi alami berupa sekresi pasif melalui difusi. Selain itu akumulasi metabolit sekunder didalam sel atau sekresinya ke medium berlangsung lebih cepat bila dibandingkan dengan degradasinya umur kultur (hari) (Mantell, 1983). Peranan Zat Azadirahtin Sebagai Bioinsektisida Yang Bersifat Antifeedant Dan Mengganggu Pertumbuhan Serta Reproduksi Serangga (Ecdysone -Blocker) Bioinsektisida adalah bahan-bahan alami yang bersifat racun serta dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan, tingkah laku, perkembangbiakan, kesehatan, memengaruhi hormon, penghambat makan, membuat mandul, sebagai pemikat, penolak, dan aktifitas lainnya yang dapat memengaruhi organisme pengganggu tanaman. Bioinsektisida dapat dijadikan sebagai solusi pemecahan masalah penggunaan insektisida sintetik. Hal ini dikarenakan aplikasi bioinsektisida pada umumnya tidak menimbulkan residu sehingga aman bagi kesehatan manusia (Crocomo, 1981). Tanaman nimba ( Azadirachta indica A.Juss )mengandung zat toksik bagi serangga hama. Serangga yang menjadi hama di lapangan maupun pada bahan simpan mengalami kelainan tingkah laku akibat bahan efektif yang dikandung pada nimba. Berbagai zat aktif

7 terkandung dalam nimba diantaranya adalah azadirachtin, salanin, meliantriol, nimbin, dan nimbidin. Semua zat aktif tersebut bermanfaat bagi kehidupan manusia (Crocomo, 1981). Tanaman nimba mengandung bahan aktif azadirahtin (C35H44O16), meliantriol dan nimbin. Azadirahtin mengandung sekitar 17 komponen sehingga sulit untuk menentukan jenis komponen yang paling berperan sebagai bioinsektisida. Kematian hama akibat dari penggunaan nimba terjadi pada pergantian instar-instar berikutnya atau pada proses metamorfosis. Nimba tidak membunuh hama secara cepat, tetapi berpengaruh terhadap hama pada daya makan, pertumbuhan, daya reproduksi, proses ganti kulit, hambatan pembentukan serangga dewasa, menghambat perkawinan, menghambat pembentukan kitin dan komunikasi seksual (Crocomo, 1981). Biji dan daun nimba mengandung beberapa jenis metabolit sekunder yang aktif sebagai pestisida, diantaranya azadirachtin, salanin, meliatriol, dan nimbin. Senyawa kimia tersebut dapat berperan sebagai penghambat pertumbuhan serangga, penolak makan (antifeedant), dan repelen bagi serangga. Metabolit lain yang terdapat di dalam mimba adalah mimbandiol 3-desasetil salanin, salanol, azadiron, azadiradion, epoksiazadiradion, gedunin, dan alkaloid. Kematian serangga dapat terjadi dalam beberapa hari, tergantung dari stadia dan siklus hidup serangga target. Akan tetapi, apabila termakan dalam jumlah kecil saja mengakibatkan serangga tidak bergerak dan berhenti makan. Aktivitas residu insektisida dari azadirachtin ini umumnya terjadi antara 7-10 hari atau lebih lama lagi, tergantung dari jenis serangga dan aplikasinya (Crocomo, 1981). Efek primer dari zat azadirahtin terhadap serangga adalah berupa antifeedant dengan menghasilkan stimulan deterren spesifik berupa kimia ( khemoreceptor ) pada bagian mulut yag bekerja bersama-sama dengan dengan reseptor kimia lainnya yang mengganggu presepsi ransangan untuk makan (Crocomo, 1981). Sedangkan efek sekunder dari zat azadirahtin terhadap serangga adalah berupa pengaturan perkembangan dan reproduksinya, akibat efek lansung pada sel somatik dan jaringan reproduksinya serta efek tidak lansung yang mengganggu pada proses neuroendocrine, zat azadirahtin menyebabkan ecdysone blocker yang menghambat serangga memproduksi dan melepas hormon hormon fital dalam metamorfosis. Akibatnya serangga tidak dapat mengganti kulit sehingga siklus hidupnya terganggu (Crocomo, 1981).

8 KESIMPULAN Inovasi bioreaktor sistem aseptis pada penambahan skualen triterpen linear tak jenuh akan berpengaruh terhadap peningkatan metabolit sekunder yang merupakan kandungan senyawa triterpenoid azadirahtin dalam kultur suspensi sel tanaman nimba ( azadirachta indica a.juss ) sebagai produksi bioinsektisida dimana akan berperan sebagai bioinsektisida karena bersifat antifeedant atau biasa lebih dikenal sebagai penolak makan pada serangga dan mengganggu pertumbuhan serta reproduksi serangga ( Ecdysone Blocker ). Pertumbuhan kultur suspensi terbaik dengan berat kering sel tertinggi (0,259 g) adalah pada penambahan 0,1 M 2,4-D dan1,0 M BAP. Kandungan azadirahtin tertinggi di dalam sel sebelum penambahan skualen (0,041 g/gBK) adalah pada kultur yang berumur 8 hari. Penambahan skualen berpengaruh nyata dalam meningkatkan kandungan azadirahtin di dalam sel. Inovasi bioreaktor dan penambahan prazat ke dalam medium kultur dapat merangsang aktivitas enzim tertentu yang terlibat dalam jalur biosintesis, sehingga dapat meningkatkan produksi metabolit sekunder. Prazat skualen digunakan untuk meningkatkan kandungan senyawa triterpen secara in vitro yang merupakan senyawa triterpen linear tak jenuh dan prazat untuk semua triterpen. Penambahan skualen sebagai prazat kedalam kultur sel Azadirachta indica A.Juss dapat meningkatkan kandungan azadirahtin secara in vitro. Azadirahtin dapat digunakan sebagai bioinsektisida karena bersifat antifeedant atau biasa lebih dikenal sebagai penolak makan pada serangga dan mengganggu pertumbuhan serta reproduksi serangga ( Ecdysone Blocker ).

9 DAFTAR PUSTAKA Endress, R. 1994. Plant Cell Biotechnology. New York: Springer-Verlag. Crocomo, O.J., Aquarone, E., & Gottlieb, O.R, .1981. Biosynthesis of Secondary Product in vitro, dalam Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture .New York: T.A. Thorpe; Academic Press. Croes, A.F., Jacobs, J.J.M.R., Arroo, R.R.J., & Wullems, G.J, .1995. Molecular and Metabolic Control of Secondary Metabolism , Plant Cell, Tissue and Organ Culture. New York: Academic Press. Gunawan, L.W., 1987. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi, IPB. Mantell, S.H., & Smith, H, . 1983. Plant Biotechnology. London: Cambridge University Press, Cambridge. Pierik, R.L.M,.1997. in vitro Culture of Higher Plant. Netherlands. : Martinus Nyhoff. Ratledge C, Kristiansen B. 2001. Basic Biotechnology. Cambridge: Cambridge University. Schmutterer, H. 1995. The Neem Tree Source of Unique Natural Products for Integrated Pest management, Medicine, Industry and Other Purpose. New York : VCH Publishers Inc. Veeresham, C., Kumar, M.R., Sowjanya, D., Kokate, C.K., & Apte, S.S., 2001 Production of Azadirachtin from Callus Cultures of Azadirachta indica, Fitoterapia. London: Cambridge University Press, Cambridge. Vickery, M.L., & Vickery, B. 1981. Secondary Plant Metabolism. London: The Macmillan Press. Ltd. Wetter, L.R., & Constabel, F. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman. Edisi kedua, Bandung: Penerbit ITB, Bandung.

10 DAFTAR RIWAYAT HIDUP PENULIS DAFTAR RIWAYAT HIDUP 1. Ketua Peneliti Nama Lengkap / Panggilan : Mangasa Tua P.S / Mangasa Tempat, Tanggal lahir : Samarinda, 27 September 1992 Agama : Kristen Protestan Anak Ke: 2 dari 4 bersaudara Alamat Rumah : Jl. Margosantoso No.105 Kab. Kutai Timur Alamat Kost : Jl. Banjarsari Gg. Maerasari No. 2 Semarang Status : Mahasiswa Biologi Universitas Diponegoro Fakultas/Jurusan/Angkatan : MIPA / Biologi / 2010 No. Hp : 085246868471 Nama Orangtua : Ayah : Drs. Lamhot H Siregar Ibu : Julita Pekerjaan : Ayah : PNS Ibu : PNS Motto Hidup : Jadilah lilin yang rela mati demi terang. Cita-cita : Menjadi Peneliti Sains Semarang, 27 Februari 2012

Mangasa Tua P.S NIM. 24020110130048

11 2. Anggota 1 Nama Lengkap / Panggilan Tempat, Tanggal lahir Agama Anak KeAlamat Rumah Alamat Kost Status Fakultas/Jurusan/Angkatan No. Hp Nama Orangtua Pekerjaan Motto Hidup Cita-cita : Jepri Agung Priyanto/ Jepri : Indramayu, 01 Juli 1993. : Islam :1 : Ds. Lombang RT/RW 06/04 Indramayu. : Jl. Banjarsari Gg. Maerasari No. 2 Semarang : Mahasiswa Biologi Universitas Diponegoro : MIPA / Biologi / 2010 : 085740734577 : Ayah : Eryanto Ibu : Yanti : Ayah : Wiraswasta Ibu : Ibu Rumah Tangga : life for us. : peneliti dan dosen Semarang, 27 Februari 2012

Jepri Agung Priyanto NIM. 24020110110033

12 LAMPIRAN Lampiran Daun, Bunga, dan Buah Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss )

(Schmutterer,1995) Struktur Molekul Azadirahtin Tanaman Nimba ( Azadirachta indica A.Juss )

( Veeresham,2001 )

13 Pengaruh Azadirahtin Pada Tanaman Nimba Terhadap Metamorfosis Insekta.

(Veeresham,2001) Struktur suatu bioreaktor.

( Ratledge, 2001 ).