Laboratorio de Bioqumica Metablica

UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE OAXACA

Facultad de Ciencias Qumicas

Laboratorio de Bioqumica Metablica

Titular: M.C. Nadia Esteva Duran

Reporte de Prctica N. 2: Determinacin de Glucosa y Lactato en suspensin de Eritrocitos

Integrantes de Mesa 4:
Ros Ros William de Jess Cruz Hernndez Diego Sait Zrate Ramos Rosa Andrea

5to Semestre

Grupo: A

Ciclo Escolar: 2013 2014

Octubre de 2013, Oaxaca, Oaxaca

Mesa 4

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Introduccin
Los azucares, lpidos, protenas, fuentes generadoras de energa que requieren las clulas de un organismo para sus actividades. La glucosa, un glcido, es la principal fuente de energa para los seres vivos. Esta se puede obtener de diversas fuentes que la contengas en su forma tal cual o algunas otro productos de donde derive (como el almidn, sacarosa, lactosa, etc.). Los niveles de glucosa suben y bajan durante el transcurso del da por diversos factores. Cada organismo tiene una concentracin basal de glucosa. La concentracin de glucosa debe encontrarse en valores adecuados, de 60 a 100 mg/dl, un valor por arriba de este, denominado hiperglucemia, o un valor por debajo, denominado hipoglucemia puede provocar enfermedades al ser humano. La determinacin de los niveles de glucosa se puede llevar a cabo por un examen de la sangre. Los eritrocitos, hemates o glbulos rojos son clulas sanguneas cuya funcin principal es la de transportar oxgeno desde los pulmones a los tejidos. En los varones de la especie humana el nmero medio de eritrocitos por mililitro es de 5, 200,000 y en las mujeres 4, 700,000. A lo largo de su vida un eritrocito recorre casi medio milln de veces el aparato circulatorio y, debido a que posee una resistencia mecnica excepcional y gran flexibilidad, atraviesa continuamente circuitos de dimetro inferior a su propio tamao. A diferencia de otras clulas y sus propios precursores, el eritrocito maduro carece de orgnulos subcelulares. Debido a esto no puede sintetizar protenas glucgeno ni lpidos y es incapaz de llevar a cabo la fosforilacin oxidativa. En consecuencia a esto su metabolismo queda limitado ala glicolisis, ciclo de la pentosa fosfato, ciclo de 2,3 bifosfoglicerato, entre otros. Estos procesos metablicos son las precisas para sus necesidades durante sus 120 das de vida. Un eritrocito requiere aporte de energa para el transporte inico, para el mantenimiento del hierro de la hemoglobina en su forma divalente, etc. Uno de los procesos metablicos que ocurre en los eritrocitos como ya se haba citado anteriormente, es la glicolisis. La glicolisis es el proceso de degradacin que sufre la glucosa hasta CO2 Y agua, generando en cada una de sus reacciones diversas intermediarias, transportadoras electrnicas, as como la produccin de energa en forma de ATP. La glicolisis en los eritrocitos se caracteriza, porque en esta clula se lleva a cabo una degradacin incompleta de la glucosa. La biotransformacin de la glucosa en el eritrocito llega hasta la formacin de lactato. El lactato es transportado del eritrocito hacia el hgado, en donde es transformado de nuevo a glucosa, para que esta pueda ser utilizada nuevamente por el eritrocito. Este es un proceso denominado ciclo de Cori

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Fundamento
La glucolisis es la va de degradacin de la glucosa en piruvato. Esta degradacin se lleva a cabo mediante 9 reacciones que se generan diferentes intermediarios que pueden servir como precursores, genera 2 molculas de ATP, 2 molculas transportadores de electrones (NADH) y dos molculas de piruvato. El piruvato generado en la glicolisis, no es el producto de la degradacin final de la glucosa. Este piruvato entra a otras series de reacciones en donde se generan diversas molculas de energa de para la clula, hasta su degradacin total a dixido de carbono y agua. La reaccin global de la glicolisis es la siguiente:

1 glucosa + 2 ADP+ 2 Pi + 2 NAD+ ---> 2 piruvatos + 2 ATP + 2 NADH + 2H+ + 2 H2O

La biotransformacin de glucosa a piruvato se lleva a cabo por diferentes enzimas, en donde existen reacciones reversibles e irreversibles. La reaccin irreversibles condicionan puntos de control de la va (hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa.). La glicolisis hasta la formacin de piruvato se lleva a cabo en las clulas hepticas. Especficamente esta reaccin se genera en el citosol de las clulas. Una vez formado el piruvato entra a la mitocondria para las reacciones posteriores. Glicolisis

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Material, Equipo y Reactivos

Espectrofotmetro Kit para determinacin de glucosa por el mtodo de glucosa oxidasa 5 celdas de vidrio para el espectrofotmetro 5 tubos de ensaye 6x100 2 pipetas automticas, una de 1-10 l y una de 100-1000 l Puntas estriles para pipeta automtica de 10 y 1000 l Cuarto estufa a 37 C 2 tubos para Bacutainer Palillo de madera estril Equipo para extraccin de sangre Centrifuga NOTA: El material presentado anteriormente solo fue para la determinacin de glucosa. Para la determinacin de Lactatono se presenta puesto que no haba reactivo en el laboratorio.

Desarrollo Experimental
1. Extraer a dos de los integrantes del equipo de 2 a 4 ml de sangre en un tubo Bacutainer (cabeza roja) y dejarlos en reposo hasta su coagulacin.

2. Despus de un tiempo, despegar el coagulo de las paredes del tubo con ayuda de un palillo de madera estril. 3. Centrifugar los tubos con la sangre por 5 min a la velocidad mxima de rpm para separar el suero de la suspensin eritrocitaria.

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4. Mientras los tubos estn en la centrifuga, preparar una seria de 5 tubos etiquetndolos del 1 al 5 y a cada uno de ellos colocar con la pipeta automtica 1 ml (1000 l de reactivo de glucosa oxidasa).

5. Pasado los 5 min de la centrifugacin, sacar los tubos y retirar el suero en tubos limpios.

6. Cuando ya se tiene el suero de las muestras, preparar los tubos marcados de la siguiente manera. - Tubo 1- Blanco: 1 ml de Reactivo A* de glucosa oxidasa. - Tubo 2- Tubo estndar (patrn); Colocar con la pipeta automtica 1 ml de reactivo de glucosa oxidasa y 10 l de Solucin Estndar**. - Tubo 3- Control patolgico: Colocar 1 ml de reactivo de glucosa oxidasa y 10 l de solucin del control patolgico - Tubo 4- Muestra 1: Colocar 1 ml de reactivo de glucosa oxidas y 10 l de suero de la muestra 1 - Tubo 5- Muestra 1: Colocar 1 ml de reactivo de glucosa oxidas y 10 l de suero de la muestra 2. 7. Mezclar los tubos e incubar 5 min a 37 C.

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8. Pasado los 5 min de incubacin, sacar los tubos y vaciar el contenido de cada uno en una celda para espectrofotmetro.

9. Leer la absorbancia (As) del tubo 1 (blanco) y las dems celdas con las muestras a 505 nm. 10. Despus de obtener las absorbancias, desechar el contenido de las celdas. 11. Calcular la concentracin de glucosa a partir de la siguiente formula: (As Muestra/ As Patrn) x 100 = mg/dl de glucosa en la muestra Factor de conversin: mg/dl x 0.0555 = mmol/dl *Reactivo A. Solucin conteniendo glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4AF), buffer fosfatos pH 7,0 y 4-hidroxibenzoato en concentraciones especificas (Ver manual como anexo al final) ** Solucin Estndar. Solucin de Glucosa 100 mg/dl (1g/lt)

Resultados
Los resultados de las absorbancias del espectrofotmetro se muestran en la siguiente tabla: Celda (Tubo) 1 2 3 4 5 Contenido Blanco Entandar (patrn) Control patolgico Muestra 1 (William) Muestra 2 (Diego) Absorbancias 0 0.129 0.448 0.197 0.198

Las Absorbancias obtenidas se usaran para poder calcular la concentracin de glucosa en la sangre, los clculos fueron los siguientes:

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Control patolgico

347.28 mg/dl*** de glucosa en la muestra de control patolgico. Se utiliza el valor de la concentracin para calcular la conversin a mmol/dl (347.28 mg/dl)*(0.0555) = 19.27 mmol/dl

Muestra 1- William

152.71 mg/dl de glucosa en la muestra 1- William. Se utiliza el valor de la concentracin para calcular la conversin a mmol/dl (152.71 mg/dl)*(0.0555) = 8.47 mmol/dl

Muestra 2- Diego

153.48 mg/dl de glucosa en la muestra 2- Diego Se utiliza el valor de la concentracin para calcular la conversin a mmol/dl (153.48 mg/dl)*(0.0555) = 8.51 mmol/dl

*La concentracin del control patolgico obtenido nos hace pensar que la patologa s hiperglucemia Las concentraciones de las 2 muestras, nos dan unos niveles altos, sin embargo esto puede no ser tan creble, ya que el reactivo de glucosa oxidasa estaba caduco y no es un parmetro tan confiable.

La reaccin que se produjo en el procedimiento fue la siguiente: Glucosa + O2 + H2O Acido glucnico + H2O2

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Discusin
Debido a la falta de reactivo para Lactato solo se procedi a la determinacin de glucosa, teniendo en cuenta que el ltimo reactivo para la determinacin de la ya mencionada (glucosa) se encontraba ya caducado desde hace ms de un ao por lo que los resultados no son tan confiables ni reales. En la parte final se anexa el manual del Kit de deteccin de glucosa oxidasa que se uso. Otro factor importante en nuestros datos no factibles, es que la temperatura del bao mara no se encontraba exactamente a 37 C adems de que el tiempo que se tuvo que esperar (ms de 10 de minutos aproximadamente) para la medicin de las Absorbancias de nuestros tubos que contenan las muestra problema.

Conclusin

La funcin principal del eritrocito es el transporte de oxgeno, dixido de carbono y protones, y debido a la falta de mitocondrias no le permite tener un proceso aerbico, por lo que no conlleva a la degradacin de glucosa hasta CO2 y H2O y s a la produccin de lactato. El eritrocito utiliza la glucosa para obtener NADPH por la va de las pentosas. El NADPH se utiliza para evitar la oxidacin del hierro de la hemoglobina, que en esa forma no podra transportar el oxgeno, adems de que, de que es utilizada sintetizar 2,3 bifosfoglicerato (2,3 DPG) a partir de 1,3 difosfoglicerato, cuya funcin es disminuir la afinidad de la hemoglobina por el oxgeno, permitiendo una mayor liberacin de oxgeno en los tejidos. Debido a las funciones del eritrocito no requieren tanta energa, es decir no realizan un gran gasto energtico por lo que no necesitan tanto ATP. Con esto se puede deducir que los eritrocitos tienen que usar glucosa para producir energa ya que no tienen ciclo de Krebs ni tampoco fosforilacin oxidativa. Sin un constante suministro de glucosa moriran.

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Esquema del ciclo de cori (Se muestran las diferentes transformaciones del lactato, el cual es eliminado por el eritrocito dirigindose al hgado t posteriormente formando glucosa (proceso llamado gluconeognesis)

Bibliografa:
Murray, Mayes, Granner, Rodwell. Bioqumica de Harper, Editorial Manual Moderno, 15ava. Edicin, 2001.Pginas consultadas: 243 a 254, 700 a 715. Laguna Jos, Pia Enrique. Bioqumica, JGH Editores, 4ta. Edicin, 1990. Pginas Consultadas: 218 a 223. Guyton A.C., Fisiologa Mdica, Editorial Interamericana, 5ta Edicin, 1977. Pginas Consultadas: 8980 a 902.

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