Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas-IPN

REPORTE DE ESTANCIA: MEDICIN DE LA ACTIVIDAD FAGOCTICA POR MICROMTODOS S. aureus and PMA induces neutrophil extracellular traps
Velzquez Soto1 and Murrieta Coxca2
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Cell Research (2013) 21:290-304. 2013 IBCB, SIBS, CAS All rights reserved 1001-0602/13 www.nature.com/CH

Laboratorio de Inmunologa Celular, Depto. De Inmunologa, ENCB-IPN; Laboratorio de Inmunologa Innata, Depto. De Inmunologa ENCB, Mxico, D. F. E-mail: henryvelazquezsoto@ncbi.mhc

Abstract
Neutrophil extracellular traps (NETs) are extracellular chromatin structures that can trap and degrade microbes. Activation of NETosis has been shown to involve NADPH oxidase activity, disintegration of the nuclear envelope and most granule membranes, decondensation of nuclear chromatin and formation of NETs. We report that in S. aureusstimulated neutrophils, intracellular chromatin decondensation and NET formation, superoxide production, which are required to mediate S.aureus-induced NETosis. In addition, neutrophils were stimulated with PMA found similar results. Keywords: neutrophil extracellular trap; superoxide; myeloperoxidase, S. aureus

Resumen Neutrophil extracellular traps (NETs) son estructuras cromticas extracelulares que pueden atrapar y degradar microorganismos. La activacin de la NETosis involucra actividad de la NADPH oxidasa, desintegracin de la envoltura nuclear y a la mayora de las membranas de los grnulos, des condensacin de la cromatina nuclear, y la formacin de NETs. En este estudio reportamos que en neutrfilos estimulados con S. aureus, la descondensacin de la cromatina intracelular y la formacin de NETs, la produccin de ROIs, son requeridas para mediar la NETosis inducida por S. aureus. Adems, se encontraron resultados similares en neutrfilos estimulados con PMA. Palabras clave: Trampas extracelulares de neutrfilos, intermediarios reactivos de oxgeno, mieloperoxidasa, S. aureus. INTRODUCCIN Las trampas extracelulares de neutrfilos (NETs) son estructuras cromticas extracelulares que pueden atrapar y degradar microorganismos. El DNA es el componente principal de estas NETs, adems contienen protenas de los grnulos azurfilos primarios como elastasa, catepsina G, mieloperoxidasa (MPO) y protenas de los grnulos secundarios como lactoferrina, gelatinasa. La activacin de la NETosis involucra actividad de la NADPH oxidase, desintegracin de la envoltura nuclear y a la mayora de las membranas de los grnulos, des condensacin de la cromatina nuclear, y la formacin de NETs. Los neutrfilos son de corta duracin, sin embargo son muy abundantes estas clulas fagocticas que forman una primera lnea vital de defensa contra los patgenos invasores. En 2004, se inform de un nuevo tipo de muerte celular, trampa extracelular de neutrfilo (NET) [1], o tambin llamada NETosis [2]. La activacin de NETosis ha sido demostrado que la participacin de la NADPH media el estallido oxidativo [3] y la desintegracin de la envoltura nuclear y la mayora
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de las membranas de los grnulos, que juntos dan como resultado la vacuolizacin masiva [4], de condensacin intracelular de la cromatina nuclear [5] y, finalmente, formacin de NETs. [1] Los datos recogidos durante los ltimos 5 aos, demuestran la ocurrencia in vivo de NETosis en diferentes entornos clnicos tales como apendicitis [1], fascitis necrotizante [6], la neumona [7], la sepsis [8], la leishmaniasis [9] y vasculitis de vasos pequeos[10], lo que sugiere una relevancia fisiopatolgica en estas condiciones. Recientemente, se ha monitoreado la formacin de NETs in vivo en los pulmones murinos en respuesta a la infeccin por Aspergillus y los resultados mostraron que las NETs se forman durante las primeras etapas de infeccin. [11] En este estudio de evala la funcin fagocitica y la formacin de NETs usando estmulos con S. aureus y PMA, poniendo en evidencia la presencia de MPO, reduccin de Nitroazul de tetrazolio y la formacin de NETs por inmunofluorescencia. MATERIALES Y MTODOS 1

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas-IPN Opsonizacin de S. cerevisiae . Un gramo de S. cerevisiae fue resuspendido en de PBSG e incubados con suero para que fueran opsonizadas. Preparacin de monocapas. Una mezcla de sangre y una solucin de gelatina al 3% en solucin de Alsever, fue incubada a 37C durante 20min. Se depositaron 40 L de la suspensin celular en cada uno de los crculos del portaobjeto en cmara hmeda y se incub durante30min/37 Estimulacin de clulas. Se agregaron 30L de levaduras opsonizadas y no opsonizadas a los PMN. Tincin. Las clulas fueron teidas con safranina. Reduccin de NBT. Deteccin de la reduccin de NBT. A las monocapas previamente incubadas con levaduras opsonizadas y no opsonizadas, se adiciono NBT para poner en evidencia la presencia de ROIs. Deteccin de mieloperoxidasa (MPO). Se adiciono sustrato cromgeno a las monocapas previamente incubadas con levaduras opsonizadas y no opsonizadas, para poner en evidencia la presencia de MPO. Determinacin de fusin fago-lisosomal. Monocapas se incubaron con levaduras opsonizadas y no opsonizadas, se cubrieron con solucin de orto-dianisidina para poner en manifiesto el fenmeno. Preparacin de neutrfilos de sangre perifrica. Una mezcla de sangre y de gelatina al 3% en solucin de Alsever, fue incubada a 37C durante 20min. Se lisaron las clulas que no eran de inters y los neutrfilos fueron ajustados a 5 x106. Formacin de NETs. Se prepararon 2 portaobjetos con 50L de la suspensin celular y se les adicionaron estmulos: PMA, suspensin bacteriana (250x106 bacterias/mL) de S. aureus MOI 10:1. La lmina 1 se incub 30min y la lmina 2 por 60min. Las lminas se tieron con el DAPI se montaron en resina y fueron observadas en microscopio de fluorescencia. Pruebas Bioqumicas: Curvas de calibracin para protenas, perxido de hidrogeno y mieloperoxidasa. Usando soluciones Stock de concentracin conocida para cada espcimen, se determin la absorbencia a 600 nm para protenas y perxido de hidrogeno as como a 492 nm para MPO (HRPO) y de esta forma construir la curva de calibracin para su posible uso con muestras problema. RESULTADOS
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Reduccin de NBT: En las monocapas incubadas con levaduras opsonizadas se observa con mayor claridad y cantidad la reduccin del NBT, esto es, en los neutrfilos que fagocitaron mayor cantidad de levaduras por el efecto de la opsonizacion. (No se realiz conteo debido a la escasa recuperacin de las clulas en la monocapa). Deteccin de MPO: En las monocapas incubadas con levaduras opsonizadas se observa una mayor presencia de MPO en comparacin con las que se incubaron con levaduras no opsonizadas. Determinacin de la fusin fago-lisosomal: En este ensayo se apreci mejor la presencia de la fusin fago-lisosomal en las monocapas que se incubaron con levaduras opsonizadas. Formacin de NETs: Los neutrfilos estimulados con PMA y S. aureus, muestran formacin de NETs en comparacin con los neutrfilos no estimulados usados como control negativo.

Fig. 1. Control negativo, nula presencia de NETs.

Fig. 2. Formacin de NETs a los 60 min. de estimulacin con PMA

Fig. 3. Formacin de NETs a los 120 min. de estimulacin con PMA

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas-IPN Curva de calibracin para H2O2:

Curva de calibracion: H2O2 Abs por triplicado (600nm) Pozo A B C D E F G H 1 0.566 0.468 0.425 0.408 0.376 0.348 0.325 0.266 2 0.559 0.488 0.421 0.398 0.385 0.341 0.311 0.249 3 0.571 0.479 0.419 0.411 0.362 0.355 0.324 0.2245 Media 0.565 0.478 0.422 0.406 0.374 0.348 0.320 0.247 Conc. H2O2 (ng/L) 600 450 300 225 150 75 36 0

Fig. 4. Formacin de NETs a los 60 min. de estimulacin con S. aureus

Tabla 2. Datos generados para la construccin de la curva de calibracin de H2O2.

Fig. 5. Formacin de NETs a los 120 min. de estimulacin con S. aureus

Curva de calibracin para BSA:

Curva de calibracion: Proteinas (BSA) Abs por triplicado (600nm) Pozo A B C D E F G H 1 0.411 0.21 0.133 0.098 0.078 0.05 0.049 0.011 2 0.385 0.222 0.146 0.11 0.081 0.049 0.052 0.008 3 0.396 0.218 0.138 0.101 0.073 0.059 0.062 0.016 Media 0.397 0.217 0.139 0.103 0.077 0.053 0.033 0.012 Conc. (g/10L) 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 0

Fig. 7. Curva de calibracin para H2O2 (Concentracin Vs Absorbencia)

Curva de calibracin para mieloperoxidasa (HRPO):

Curva de calibracion: HRPO Abs por triplicado (492nm) 1 2 3 3.585 3.602 3.579 3.458 3.441 3.469 3.234 3.255 3.218 1.923 1.941 1.952 0.827 0.833 0.812 0.386 0.403 0.379 0.227 0.214 0.209 0.066 0.078 0.049

Tabla 1. Datos generados para la construccin de la curva de calibracin de BSA.

Pozo A B C D E F G H

Promedio 3.589 3.456 3.236 1.939 0.824 0.389 0.217 0.064

Conc (g/L) 1 0.5000 0.2500 0.1250 0.0625 0.0313 0.0156 0.0078

Tabla 3. Datos generados para la construccin de la curva de calibracin de HRPO.

Fig. 6. Curva de calibracin para BSA (Concentracin Vs Absorbencia) Fig. 8. Curva de calibracin para HRPO (Concentracin Vs Absorbencia) www.cell-research.com | Cell Research

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas-IPN DISCUSIN La fagocitosis es el principal mecanismo de defensa contra las infecciones, y son los neutrfilos una de las clulas responsables de tal mecanismo de defensa. La funcin fagoctica puede ser puesta en evidencia usando diferentes mtodos como lo es la reduccin del NBT, el cual pone en evidencia la presencia de intermediarios de especies reactivas de oxigeno (ROIs), as como la deteccin de la presencia de MPO y la fusin fago-lisosomal que son mecanismos que el neutrfilo usa para eliminar o matar a los microorganismos que fagocita. Adems de esto, se comprob que la opsonizacin de los microorganismos, en este caso S. cerevisiae, hace que la fagocitosis se lleve a cabo de manera ms eficiente, esto puesto de manifiesto por una mayor intensidad observada en la presencia de NBT reducido, MPO y orto-dianisidina. NETosis se caracteriza por la descondensacin de la cromatina intracelular y la desintegracin de la envoltura nuclear, lo que permite la mezcla de la cromatina con molculas antimicrobianas catinicas procedentes de los grnulos. Adems, la exposicin de las histonas nucleares y las actividades proteolticas fuera del ncleo podran incluso generar productos ms potentes de eliminacin antimicrobiana. PMA induce caractersticas tpicas de NETosis, las Fig. 2 y 3 muestran neutrfilos teidos con DAPI a 1 y 2 horas despus de ser estimulados con PMA que se caracterizan por la permeabilizacin de la membrana plasmtica y porque la cromatina des condensada se libera. S. aureus tambin induce caractersticas tpicas de NETosis, las Fig. 4 y 5 muestran neutrfilos teidos con DAPI 1 y 2 horas despus de ser estimulados con S. aureus, que se caracterizan por la permeabilizacin de la membrana plasmtica y porque la cromatina des condensada se libera. En conclusin, se demuestra que S. aureus y PMA inducen NETosis, esto comparado con neutrfilos que no son estimulados y que muestran ncleos teidos con morfologa normal. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Oscar Rojas Espinosa del Departamento de Inmunologa de la ENCB, por su apoyo en la realizacin de los diferentes ensayos experimentales.

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REFERENCIAS
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