Anda di halaman 1dari 16

4.

1 Pembahasan Di laboratorium virologi Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Jakarta II ini melakukan pemeriksaan virus WSSV (White Spot Sydrome Virus), TSV (Tautra Syndrome Virus), KHV (Koi Herpes Virus). Pemeriksaan WSSV dan TSV pada udang serta KHV pada jenis ikan carper (mas, koi, dan koki) ini dilakukan dengan biologi molekuler metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Dalam melakukan metode ini dipeerlukan peralatan dan bahan yang khusus dalam biologi molekuler. Dari pemeriksaan tigas jenis virus ini memiliki perbedaan bahan dan metode walaupun tahapan biologi molekuler yang dilakukan sama yaitu ekstraksi, amplifikasi, dan elektroforesis. Dalam melakukan pemeriksaan biologi molekuler dengan metode PCR ini alat dan bahan yang digunakan merupakan alat dan bahan yang harganya relatif mahal serta dalam melakukan metode PCR harus dengan ketelitian tinggi dalam pengerjaannya. Hal yang penting dalam metode PCR ini adalah kecepatan, spesifitas dan sensitifitasnya. PCR sangat spesifik karena dapat mendeteksi mikroorganisme pada tingkatan DNA/ RNA. DNA/RNA virus dapat diketahui secara cepat dan sampel yang akan diuji dapat dalam jumlah banyak. PCR juga, sangat sensitif karena mampu mendeteksi satu partikel virus dalam sel yang terinfeksi dengan cara meningkatkan jumlah DNAnya. Di BKIPM Kelas I Jakarta II proses yang dilakukan dalam biologi molekuler bertahap dari mulai ekstraksi, amplifikasi,dan elektrofeoresis. Ekstraksi DNA/RNA atau bisa juga disebut isolasi ini merupakan teknik mendasar yang harus diketahui dan dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekuler. Tujuan dari ekstraksi DNA/RNA memisahkan

DNA/RNA dari komponen sel lainya (protein, karbohidrat, lamak, dll) sehingga DNA/RNA yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekuler tahap berikutnya atau teknik lainnya. Ekstraksi yang dilakukan di BKIPM Kelas I Jakarta II adalah ekstraksi DNA dengan lysis buffer dan ektraksi RNA dengan RNA extraction. Tahapan ekstraksi DNA dan RNA ini berbeda dan mempunyai tujuannya masing-masing dimana ekstraksi DNA ini digunakan untuk mendeteksi WSSV dan KHV sedangkan ekstraksi RNA untuk mendeteksi TSV. Prisnsip utama dalam Eksraksi atau isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA

tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat. Ekstraksi DNA ekstraksi yang digunakan untuk WSSV dan KHV dimana awalnya mengambil bagian contoh uji sesuai dengan ketentuan (Tabel 5), dimasukkan ke dalam mikrotube 1,5 mL dan ditambahkan 500L lysis buffer. Lysis buffer ini berfungsi sebagai perusak dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel. Menggerus sampai halus sampel DNA yang telah dilarutkan dengan lysis buffer, penggerusan ini dilakukan untuk penghancuran sel, membran inti yang mana membantu fungsi lysis buffer yang bekerja secara kimiawi. Inkubasi selama 10 menit dengan suhu 950C menggunakan dry block heating thermostat. Inkubasi ini bertujuan untuk mencegah pengendapan atau bisa dibilang melarutkan lysis buffer. Sentrifugasi pada 12000rcf selama 10 menit, dengan adanya sentrifugasi ini maka akan tejadi pemisahan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Subtansi yang berda dibawah disebut supernatan dan yang dibawah disebut pellet, ambil 200L supernatan dan pindahklan ke dalam mikrotube baru serta lakukan penambahan 400L alkohol 95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan. Lakuakan vortex cepat untuk menghomogenkan cairan yang ada dalam mikrotube, setelah itu sentrifugasi kembali pada 12000rcf selama 5 menit sehingga didapat kembali supernatan dan pellet yang mana supernatan tahap ini dibuang ke botol limbah cair. Keringkan supernatan diatas tissu bersih, hal ini bertujuan mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol. Tahap terakhir pemberian 100L TE buffer yang berfungsi melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease (Sudarsono, 1996). Tabel 5. Jumlah Contoh Uji WSSV Contoh Uji Plasmid DNA WSSV Tangkai amat induk udang PL 12 PL 12-30 Pleopod, Periopod Otot Jumlah/berat contoh Uji 2 kopi 1 tangkai 25-50 ekor Udang tanpa hepatopancreas/ kepala 2 potongan 20 mg

Endapan Kolam/ tambak 200mg Insang 20 mg Air kolam/ tambah 2 mL Ekstraksi RNA bertujuan sama dengan ekstaksi DNA dimana untuk mendapatkan DNA/RNA murni hanya saja cara pengekstraksian yang berbeda dan juga bahan yang digunakan. Di awalnya juga pengambilan bagian sampel/contoh uji (Tabel 5) Tahap akhirnya pun sama yaitu pemebrian TE buffer yang berfungsi melarutkan, hanya saja dalam ekstraksi RNA ini yang dilarutkan adalah RNA yang dihasilkan dan juga menjaga RNA agar tidak mudah rusak. Tabel 6. Jumlah Contoh Uji TSV Contoh Uji Plasmid DNA TSV PL 12 PL 12-30 Insang Udang Dewasa Insang Induk Udang Insang PL20-udang ukuran 5 kg Hepatopankreas/hemolimp Jumlah/berat contoh Uji 2 kopi 10 ekor 5 ekor 2-3 potongan bagian 50 mg 20 mg

Proses setelah ekstraksi adalah proses amplifikasi, dimana proses amplifikasi ini ada 2 metode yang dilakukan yaitu amplifikasi dengan IQ 2000 dan amplifikasi dengan metode OIE. Amplifikasi IQ 2000 digunakan untuk amplifikasi DNA WSSV sedangkan Amplifikasi (OIE) digunakan untuk amplifikasi RNA TSV dan amplifikasi DNA KHV. Amplifikasi menggunakan IQ 2000 yang mana prosedurnya telah ada di bab sebelumnya dan juga terlampir (Lampiran 2). Untuk melakukan amplifikasi hasil ekstraksi template DNA/sampel DNA sangatlah penting. Pembuatan campuran reagen di dalam PCR chamber, yang terlebih dahulu hidupkan lampu UV selama 5 menit, setalah 5 menit matikan lampu UV dan hidupkan lampu neon. Dalam pembuatan reagen ini harus menghindari kontaminasi dari luar maka dari itu dilakukan di dalam PCR chamber yang mana alat-alat telah disterilisasikan menggunakan sinar UV. Amplifikasi dengan IQ 2000 ada 2 tahap, yaitu mempersiapkan: 1. First PCR Komposisi : First PCR Premix =7,5L IQzyme DNA polymerase = 0,5L Total volume campuran reagen =8L

Komposisi ini berlaku untuk satu mikrotube dimana sudah termasuk perhitungan untuk kontrol positif, kontrol negatif dan contoh uji/sampel. Selanjutnya divortex yang mana bertujuan untuk membuat campuran reagen tersebut tercampur dengan baik atau disebut homogen, melakukan spin down setelah vortex bertujuan untuk menurunkan cairan yang menempel pada dinding mikrotube. 2. Nested PCR Membuat campuran reagen pada tube baru dengan membuat kode/label huruf N pada tube yang nanti ditambahkan pada tiap-tiap tube tahap awal yang sedang diamplifikasi. Komposisi Nested PCR : Nested PCR premix =14L IQzyme DNA plymerase=1L Total campuran reagen=15L Tambahkan campuran nested PCR pada masing-masing hasil amplifikasi Firast PCR, vortex, spin down, dan amplifikasi pada thermal cycler. Untuk amplifikasi dengan IQ 2000 bisa diambil contoh dari hasil kegiatan pertama yang mana contoh uji berjumlah 4 buah. Dengan jumlah template DNA 4 buah maka butuh mikrotube 6 (1 Kp+1 Kn+4 template DNA) buah untuk amplifikasi ini. Komposisi First PCR yang merupakan komposisi untuk satu buah bisa dilakukan pada satu mikrotube lebih dahulu untuk memudahkannya pertama mencampurkan semua bahan dalam 1 tube maka terlebih dahulu membuat kontrol negatif (kp/-) setelah itu mendistribusikan ke tube kontrol positif (Kp/+) dan template DNA sesuai dengan perhitungan untuk 4 tempalte DNA : First PCR : 7,5 x 6 = 45 IQ2000 : 0,5 x 6 = 3 48 : 6 = 8 Memberi kode/label pada mikrotube supaya tidak terjadi kesalahan dalam melakukan amplifikasi. Memasukkan 45L first PCR premix dan 3L IQzyme2000 kedalam mikrotube Kn menggunakan mikropipet. Mendistribusi campuran reagen first PCR premix pada tube Kn ke tube Kp dan tube uji/sampel dengan takaran 8L untuk masing-masing mikrotube sehingga hasilnya merata pada tiap mikrotube.

Setelah pendistribusian, tambahkan 2L cairan khusus Kp pada tube Kp, 2 L TE buffer untuk mikrotube Kn, dan 2L template DNA hasil ekstraksi untuk tiap-tiap tube yang khusus sampel. Vortex semua mikrotube dan spin down, setelah itu amplifikasi dengan memilih WSSV1 pada thermal cycler menekan tobol start untuk memulai siklus dan tunggu sampai semua siklusnya selesa (45-50 menit). Siklus First PCR : 940C 30 detik; 620C 30 detik; 720C 30 detik, diulang 5 siklus, 940C 15 detik; 620C 15 detik; 720C 20 detik, diulang 15 siklus, 720C 30 detik; 200C 30 detik; 40C , diakhir siklus Menghitung komposisi Nested PCR dengan 4 template DNA ditambah dengan Kp dan Kn : Nested PCR premix =14L x 6 = 84 IQzyme DNA plymerase=1L x 6= 6 Total campuran reagen=90L Untuk membuat reagen sesuai 90 : 6 = 15, angka ini sesuai dengan komposisi Nested PCR untuk satu tube. Menambahkan nested PCR yang telah dibuat ke hasil amplifikasi tahap pertama yaitu first PCR premix sebanyak 15L secara merata. Vortex cepat dan spin down, setelah melakukan amplifikasi kedua dengan memilih WSSV2 pada thermalcycler dan tekan tombol start (45-50 menit). Amplifikasi untuk mendeteksi KHV ini dilakukan dengan metode OIE. Amplifikasi metode ini berbeda dengan metode yang menggunakan kit IQ 2000 dimana dalam ampilifikasi metode OIE ini tahap pemcampuran reagen hanya terjadi sekali atau bisa disebut persiapan master mix dengan komposisi yang tentunya berbeda. Komposisi larutan untuk master mix amplifikasi (OIE) KHV : Green Master Mix : 12,5 L Primer Forward Primer Reverse : 1 L : 1 L

Nuclease Free Water: 8,5 L Total campuran reagen adalah 23 L Perhitungan komposisi larutan untuk 8 contoh uji ditambah dengan kontrol positif dan kontrol negatif telah dipaparkan sebelumnya pada hasil kegiatan

Green Master Mix : 12,5 L x 10 = 125 L Primer Forward Primer Reverse : 1 L x 10 =10 L : 1 L x 10 = 10 L

Nuclease Free Water: 8,5 L x 10 = 85 L Total campuran reagen untuk 10 tube adalah 230 L. Perhitungan total campuran reagen ini di tentunya tidak akan cukup untuk mikrotube ukuran 0,2mL maka itu dibuat dalam dua buah mikrotube dengan tiap-tiap reagen dibagi dua sehingga cukup untuk dibagikan ke 10 buah tube yang masih kosong dengan pembagian sebesar 23 L untuk tiap-tiap tube sehingga 10 tube mendapat bagian yang rata. Hal ini untuk memudahkan dalam proses pencampuran reagen dan menghemat alat yang digunakan seperti tips. Untuk tube kontrol positif diberi 2 L larutan kontrol positif dan kontol negatif diberi NFW atau bisa juga TE buffer 2 L, serta untuk tube contoh uji beri 2 L template DNA sesuai denga kode contoh ujinya sehingga larutan tiap-tiap tube rata jumlahnya yaitu 25 L. Setelah semua terdistribusikan lakukan vortex cepat dan spin down serta amplifikasi dengan memilih untuk KHV pada thermal cycler. Amplifikasi berjalan 90 menit. Amplifikasi untuk mendeteksi TSV sama dengan amplifikasi KHV yaitu dengan metode OIE yang membedakannya hanyalah pada percampuran reagennya. Campuran reagen untuk proses amplifikasi TSV ini sebagai berikut : Acces Quick Primer 9992F Primer 9195R AMV NFW :12,5L :2,5L :2,5L :0,5L :4,5L

Dari campuran tersebut template RNA, kontrol positif, dan kontrol positif yang diberikan 2,5L untuk masing-masing mikrotube sesuai kodenya. Dengan akhirnya amplifikasi dengan siklus sebagai berikut : 600C 30 menit; 940C 2 menit, diulang 1 siklus, 940C 45 detik; 600C 45 detik; diulang 40siklus, 600C 7 detik; 40C , diakhir siklus Untuk Real time PCR komposisi reagen sebagai berikut : Tagman Universal Forward Reverse 12,5L 1L 1L

Probe NFW

1L 4,5L 20L

Contoh Uji

5L 25L

Dalam realtime PCR ini setelah melakukan percampuran reagen langsung diketahuhasilnya tanpa melakukan elektroforesis hanya ikuti prosedur yang ada pada buku panduan penggunaan Applied Biosystem. Pada dasarnya reagen yang digunakan untuk amplifikasi ini sama saja fungsi yaitu polimerisasi, yang intiya membuat replikasi DNA/RNA. Hal yang penting atau bisa disebut komponen peting dalam amplifikasi adalah sebagai berikut : 1. Template DNA/RNA Fungsi DNA/RNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA/RNA baru yang sama. Templat DNA/RNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan eksperimen. 2. Primer Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang

diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. 3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan. 4. Buffer PCR dan MgCl2 Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan. 5. Enzim Polimerase DNA/ Taq polymerase Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai. Dari penjelasan tentang cara amplifikasi WSSV, TSV, daan KHV didapat bahwa untuk melakukan amplifikasi harus melakukan perhitungan terlebih dahulu jika terdapat lebih dari 1 contoh uji, hal ini untuk ekektifitas dan efiiensi waktu pengerjaannya. Jika dalam pengerjaan campuran reagen lakukan dalam satu mikrotube yang mana telah dihitung takarannya karena dalam deteksi virus harus dilakukan sejak awal dan alat yang tidak

terbuang sia-sia seperti mikrotips, jika tanpa perhitungan dan percaampuran awal di satu mikrotube maka banyak mikrotips yang akan terbuang. Amplifikasi ini sangat penting karena jika terjadi kesalahan pada hasil akhir pembacaan elektroforesis didapatkan kejanggalan amplifikasi menjadi sorotan pertama karena dalam amplifikasi tidak boleh terjadi kontaminan dan juga komposisi campuran reagen haruslah benar. Pencampuran komposisi reagen ini dapat terjadi kesalahan disebabkan oleh mikropipet, mikropipet banyak macamnya dan banyak pula perusahaan yang membuatnya dimana mikropipet sering tertinggalnya sedikit cairan didalamnya karena mikropipet dan mikrotips yang digunakan tidak dalam satu perusaahan. Hal seperti ini disebut error pipeting, maka dari itu merek mikrotips dan mikropipet baiknya sama untuk menghindari terjadinya error pipeting ini. Dalam tahap amplifikasi pada thermal cycler yang prinsipnya siklus suhu dimana tiap suhu yang diatur mempunyai tujuannya masing-masing. Thapan sikulus suhu sebagai berikut : 1. Pre-Denaturasi : Tahap ini merupakan tahap untuk mempersiapkan proses berikutnya, yaitu denaturasi (Pemanasan), Suhu yang digunakan 95C. Hanya terdiri dari satu siklus selama 5 menit. 2. Denaturasi : Tahap pemisahan antara untai satu dengan yang lain sehingga masing masing menjadi untai tunggal. Suhu yang dipakai 94C. Proses yang tidak sempurna dapat memutuskan rantai DNA. Jika terlalu lama dapat menghilangkan aktivitas enzim polimerase. 3. Annealing : Tahap terpenting. Faktor yang mempengaruhi adalah suhu annealing dan primer. Suhu rendah dapat mengakibatkan primer tidak dapat melekat pada untai DNA dengan kurang sempurna. Suhu Tinggi dapat mengakibatkan salah sasaran, atau primer melekat pada urutan basa yang salah. Suhu melting annealing primer optimum dapat diukur dengan rumus Tm = 2 ( A+T ) + 4 ( G + C ). Setelah itu dari masing masing dikurangi 5C ( Suhu = Tm - 5C ). Lalu hasil keduanya dihitung rata ratanya. 4. Ekstention : Proses pemanjangan untai DNA yang telah melekat pada primer. Suhu optimal yang dipakai 72C, bertujuan untuk mengaktifkan Enzim Taq Polimerase. Enzim Taq Polimerase berasal dari bakteri Thermus aquaticus. Penggandaanya n2. 5. Post PCR : Tahap ini hanya tahap optimalisasi proses running. Suhu 72C, 1 Siklus, 7 Menit. 6. Finalizing : Tahap penyelesaian. Suhu 4C.

Elektroforesis merupakan proses terakhir dalam biologi molekuler dengan menggunakan metode PCR. Elektroforesis ini sama saja proses yang dilakukannya baik dail hasil amplifikasi IQ 2000 ataupun amplifikasi OIE. Elektroforesis merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan molekul DNA, RNA atau protein berdasarkan ukuran, muatan elektrik, dan sifat-saifat lainnya. Teknik elektroforesis dilakukan dengan menarik suatu molekul untuk melewati massa gel yang diberikan arus listrik kutub negatif menuju kutub positif sehingga DNA, RNA yang mempunyai muatan negatif akan berpindah menuju kutub positif pada ujung akhir massa gel dalam elektroforesis (Sambrook & Russel 2001 : 5.4). Kecepatan migrasi molekul DNA ditentukan oleh besar fragmen DNA. Fragmen DNA berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat diabndingkan dengan fragmen DNA berukuran besar. Fragmen DNA dalam gel dapat divisualisasikan dengan pewarna pengikat DNA seperti ethidium bromida yang dapat berpendar di bawah sinar ultraviolet (UV) (Weaver 2004:92). Teknik elektroforesis dialkuakn karena telah banyak yang menggunakan untuk mendeteksi fragmen DNA hasil amplifikasi dengan membandingkan pita DNA hasila alplifikasi dengan PITA DNA molecular weight marker (penanda berat molekul DNA) (Sambrook & Russell 2001 :5.10) Dalam elektroforesis ethidium bromida digunakan untuk campuran proses penggambaran atau pewarnaan molekul asam nukleat atau lebih khususnya DNA dan RNA, tetapi ethidium bromida ini tidak digunakan lagi karena sifat karsinogenik. Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993). Dalam elektroforesis ini ethidium bromida tidak dipakai dan digantikan SYBR Green dimana fungsinya sama dengan ethidium bromida tetapi lebih sensitif sehingga hasil yang didapat maksimal diabnding menggunakan ethidium bromida. Pengerjaan campuran dilakukan diatas parafilm ini bukan semata-semata tidak ada tujuannya, tujuannya memudahkan melakukan homogenisasi sampel DNA/RNA dengan loading dye dan SYBR green. Dalam membuat agar, agarose 1,5 % yang digunakan karena memang 1,5% merupakan yang terbaik untuk pembuatan agar ini, stelah itu dipanaskan di microwave sampai benar-benar larut. Sisir digunakan untuk membuat sumuran. Agarose merupakan serbuk dari tanaman agar agar, yang menghasilkan gel ketika didinginkan. Buffer dibutuhkan untuk menjaga nilai pH pada angka yang konstan.

Lautan TAE buffer 1x yang digunakan untuk campuran agarose dan merendam ketika dilakukan penyimpan campuran loading dye, SYBR Green, dan sampel DNA/RNA memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). TAE buffer ini bisa dibilang sebagai penghantar arus listrik. Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991). Alasan kenapa loading dye/loading buffer digunakan untuk campuran dengan SYBR Green dan sampel DNA/RNA karena ketika dalam perendaman dengan TAE buffer untuk memasukkan campuran ke dalam sumur adalah loading dye ini lebih berat daripada TAE buffer itu sendiri sehingga tenggelam atau bdapat disebut sebagai pemberat oleh karena itu larutan yang dimasukkan ke dalam sumur/lubang tidak keluar dan tidak terjadi pencampuran dengan larutan perendamnya, hal yang sangat penting untuk diketahui sehingga dapat memperoleh hasil yang baik. SYBR-Green merupakan pewarna yang mengkelat dalam untai ganda DNA. Bahan tersebut dapat digunakan untuk memvisualisasikan DNA, karena bahan ini berpendar dibawah sinar UV namun tidak terlihat dalam cahaya biasa. Dalam running harus sesuai dan tepat pengaturannya, dari yang biasanya dilakukan dan dilihat dari hasil yang baik dalam mengatur running pada power suplai dengan kekuatan listrik 80 volt, maksimal 200mA selama 50 menit. Semakin besar voltase kecepatan molekul DNA semakin cepat. UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarose ini merupakan tahap dimana hasil dari elektroforesis dapat diketahui dan di dokumentasi dengan UVIDOC serta software pendukung.

300 bp 200 bp 100 bp

Gambar 1. Hasil Uji WSSV dengan Contoh Uji Frozen Shrimp Hasil uji WSSV yang menggunkan marker 100 bp ini dikatakan negatif karena pada angka 1 dan 2 yang merupakan contoh uji tidak menghasilkan pita DNA atau disebut band yang menandakan WSSV. WSSV dikatakan positif apabila terbentuk band pada 296 bp dan/atau 550 bp. Pada kolom kontrol positif terdapat band yang menyatakan bahwa band ini merupakan band yang menjadi acuan untuk contoh uji dimana kontrol positif pada 296 bp. Jika terdapat band selain 296 bp dan 550 bp berarti hasilnya tersebut negatif.

Gambar 2. Hasil Uji TSV dengan Contoh Uji Artemia dan Red Cherry Shrimp Hasil uji TSV yang menggunakan marker 100 bp dengan contoh uji artemia dan Red Cheery Shrimp didapat hasil negatif karena A1, A2, A3, dan RCS tidak menghasilkan band TSV samasekali. Hasil Uji TSV dikatakan positif apabila terbentuk band pada 231 bp Jika terdapat band selain 231 bp.

Gambar 3. Hasil Uji KHV dengan Contoh Uji Fiksatif Insang Hasil Uji KHV ini dinyatakan tidak baik karena munculya band pada kontrol negatif yang seharusya tidak boleh ada samasekali. Band yang terdapat pada kontrol negatif ini merupakan tanda bahwa telah terjadi kontaminasi dalam proses pengerjaan uji KHV ini. Uji KHV dinyakatan positif apabila terdapat band apa 409 bp dan dikatakan negatif apabila tidak mengahsilkan band atau pita DNA. Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. 2. Konsentrasi gel Semakin tinggi konsentrasi agarose, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarose yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarose yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar. 3. Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. 4. Densitas muatan Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah. 5. Pori-pori gel Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA. 6. Voltase Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA. 7. Larutan buffer elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA (Wolfe, 1993). Elektroforesis ini ada 2 metode yaitu metode bebas dan horizontal tetapi kebanyakan pada proses elektroforesis menggunakan metode horizontal karena memiliki kelebihan dibanding metode bebas. Kelebihan metode elektroforesis horizontal adalah mudahnya mengamati reaksi

kimia selama proses berlangsung, sampel atau contoh uji dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam sumuran/lubang gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984). Elektroforesis gel ini mempunyai manfaat antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi

DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme

atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999). Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).