DNA dan RNA

BAB 1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang DNA ditemukan baik dalam semua sel prokariotik dan eukariotik maupun dalam satu klas virus. Dalam sel eukariotik diploid satu atau lebih molekul DNA bergabung dengan poliamin dan protein dasar yang disebut histon. Bentuk gabungan ini merupakan bagian utama dari struktur kromosom dari inti sel. Tambahan pula eukariotik mempunyai molekulmolekul terpisah pada organ-organ kecil seperti mitokondria dan kloroplas. Sel prokariotik mempunyai satu kromosom yang terdiri dari satu DNA heliks rangkap dengan poliamin bermuatan positif. Molekul DNA tersusun dari dua rantai polinukleotida yang bergabung sepanjang seluruh rantai dan bergulung menurut suatu sumbu untuk menghasilkan heliks (spiral) rangkap. Bentuk heliks dasar adalah sama seperti - heliks pada protein. Struktur ini telah dikemukakan pertama kali dalam tahun 1953 oleh Watson dan Crick yang dalam tahun 1962 menerima hadiah nobel dalam ilmu kedokteran untuk sumbangan mereka. Serat-serat heliks rangkap tergabung dengan perantara ikatan hidrogen antara basa-basa: A pada T dan G pada C. RNA menyusun 5-10% dar berat kering sel. Ada tiga macam RNA seluler: 1. RNA penyampai (m-RNA) yang bertindak sebagai cetakan untuk sintesa rantai protein. 2. RNA ribosomal (r-RNA) yang bertindak sebagai komponen asam nukleat pada struktur ribosom sebagai tempat dilangsungkan sintesa protein. 3. RNA pemindah (t-RNA) yang bertindak sebagai pembawa asam amino spesifik pada pembentukan rantai polipeptida (R. Soendoro, 1989). DNA terutama dijumpai dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode geneticdan dapat mereproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru untuk reproduksi organisme itu, dalam sebagian besar organisme, DNA suatu sel mengarahkansintesis molekul RNA. Satu tipe RNA yakni RNA pesuruh (mrna) meninggalkan inti sel danmengarahkan biosintesis dari berbagai tipe protein dalam organisme itu sesuai dengan kodednanya (Pujiadi, 1994). Pemisahan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dankarbohidrat dilakukan melalui ekstraksi. Penggunaan nitrogen cair lebih memudahkan proses ekstraksi, namun ekstraksi dengan bufer CTAB ditambah 0,2% -mercaptoetanol danPVP mampu mengurangi broning. Ekstraksi dengan bufer ini tidak memerlukan nitrogen cair dan menghasilkan DNAgenom yang cukup baik. Ekstraksi tanpa nitrogen cair lebihefisien, terutama bagi laboratorium yang sulit mendapatkannitrogen cair. Penggunaan buffer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang ditunjukkan oleh pita DNA genom. Dengan demikian, bufer CTAB dapat digunakan

untuk mengisolasi DNA pada tanaman melinjo. Produk ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA yang terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi menggunakan image gel elektroforesis (Ardiana, 2009). DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek kuantitas dan kualitas untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis gel. Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0 (SAMBROOK et al., 1989). DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan sehingga mendapatkan konsentrasi yang seragam untuk digunakan dalama nalisis PCR. Selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA dan keutuhan DNA hasil isolasi. Reaksi amplifikasi DNA dilakukan menggunakan Mesin PCR (MJ Research tipe PCT-100), dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus 3 menit pada suhu 94C, dan diikuti dengan 45 siklus selama 1 menit pada suhu 94C (denaturasi), 1 menit pada suhu 37C (annealing), 2 menit pada suhu 72C (ekstensi). Seluruh produk amplifikasi DNA dilengkapi dengan ekstensi selama 1 menit pada suhu 72C. Analisis PCR dilakukan dengan total reaksi 20 mikro liter mengandung 10 ng DNA genomic cetakan, masing-masing dNTP 0,1 M (dATP, dCTP, dGTP, dandTTP), masingmasing primer RAPD 0,25 pmol, enzimTaq DNA polymerase 0,04 unit dalam larutan buffer 1X (20 mMTris-HCl pH 8,0, 100 mMKCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% glycerol, 0,5%, Tween 20, 0,5% nonidet P40 dan MgCl2 1,5mM). Hasil amplifikasi divisualisasikan menggunakan elektroforesis horizontal dengan gel agarose 1,5% (w/v) dalam buffer 1x TAE. Gel agarose kemudian direndam di larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet. Hasil elektroforesis difoto menggunakan BIO-RAD Gel Doc EQ (Syafruddin, 2011). Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negative sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmenfragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidiumbromid. Cara lain untuk melihat

visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidiumbromid sebelum dipaparkan di atassinar ultraviolet. Untukmemeriksaintegritas DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose. yang Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada DNA per-ml gel yang UV.DNA DNA g per-cm agarosetersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA kita. Cara lebihakurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian 0,027, diperoleh adalah denganmenggunakan spektrofotometer untaian tunggal mempunyai koefisien absorbsi

pada panjang gelombang 260 nm untaian ganda 0,02 dan RNA 0,025 Rasioabsorbsi 260/280 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein ataufenol (protein memiliki absorbs maksimum pada 280 nm). Sampel DNA yang murni memilikirasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan sampel RNA yang murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang masihtertinggal secara otomatis mengkalkulasi rasio ukankalibrasi dengan larutan di 260/280 nm dalam sampel. yang dan kuantitas asam nukleat. Yang blank Saat ini sudah banyak dijual alat spektrofotometer otomatik

perludiingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melak sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel.Yang digunakan sebagai blanko adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa (Harisha, 2007).

1.2 Tujuan Tujuan praktikum Biokimia Tanaman acara Pengukuran Total dan Kemurnian DNA/RNA adalah: 1. Untuk mengisolasi DNA/RNA guna memperoleh kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis. 2. Untuk mengetahui teknik-teknik isolasi DNA/RNA. 3. Untuk mengetahui cara kerja melakukan isolasi DNA/RNA.

BAB 2. BAHAN DAN METODE 2.1 Alat dan Bahan 2.1.1 Alat 1. Test tubes 2. Mikropipet 3. Spectrophotometer 4. Microwave 5. Tabung Erlenmeyer 2.1.2 Bahan 1. 0.25 gram agarose 2. 25 ml larutanTris-Borat-EDTA (TBE 1x) 3. 2 l Ethedium bromide 4. 6 l DNA 5. 1 l buffer loading 2.2 Cara Kerja Pembuatan gel agarose: 1. Menyiapkan alat dan bahan yang digunakan. 2. Menimbang agarose 0.25 gran 3. Memasukkan agarose ke dalam tabung Erlenmeyer 4. Menambahkan TBE 1x 25 ml 5. Memanaskan ke dalam microwave sebanyak 2 kali dengan waktu masing-masing 30 detikdengan suhu lebih dari 100o C 6. Menunggu hingga hangat kurang lebih 60o C 7. Menambahkan ETBR 2 l 8. Menuangkan ke dalam cetakan, menunggu hingga 15 menit

1. 2. 3. 4. 5.

Elektroforesis Mengambil sisir setelah beku, kemudian memasukkan gel ke dalam elektroforesis yang berisi TBE 1x. Mengambil 15 l DNA, dan meletakkan di atas kertas paraffin kemudian tambahkan loading dye 3 l pada tiap tiap sampel. Mencampur dengan metode pipeting. Mengambil campuran sebanyak 5 l dan 10 l kemudian memasukkan dalam sumur gel. Memasukkan marker sebagai penanda.

6. Me-Running selama 15 menit dengan tegangan 50 volt.

BAB 3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil Hasil praktikum isolasi DNA/RNA yaitu dapat dilihat dalam dokumentasi berikut :

Gambar 1.Foto Hasil Isolasi DNA Biji Kakao 3.2 Pembahasan Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi. Hai ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA diagarose berhubungan dengan besar moekul. Apabila pergerakannya tinggi maka DNA tersebut mempunyai ukuran tidak terlalu besar. Apabila terdapat plasmid, berarti DNA total yang diisolasi menunjukkan kemurnian yang tinggi. Akan tetapi dalam praktikum kali ini pergerakan DNA tidak dapat diamati, hal ini disebabkan kareana kesalahan teknis saat memaksukkan DNA ke dalam smur gel agarose. Bisa jadi DNA yang di masukkan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel agarose. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur gel tersedot kembali masuk ke dalam mikro pipet, sehingga sumr tidak berisi DNA. Berbagai teknik atau metode dapat dilakukan untukmengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman, organtanaman atau jaringan tanaman yang digunakan. Tetapipada dasarnya ada tiga faktor penentu dalam ekstraksi danpurifikasi DNA secara optimal : 1) Penghomogenanjaringan tanaman, 2) Komposisi penambahan larutan bufferpada saat

penggerusan biji/jaringan tanaman sampel, dan3) Penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnyauntuk tanaman tahunan. Tanaman melinjo merupakan tanaman tahunan yang mengandung senyawa antioksidan, sehingga perlu dilakukanoptimasi dalam mengisolasi DNAnya untuk memperolehDNA dengan kualitas yang tinggi. DNA tanaman dengan kualitas rendah akan menyebabkan hasil amplifikasifragmen DNA tidak optimum. Oleh sebab itu modifikasi pada metode ekstraksi yang sudah baku pada tanaman tertentu perlu dilakukan. Pada teknik ekstraksi melinjo digunakan fenol kloroformyang berfungsi sebagai pendenaturasi protein.Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut di dalam pelarut organik sepertifenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNAdengan menggunakan etanol yang berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Apabila fenol-kloroformmasih berada di dalam sampel maka ada kemungkinan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lainyang digunakan untuk analisis molekuler. Proses penggerusan atau homogenasi biji melinjo sampel tidak menggunakan nitrogen cair, tetapi cukup ditambahkan 0,5 ml buffer ekstraksi CTAB yang mempunyai fungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer. Hasil pengecekan kualitas DNA dengan menggunakan gel elektroforesis 1% juga menunjukkan hasil yang cukup memuaskan dimana DNA yang diperoleh terlihat utuh namun agak suram karena resolusi gambar kameranya yang terlalu rendah. DNA yang utuh ditandai dengan tidakadanya smear DNA yang dielektroforesis. Hal ini menjadi penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh akan lebih memberikan hasil yang relatif lebih akurat. Untuk membuktikan bahwa DNA yang telah diperoleh mempunyai kualitas yang sangat baik maka DNA tersebut digunakan sebagai cetakan (template) untuk analisis PCR dengan menggunakan program RAPD. Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer RAPD OPB-17menunjukkan bahwa DNA yang diamplifikasi menghasilkanpita DNA (amplikon) yang bagus dimana polapita DNA terlihat jelas dan tebal. Darihasil ini dapat dikatakan bahwa teknik isolasi DNA yang dipakai dalam kegiatan ini adalah sangat memberikan hasilyang nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA biji melinjo. Keberhasilan di atas, telah memberikan hasil bahwa dengan cara menghilangkan penggunaan nitrogen cair yang relatif sulit didapatkan, di samping juga harganya yangcukup mahal, tanpa penyimpanan sampel jaringan yang akan diisolasi serta dengan memodifikasi teknik yang digunakan dapat memberikan hasil DNA yang murni dan pola pita yang jelas ketika dilakukan proses PCR. Hal ini memberikan efek yang sangat signifikan pada pembiayaan dan efektivitas waktu, sehingga proses analisis molekuler bisa lebih hemat dan cepat. Dalam percobaan ini, pengerjaan ekstraksi danisolasi DNA lebih difokuskan pada bagaimana memodifikasi bahan kimia dan teknik yang digunakan, misalnya pada saat penggerusan, pemvortekan sampel, dan pengaturan

temperatur annealing yang digunakan pada saat denaturasi. Dalam prosesnya juga sering terjadi kegagalan hal ini disebabkan karena proses denaturasi yang tidak sempurna. Suhu yang diprogramkan biasanya 95C selama30 detik atau 97C selama 15 detik. Dari hasil dokumentasi tersebut tampak bahwa DNA/RNA terdapat pada tingkatan ke-3, yang memiliki berat 500 basepare. Hasil dokumentasi tersebut tidak terlalu jelas sehingga nampak DNA/RNA menyatu, padahal seharusnya ada dua DNA/RNA dalam sampel tersebut yang terpisah. Hal ini disebabkan karena kamera yang digunakan untuk mendokumentasikan hasil isolasi DNA/RNA tersebut memiliki resolusi yang rendah. DNA/RNA pada biji melinjo tersebut tergolong cukup berat yaitu berada pada tingkatan ke-3 yang kira-kira memiliki kisaran berat yaitu 500 basepare. Dari hasil ini maka pengisolasian DNA/RNA cukup berhasil dengan metode yang sederhana dan waktu yang singkat. Langkah langkah dalam isoasi DNA/RNA diatas dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut : 1. Pembuatan ekstraksi sampel Dalam membuat ekstraksi sampel kita membutuhkan biji melinjo yang telah masak untuk digunakan sebagai sampel. Setelah sampel disiapkan timbang 1 g sampel kemudian dilakukan penggerusan. Usahakan gerus sampel hingga halus. Hasil tumbukan kemudian dimasukkan kedalam ependorf yang berisi 400 l buffer AP1 dengan menggunakan spatula. Bu ffer AP1 pada ependorf harus sudah disiapkan sebelum penumbukan, sehingga pada saat daun telah halus secepat mungkin dimasukkan dalam buffer untuk mencegah oksidasi akibat menguapnya nitrogen cair. Kemudian dikocok menggunakan tangan (tapping) hingga semua partikel biji tercampur merata dengan Buffer AP1. Selanjutnya ditambahkan RNase sebanyak 4 l (100 mg/mL) untuk menghilangkan kontaminan RNA agar dihasilkan DNA bebas RNA, kemudian divortex secepatnya. Larutan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit, posisi ependorf cup dibolak balik atau diinvert. Selanjutnya ditambahkan 130 l buffer AP2 dan dihomogenkan dengan cara insersi atau dibolak-balik, setelah itu secepatnya homogenan diinkubasikan pada pecahan es batu selama 5 menit. Homogenan disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm hingga diperoleh supernatant (letak ependorf cup harus seimbang). 2. Pembuatan Gel Elektroforesis Membuat gel elektroforesis dengan konsentrasi gel 1% agarose yang terdiri dari tahap menimbang agarose 0,25 gram selanjutnya masukkan dalam tabung erlenmeyer, setelah itu menambahkan TBE 1x sebanyak 25 ml, selanjtnya dimikrowave 2x masing-masing selama 30 menit dengan suhu diatas 100o C, keluarkan dari microwave dan tunggu hingga hangat kurang lebih suhu 60o C, kemudian tambahkan ETBR 2 l, tahap terakhir yaitu tuangkan pada cetakan dan tunggu gel sampai membeku kurang lebih selama 15 menit.
3. Tahap yang ketiga yaitu elektroforesis

Dalam tahap ini setelah gel membeku, ambil sisirnya dan masukan gel dalam alat elektroforesis yang berisi TBE 1x, setelah itu ambil 15 l DNA, letakkan di atas kertas parafin dan tambahkan loading dye 3 l pada tiap-tiap sampel, tahap selanjtnya yaitu mencampur dengan metode pipeting. Setelah selesai ambil campuran sebanyak 5 l dan 10 l keudian masukkan dalam sumur gel. Masukkan marker sebagai penanda, kemudian running selama 15 menit dengan tegangan 50 volt. 4. Tahap yang terakhir adalah mendokumentasikan dengan polaroid film di bawah sinar UV atau menggunakan kamera beresolusi gambar yang tinggi.

BAB 4. PENUTUP 4.1 Kesimpulan Dari hasil yang kita peroleh dalam praktikum isolasi DNA/RNA maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1. Hasil elektroforesisi menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi. 2. Dari hasil dokumentasi tersebut tampak bahwa DNA/RNA terdapat pada tingkatan ke-3, yang memiliki berat 500 basepare. 3. Ada tiga faktor penentu dalam ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal: 1) Penghomogenan jaringan tanaman, 2) Komposisi penambahan larutan bufferpada saat

penggerusan daun/jaringan tanaman sampel, dan 3) Penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnyauntuk tanaman tahunan. 4. Metode yang dilakukan dalam praktikum kali ini cukup berhasil, hal ini dapat dilihat dari hasil dokumentasi yang tampak bahwa letak DNA berada pada tngkatan ke-3 dari posisi marker. 5. Dari hasil dokumentasi, DNA sampel hasilisolasi terlihat memiiki DNA ganda, namun tidakterlalu jelas dikarenakan kamera yang digunakan untuk pendokumentasian memilikiresolusipanjang gelombang yang rendah. 4.2 Saran Dalam mendokumentasikan isolasi DNA/RNA harus menggunakan kamera yang mempunyai resolusi gambar yang tinggi agar gambar yang diperoleh jelas. Serta dalam mengisolasi DNA/RNA minimalisir terjadinya kesalahan teknis oleh praktikan agar hasil yang diperoleh tepat dan benar.

DAFTAR PUSTAKA Ardiana,DwiWahyuni. 2009. TeknikIsolasiDnaGenomTanamanPepaya Dan JerukDenganMenggunakanModifikasiBuferCtab. BuletinTeknikPertanian 14(1). 12:16. Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction to biotechnology).Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada. Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Soendoro, R. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia. Jakarta : Erlangga. Syafruddindan Tri JokoSantoso.2011.OptimasiTeknikIsolasi Dan PurifikasiDNA Yang Efisien Dan EfektifPadaKemiriSunan (Reutalistrisperma (Blanco) Airy Shaw).JurnalLittri 17(1). 11:17