METABOLISME NITROGEN Nitrogen (N) diperlukan oleh semua organisme untuk sintesa protein, asam amino, asam nukleat

dan senyawa organik lain yang mengandung N. Keberadaan nitrogen hampir 80% dari atmosfir dunia. dan diduga setiap are tanah subur mengandung lebih dari 30.000 ton N2. Karena sebagian besar keberadaan nitrogen dalam bentuk molekul gas, maka tidak satupun organisme eukaryotik mampu menggunakannya secara langsung. Akan tetapi, N2 harus bersenyawa dengan unsur lain seperti oksigen membentuk NO3- (ion nitrat) dan hidrogen membentuk NH4+ (ion amonium) agar bisa dimanfaatkan oleh organisme. Kedua bentuk senyawa ion di atas dapat digunakan oleh organisme yang bersifat autotrof. Nitrogen yang terdapat dalam tanah sebagian besar berupa senyawa organik hasil pembusukan organisme (tumbuhan, hewan, dll), sedangkan lainnya berasal dari pclarutan batuan, air hujan (dalam bentuk nitrat, amonia) serta aktivitas gunung berapi. Beberapa proses kimia dan fisika dalam tanah, air dan udara, serta bersama-sama dengan aktivitas beberapa mikroorganisme tertentu memainkan peranan penting untuk menjaga keberadaan (pengasimilasian dan pengubahan) molekul nitrogen di alam dalam bentuk yang siap digunakan oleh tumbuhan dan organisme lainnya. Semua proses dan kejadian tersebut di atas berlangsung dalam suatu siklus yang disebut siklus nitrogen (gambar 4.1). Salah satu proses yang terjadi adalah peristiwa penambatan (fiksasi) N 2

Gambar 4.1 Siklus Nitrogen (sumber: Enger & Ross, 2003)

Selama fase awal daur nitrogen, gas nitrogen dikonversi menjadi ammonia dengan bantuan mikroorganisme tertentu, yang prosesnya dikenal dengan istilah fiksasi nitrogen. Proses ini dapat dilakukan oleh dua jenis bakteri yang termasuk dalam kelompok bakteri non-simbiotik dan simbiotik. Bakteri pengikat N2 yang non-simbiotik dalam populasinya yang tinggi ditemukan pada rhizosphere, daerah tempat terjadinya persentuhan antara akar dan tanah. Azotobacter (bersifat aerob) adalah salah satu contoh bakteri yang non-simbiotik. Beberapa contoh yang lain adalah Beijerinckia (obligate aerob), Clostridium; C. fasteurianum (anaerob), dan Klebsiella, Enterobacter, Bacillus termasuk kelompok yang bersifai fakultative anaerob. Contoh dari jenis bakteri yang fotoautotrop adalah spesies tertentu yang termasuk dalam kelompok Rhodospirillum dan Chlorobium. Beberapa spesies yang tennasuk ke dalam Cyanobacteria (bersifat aerob) juga mampu mengikat N2 bebas karena memiliki enzim nitrogenase dalam struktur khusus yang disebut heterocysts, yang memiliki kondisi anaerob untuk fiksasi. Semua kelompok bakteri di atas memberikan kontribusi penting untuk penyediaan nitrogen pada daerah hutan basah, padang rumput dan daerah tundra. Penambatan nitrogen secara simbiotik memiliki peranan yang sangat penting untuk pertumbuhan tanaman produksi. Beberapa jenis bakteri dari genus Rhizobium dan Bradyrhizohuim dapat melakukan penambatan gas nitrogen dengan cara bersimbiosis dengan tanaman polong-polongan

(Leguminosae), seperti kedelai, buncis, kacang tanah, kacang ijo, alfalfa (sejenis tanaman polong untuk makanan kuda dan sapi di USA) dan .semanggi. Bertolak dari hal di atas, maka penambatan nitrogen sangat tergantung dari hubungan simbiotik antara Leguminosae dengan strain Rhizobium yang efektif. Jumlah N2 yang tertambat dipengaruhi secara genetik baik oleh Rhizobium maupun inang tanaman yang spesifik. Oleh karena itu bintil akar tanaman Leguminosae mungkin gagal berkembang atau sebaliknya sangat efektif di dalam tanah. Bintil akar adalah hasil simbiosis tanaman dari jenis Leguminosae dengan Rhizobium yang mampu melakukan penambatan N2. Bintil akar terbentuk melalui serangkaian proses yang diawali kolonisasi bakteri Rhizobium pada rambut akar (gambar 4.2).

Gambar 4.2 Proses terjadinya bintil akar

Kolonisasi bakteri Rhizobium ini diduga bisa terjadi karena adanya suatu protein tanaman yang disebut "lektin" yang rnungkin berinteraksi dengan Rhizobium spesiifik sehingga memungkinkan tanaman untuk mengenal dan menerima tipe Rhizobium yang cocok. Sebagai contoh, menurut Bhuvaneswari dan Bauer (1978) reseptor lektin spesifik pada permukaan sel B. japonicum, dikondisikan oleh lingkungan yang diberikan oleh akar tanaman inang. Rhizobium masuk tumbuhan inang melalui rambut akar yang kemudian berubah bentuk karena substansi seperti hormon yang dihasilkan oleh bakteri. Kemudian bakteri bermigrasi ke dalam struktur seperti benang, memperbanyak diri yang pada akhirnya bakteri tersebut tersebar di sepanjang rambut akar sampai ke jaringan akar. Kolonisasi sel-sel akar dalam jaringan tanaman inang terjadi apahila bakteri dibebaskan dari benang infeksi dan hal ini melibatkan enzim pektinase dari Rhizobium dan selulase dari sel tanaman. Dalam perkembangannya bakteri secara terus menerus mengalami modifikasi baik struktur maupun fungsi dan menjadi bakteroid yang kaya enzim nitrogenase, suatu enzim yang mampu mengikat/menambat nitrogen. Satu atau beberapa bakteroid dilindungi oleh struktur bermembran yang mungkin merupakan tempat terbentuknya pigmen merah, leghaemoglobin. Pigmen ini menentukan ciri warna bintil akar yang aktif menambat nitrogen. Penambatan nitrogen umumnya mencapai puncak pada awal pengisian

polong dan menurun selama akhir fase reproduktif (Keyser dan Fudi, 1992). Sebaliknya pada biji kedele yang mengandung 40% protein, menurut Salisbury (1992) bahwa kira-kira 90% penambatan nitrogennya berlangsung selama periode perkembangan reproduktif dan kira-kira 10% terjadi selama dua bulan pertama pertumbuhan vegetatif. Bray (1993) mengatakan bahwa sistem simbiotik mampu menambat nitrogen apabila memenuhi 3 persyaratan pokok seperti : 1. adanya bintil akar; 2. terjadinya diferenensiasi bakteri menjadi bakteroid; 3. menghasilkan leghaemoglobin Selain hal tersebut di atas, menurut Sprent (1979) faktor lingkungan juga dapat mempengaruhi penambatan nitrogen pada tanaman jenis legum seperti temperatur, kelembaban, air, salinitas, pH, nutrien dan adanya bakteri Rhizobium yang cocok. Keseluruhan reaksi kimia penambatan nitrogen adalah sebagai berikut.

N2 + 8e- + 6 Mg ATP + 16 H2O

2 NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 Pi + 8 H+

Proses tersebut membutuhkan sumber elektron dan proton, molekul ATP, kompleks enzim nitrogenase. Sumber elektron dan proton berasal dari karbohidrat yang ditranslokasikan dari daun kemudian di respirasikan oleh bakteri. Respirasi karbohidrat dalam bakteroid menyebabkan reduksi NAD+ menjadi NADH atau NADP+ menjadi NADPH dan juga terjadi reduksi flavodoksin. NADH, NADPH dan flavodoksin kemudian mereduksi feredoksin atau protein yang sama yang efektif mereduksi N2 menjadi NH4+ NH4+ yang terbentuk akan ditranslokasikan dari bakteroid sebelum dapat dimetabolisme dan digunakan oleh tanaman inang. Dalam sitosol sel-sel yang mengandung bakteroid, NH4+ diubah menjadi glutamin, asam glutamat dan asparagin, sedangkan pada beberapa spesies tertentu NH 4+ dapat diubah menjadi senyawa-senyawa kaya nitrogen yang disebut ureida. Dua macam ureida pokok pada tanaman legum adalah allantoin dan asam allantoik. Asparagin dan ureida, lewat sel transfer masuk ke dalam saluran xilem kemudian diangkut ke akar dan batang. Di sini senyawa-senyawa tersebut dipecah kembali menjadi NH,+ dan secara cepat diubah menjadi asam-asam amino, amida dan protein.

4.2 Reduksi Nitrat Secara umum reduksi nitrat mengikuti reaksi seperti di bawah ini: NO3_ + 8e+10H + NH4+ + H2O

Meski demikian, pada dasarnya reaksi di atas berlangsung dalam dua tahap dengan bantuan enzim yang berbeda. Tahapan reaksinya adalah sebagai berikut.

1. Reduksi nitrat : NO3- + NADH + H+

NO2-+ NAD+ + H2O

Reaksi ini berlangsung di dalam plasma dengan bantuan. enzim nitrat reduktase (NR). Enzim ini merupakan enzim molibdoflavoprotein yang mampu mengatur kecepatan pembentukan protein pada tumbuhan yang menggunakan NO 3sebagai sumber nitrogennya.

2. Reduksi nitrit : NO2- + 3 H2O + 6Fd + 2 H+

cahaya

NH4+ + 1,5 O2 +2 H2O + 6Fd

Reaksi di atas terjadi pada kloroplas (pada daun) atau pada proplastida (pada akar) dengan enzim nitrit reduktase sebagai katalisnya. Reduksi nitrat yang dikatalis oleh NR sangat tergantung dari aktivitas NR tersebut dan aktivitas NR itu sendiri ditentukan oleh konsentrasinya. Kadar NO3" yang tinggi dalam sel dan cahaya juga dapat memacu aktivitas NR. Peranan cahaya terhadap aktivitas NR dapat melalui beberapa cara, antara lain : 1. cahaya dapat mengaktifkan fotosintesis sehingga dihasilkan ATP untuk menggerakkan NO3 dari vakuola ke plasma. 2. cahaya mengaktifkan sistem fitokrom yang berperan menaikkan kemampuan ribosom membuat protein (termasuk NR). 3. cahaya menginaktifkan protein yang bersifat inhibitor bagi NR. 4. cahaya menaikkan penyediaan karbohidrat dan proses respirasi, dimana dari proses ini dihasilkan NADH yang diperlukan untuk proses reduksi. Selain kedua proses (fiksasi N dan reduksi nitrat) di atas, dalam siklus nitrogen juga terjadi beberapa proses fisika/kimia lainnya, seperti amonifikasi, nitrifikasi dan denitrifikasi. 4.2.1 Amonifikasi Sebagian besar keberadaan N2 di dalam tanah dalam bentuk molekul inorganik. Organisme yang sudah mati diuraikan melalui proses hidrolisis yang menyebabkan protein terurai menjadi asam amino. Proses ini disebut deaminasi.

Proses selanjutnya, asam amino yang sudah terbentuk dikonversi menjadi ammonia (NH3) dan proses ini disebut amonifikasi Amonifikasi dibantu oleh beberapa mikroorganisme seperti jamur. Kedua proses di atas secara sederhana dapat digambarkan sebagai berikut. mikroba pengurai Protein dari organism mati dan sampah produksi Bakteri /Jamur Asam amino Amonia (NH3) (Amonifikasi) Asam amino (Deaminasi) bakteri dan

Amonia merupakan senyawa dalam bentuk gas, pada tanah yang kering mudah menguap, sebaliknya pada tanah yang lembab/basah ammonia terlarut dalam air dan membentuk ion ammonium (NH4+ ). Reaksinya sebagai berikut.

NH3 + H20

NH4+ OH

NH4+ + OH-

Selanjutnya ion amonium dapat digunakan oleh bakteri dan tumbuhan untuk sintesa asam amino. Walaupun demikian, pemanfaatan nitrogen oleh kebanyakan tumbuhan umumnya dalam bentuk NO3- karena NH4+ akan dioksidasi menjadi NO3- oleh bakteri nitrifikasi. Disamping itu ammonium/amonia ini bersifat racun bagi tumbuhan dan dapat menghambat pembentukan ATP di kloroplas dan mitokondria. 4.2.2 Nitrifikasi Nitrifikasi merupakan proses oksidasi ion amonium menjadi nitrat(NO 3-). Proses ini dilakukan oleh bakteri autotrof yang termasuk ke dalam genus Nitrosomonas dan Nitrobacter. Nitrosomonas akan mengoksidasi ion amonium menjadi nitrit (NO2-) dan selanjutnya Nitrobacter akan mengoksidasi nitrit (NO 2-) menjadi nitrat (NO3-). Tumbuhan cenderung menggunakan nitrat (NO3-) sebagai sumber nitrogen untuk sintesa protein karena nitrat memiliki mobilitas yang lebih tinggi di dalam tanah dan lebih mudah terikat dengan akar tanaman daripada amonium. Meski sebenarnya ion amonium lebih efisien sebagai sumber nitrogen karena memerlukan lebih sedikit energi untuk sintesa protein, tetapi karena bermuatan positif maka lebih sulit dimanfaatkan karena sudah lebih dulu terikat oleh tanah lempung yang bermuatan negatif.

4.2.3 Denitrifikasi Dalam beberapa tahap selama berlangsungnya siklus nitrogen, terjadi pembebasan dan pengikatan N2 bebas (atmospheric nitrogen). Terlepasnya N 2 bebas akibat suatu proses yang terjadi dalam siklus nitrogen disebut denitrifikasi, yang pada dasamya adalah konversi nitrat menjadi gas nitrogen. NO3NO2N 20 N2

Beberapa spesies dalam genus Pseudomonas merupakan kelompok bakteri terpenting yang melaksanakan proses denitrifikasi dalam tanah. Sejumlah jenis yang lain seperti Paracoccus, Thiobacillus, dan Bacillus juga mampu melakukan proses denitrifikasi. Bakteri-bakteri yang termasuk ke dalam kelompok ini adalah pada umumnya merupakan mikroorganisme yang aerob, tetapi pada kondisi anaerob mereka juga mampu menggunakan nitrat dalam situasi dimana oksigen berperan sebagai akseptor elektron akhir (anaerobic respiration). Proses denitrifikasi tidak menguntungkan bagi kesuburan tanah karena terjadi pembebasan N2 ke atmosfer dari senyawa nitrat.

4.3 Sintesa Asam Amino Asam amino merupakan senyawa organik dengan ukuran molekulnya yang kecil, mempunyai gugus NH dan COOH sehingga dapat bersifat asam atau basa tergantung pada pH lingkungannya. Selain dua jenis gugus di atas, beberapa asam amino juga mengandung gugus SH, OH, atau CONH. Asam amino biasanya ditemukan berdiri sendiri (bebas) dalam sel atau bersenyawa dengan asam amino lain membentuk protein. Tumbuhan dan mikroorganisme mampu mensintesis 20 asam amino standar, tetapi hewan tingkat tinggi dari kelompok mammalia tidak mampu mensintesis ke-20 asam amino tersebut. Oleh karena itu keperluan asam amino tersebut diperoleh dari jenis makanan yang dikonsumsinya. Asam amino yang tidak dapat disintesis tersebut termasuk ke dalam kelompok asam amino esensial, sedangkan sisanya yang dapat disintesis disebut asam amino nonesensial. Manusia tidak mampu mensintesis beberapa asam amino, yang termasuk ke dalam asam amino esensial, seperti Histidin (His), Isolesin (lie), Lesin (Leu), Lisin (Lys), Metionin (Met), Fenilalanin (Phe), Triptofan (Trp), Treonin (Thr), dan Valin (Val). Sedangkan yang ternasuk dalam kelompok non-esensial adalah Alanin (Ala), Arginin (Arg), Asam aspartat (Asp), Asparagin (Asn), Sistein (Cys), Glutamin (Gin), Asam glutamat (Glu), Glisin (Gly), Prolin (Pro), Serin (Ser),

dan Tirosin (Tyr). Proses biosintesis asam amino bermacam-macam dan biasanya bervariasi antara satu organisme dengan organisme yang lain, tetapi semuanya memiliki ciri-ciri yang umum yaitu merupakan turunan dari suatu daur metabolisme seperti siklus asam sitrat, glikolisis atau pentosa phosfat. Berdasarkan hal mi, rnaka asam amino dapat dikelompokkan menjadi enam berdasarkan cara

biosintesisnya yang tergantung dari siklus metabolisme mana kelompok asam amino tersebut di turunkan/disintesis (gambar 4.3).

Gambar 4.3 Pengelompokan asam amino berdasarkan cara biosintesisnya

Kelompok utama asam amino selalu dihasilkan dari proses transaminasi glutamat Meskipun demikian, sintesis asam amino asam glutamat, asam aspartat, dan alanin terjadi dari reaksi aminasi reduksi. Transaminasi merupakan reaksi dapat balik. Contoh reaksi gugus transaminasi amino antara yang paling terkenal dan adalah

transfer/pemindahan

glutamat

oksaloasetat

menghasilkan -ketoglutarat dan aspartat, seperti terlihat di bawah ini.

COOH

COOH

COOH

COOH

NH2

NH2

CH
2

CH2

CH2

CH2

CH
2

COOH

CH2

CH2

COOH Asam glutamat Asam oksaloasetat

COOH Asam-ketoglutarat

COOH Asam asparatat

Pada suatu rangkaian percobaan yang telah dilakukan menunjukkan bahwa glutamat dapat memberikan gugus aminonya untuk pembentukan 17 asam amino yang berbeda. Tipe transaminasi yang lain adalah glutamin atau asparagin bertindak sebagai donor gugus amino, seperti berikut ini.
transaminase glutamin + asam -ketoglutarat Asam -ketoglutarat-amida + H2O asam -ketoglutarat-amida + asam amino asam -ketoglutarat + NH3

Reaksi aminasi reduksi untuk pembentukan asam glutamat dari asam ketoglutarat memerlukan ion amonium. Reaksi ini dapat balik dan secara fisiologis penting dalam respirasi asam amino yang terbentuk selama penguraian protein. Pembentukan asam glutamat dikatalisis oleh enzim glutamat dehidrogenase dan prosesnya terjadi di mitokondria. COOH C=O C H2 C H2 COOH Asam -ketoglutarat + NH4+ + NADH2 COOH HC C C NH2 H2 H2 + NAD + H2O

COOH Asam glutamate

Asam

aspartat

dan

Alanin

masing-masing

terbentuk

dari

asam

oksaloasetat dan asam piruvat. Reaksi pembentukan kedua jenis asam amino di atas dapat digambarkan sebagai berikut.
dehidrogenase

(i) asam oksaloasetat + NH4 + NADH 2

asam aspartat + NAD + H 2O

alanin dehidrogenase (ii) asam piruvat + NH4+ + NADH2 alanin + NAD + H2O