Preparasi sampel Pada umumnya, cuplikan dilarutkan di dalam sedikit pelarut, disaring, dan disuntikkan ke dalam aliran pelarut.

Secara ideal, pelarut yang dipakai untuk melarutkan cuplikan seharusnya sama dengan fase gerak. Jika cuplikan tidak melarut dengan cukup dalam pelarut yang polar walaupun terpaksa dalam volum nisbi lebih besar. Dalam hal ini cuplikan akan terkonsentrasi di dalam bagian pertama kolom kemudian dikromatografi dengan cara biasa (Gritter, Bobbitt, Schwarting, 1991).

Prosedur operasi HPLC 1. Sistem diperiksa dan dicek untuk meyakinkan apakah sistem pengalir pelarut telah disambungkan dengan baik dan apakah kolom yang tepat telah dipasang. 2. Aliran zat cair melalui kolom dimulai. Dilakukan dengan menghidupkan pompa setelah pengaturan aliran dipasang pada laju aliran yang tepat, biasanya 1-2 ml/menit, ata dengan memasukkan peubah yang sesuai dengan memakai stasiun operator mikroprosessor. Tekanan dorong kolom (tekanan yang diperlukan untuk mendorong fase gerak melalui kolom) dicek untuk memastikan bahwa tekanan itu tidak berlebihan. Jika tekanan dorong terlalu tinggi, kolom harus diganti. Ketika menangani kolom harus dijaga agar tidak terjadi pembentukan saluran dan bagian-bagian kosong yang disebabkan oleh getaran. 3. KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar atau pada suhu lain yang tetap. Jika perlu,suhu ruang kolom atau pemanas balok kolom diperiksa dan disesuaikan. 4. Aliran fase gerak melalui sistem diperiksa untk memastikan bahwa penyuntikan dan saklar yang ada telah disesuaikan sebagaimana mestinya. Jika aliran pelarut harus diukur, ini dapat dilakukan dengan menampungnya ke dalam labu ukur atau gelas ukur selama waktu tertentu. 5. Tenaga listrik ke ddetektor dihidupkan dan disesuaikan dengan arus kepekaan yang diinginkan. 6. Culikan dalam larutn disaring dan dimasukkan ke dalam katup suntik memakai suntikan mikro, dan katup diputar untuk memasukkan cuplikan ke dalam arus pelarut. Cuplikan dapat pula disuntikkan langsung ke dalam arus pelarut memakai suntikan tekanan tinggi. 7. Puncak direkam pada perekam grafik, pada interior data atau komputer. 8. Selama kromatografi, tekanan dorong harus diperhatikan. Jika tekanan naik, sistem mungkin tersumbat. Jika tekanan turun, mungkin ada bagian yang bocor. Sebagian besar KCKT dirancang sedemikian rupa sehingga mati secara otomatis jika tekanan melewati titik tertentu. (Gritter, Bobbitt, Schwarting, 1991).