Contagem de micro-organismos: Diluies seriadas.

CONTAGEM PADRO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS (CONTAGEM PADRO EM PLACAS)

Detecta o nmero de bactrias aerbias ou facultativas e mesfilas presentes. Indica qualidade higinica dos alimentos fornecendo idia de seu tempo til de conservao. Em grande nmero indica: Matria prima excessivamente contaminada; Limpeza e desinfeco de superfcies inadequadas; Higiene inadequada na produo; Condies inadequadas de tempo/temperatura durante a produo ou a conservao dos alimentos.

DETERMINAO DO N DE CLULAS VIVEIS PELA CONTAGEM DE COLNIAS EM PLACAS.

Quantidade conhecida de inculo colocada em placa de Petri, adiciona-se gar nutritivo fundido que misturado com o inculo atravs de movimentos rotatrios. A solidificao do meio fixa os micro-organismos no gel. Parte-se do princpio que cada organismo cresce e se multiplica at formar uma massa visvel, uma colnia, ou seja, cada organismo d origem a uma colnia. Esta revela a populao microbiana vivel no inculo. A amostra original diluda. A tcnica baseada no princpio de que cada organismo vivel formar uma colnia bacteriana e que no existam agregados de clulas.

DILUIES
Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a concentrao de uma das substncias. O uso mais comum da palavra diluio ocorre no sentido de que tantas partes de um material esto sendo diludas em um nmero total de partes do produto final (diluente + material). Uma diluio uma expresso de concentrao ou proporo, no de volume. Diluio indica a quantidade relativa de substncias em uma soluo.

DILUIES
Em frases de diluio, o menor nmero sempre se refere ao nmero de partes da substncia que est sendo diluda, enquanto que o maior nmero sempre se refere ao nmero de partes que constitui a soluo final. Exemplo: Frase de Diluio: Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina peptonada.

DILUIES
Frase de Diluio: Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina peptonada. Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado: Fazer uma diluio 1 em 10, de leite em soluo salina peptonada. Fazer uma diluio 1 para 10, de leite com soluo salina peptonada. Fazer uma diluio 1/10, de leite com soluo salina peptonada. Fazer uma diluio 1:10, de leite usando soluo salina peptonada. Fazer uma diluio de 1 parte de leite e 9 partes de soluo salina peptonada.

DILUIES
Diluies decimais: Diluies decimais so diluies em que a quantidade de substncia a ser diluda corresponde unidade, ou mltiplos da unidade e o volume final da soluo diluda igual a 10 ou mltiplo de 10 (diluies de base 10). Diluies decimais seriadas: So diluies decimais preparadas em srie e que possuem um fator de diluio nico e igual a 10.

CLCULOS DE DILUIES
Para a obteno de uma diluio de base 10, homogeneizam-se pores da amostra com volume de diluente necessrio para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume (ou peso) da amostra. Assim, a diluio 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida homogeneizando: 1 mL de gua+ 9 mL de diluente, ou 10 mL de gua + 90 mL de diluente, ou 20 mL de gua + 180 mL de diluente, ou 25 mL de gua + 225 mL de diluente, e assim por diante.

DILUIES SERIADAS

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10 amostra = 10-1 = 0,1 1_x 1_ = _1_ = 10-2 = 0,01 100 total 10 10 100

1_x 1_ = _1_ = 10-3 = 0,001 10 100 1000

DILUIES SERIADAS
Em todos os exemplos, a amostra resulta diluda 1:10 (10-1) e, conseqentemente, em cada mL da diluio teremos uma quantidade de amostra correspondente a um dcimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente. Normalmente a diluio inicial de amostras slidas, em p ou pastosas, utilizada para anlises microbiolgicas 1:10. Antes do incio do procedimento de diluio fundamental que a amostra seja bem homogeneizada (produtos lquidos em p e pastosos) ou que a alquota para anlise, obtida de produtos slidos, seja tomada de vrios pontos de forma a representar realmente a amostra.

CLCULOS DE DILUIES
Pontos crticos do processo de diluio de amostras de alimentos, homogeneizao da amostra e suas diluies: A homogeneizao inadequada da diluio inicial, e das subseqentes, poder acarretar diferenas muito grandes na contagem das colnias e resultados incoerentes quando do uso de duas ou mais diluies sucessivas. Para a obteno de resultados corretos de contagem de micro-organismos em amostras de gua e alimentos, a homogeneizao de todas as diluies ponto fundamental.

CLCULOS DE DILUIES
Por outro lado, para amostras que se desconhece o nmero aproximado de micro-organismos existentes (muito contaminados), as diluies a serem preparadas devero garantir condies de realizao das contagens. Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluies 10-1 a 10-6. Tempo desde a primeira diluio at a inoculao em meios de cultura o tempo gasto para a execuo das diluies de uma amostra de alimentos at sua inoculao em meios de cultura dever ser de, no mximo, 20 minutos, de forma a no permitir a multiplicao dos micro-organismos contidos nas diferentes diluies, o que acarretaria a obteno de resultados falsos para a contagem de micro-organismos.

DILUIES
Uso de pipetas: Sempre utilizar uma pipeta para cada diluio; No tocar com a pipeta de uma determinada diluio no diluente da diluio seguinte; A mesma pipeta poder ser utilizada para a semeadura de diluies de amostras, desde que se parta da maior diluio (amostra mais diluda) para a menor diluio (amostra menos diluda).

PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS

As contagens devero ser realizadas imediatamente aps o perodo de incubao das placas.

Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente aps o perodo de incubao, manter as placas sob refrigerao em temperatura de 4C a 7C por um perodo no superior a 24 horas.

Esse procedimento no deve tornar-se uma prtica rotineira.

PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS

Para a contagem, selecionar placas que contenham um nmero de colnias que se encontre dentro do intervalo de preciso e repetibilidade estabelecido pelo mtodo em uso (por exemplo, 20 a 200 colnias, 25 a 250 colnias, etc).

Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluies sucessivas.

REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS

Expresso de resultados de contagem; No clculo das contagens, o resultado final ser expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta a diluio empregada, da seguinte maneira: R = a x 10b UFC/g ou mL
Sendo: R = resultado a = os dois primeiros algarismos significativos, nmeros de 0 a 9 b = expoente (0 a 10) UFC = unidade formadora de colnias g = grama e mL = mililitro

REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS

Exemplos: Diluio 10-2 (1:100) Mdia das contagens: 25 UFC Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou mL Diluio 10-3 (1:1.000) Mdia das contagens: 38 UFC Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou mL O resultado final ser expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos, separados por vrgula. Os algarismos subseqentes, quando existirem, devero ser arredondados e transformados em potncia de 10.

REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS

Arredondamento de resultados: Quando se fizer necessrio, e visando no criar uma falsa idia de preciso, aplicar a seguinte regra para a aproximao dos resultados: Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo imediatamente aps for superior a 5. Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 186 UFC Arredondando-se o terceiro algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104 UFC/g ou mL

REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS

Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subseqente quando o algarismo imediatamente aps for inferior a 5. Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 184 UFC Arredondando o terceiro algarismo para baixo tem-se como resultado: 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x 104 UFC/g ou mL

REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS

Todas as placas com mais de 250 colnias: Se for possvel contar todas as colnias de pelo menos uma das placas. No sendo possvel contar todas as colnias da placa, mas se o n de colnias/ cm2 estiver abaixo de 10, contar as colnias em 12 quadrados consecutivos (6 na horizontal e 6 na vertical), calcular a mdia e multiplicar pela rea total da placa (65 cm2 para placas de dimetro externo 100 mm). Usar esse n para o clculo de UFC.

REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS

Nenhuma placa atingir 25 colnias: Calcular o n de UFC e apresentar o resultado como contagem estimada. Nenhuma placa com crescimento: Apresentar o resultado como menor do que 1/diluio (est.). Placas em que o crescimento proporcionalmente maior nas maiores diluies: Reportar como "acidente de laboratrio", caso no seja possvel repetir a anlise.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
SILVA Jr., E. A. Manual de controle higinico-prtico de alimentos. Varela, 4. ed., 2001. FRANCO, B. D. G. M. & Landgraf, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu, 1996. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurana alimentar. Artmed, 2002. TORTORA, G. J., Funke, B. R. & Case, C. L. Microbiologia. Artmed, 6. ed., 2000. CAMPBELL, J. M.; CAMPBELL, J. B. Diluies. In.: Matemtica de Laboratrio Aplicaes Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 77-88. CAMPBELL, J. M.; CAMPBELL, J. B. Solues. In.: Matemtica de Laboratrio Aplicaes Mdicas e Biolgicas. 3.ed. Editora Roca. So Paulo, SP. 1986. p. 93-118. PELCZAR JR., M. J.; CHAN, E. C. S. & KRIEG, N. R. Microbiologia Conceito e Aplicaes. Pearson Education do Brasil, Volume1, So Paulo, 2005. BARBOSA, H. R. & Torres, B. B. Microbiologia bsica, Atheneu, 1999.