Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

Teknik DNA Sequencing

Meskipun be gitu, t eknik l ama b erbasis chain-termination masih um um digunakan, bahkan sangat efisien untuk menentukan sekuen DNA fragmen pendek ( masih d alam h itungan k ilobasa). J adi d itemukannya t eknik D NA Sequencing yang lebih canggih t idak serta m erta bakal m enggusur m esin-mesin capillary sequencing yang s udah merajalela d i berbagai l aboratorium bi ologi molekuler di seluruh dunia. Artikel i ni akan m embahas p rinsip d asar d an p rotokol DNA sequencing berbasis m etode chain-termination menggunakan m esin automated capillary sequencer. Prinsip Dasar DNA Sequencing DNA s equencing m enggunakan m etode P CR ( Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan s ebagai c etakan ( template) un tuk k emudian d iamplifikasi menggunakan e nzim d an b ahan-bahan y ang m irip d engan r eaksi P CR, n amun ada p enambahan b eberapa p ereaksi t ertentu. P roses i ni d inamakan cycle sequencing.

Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

Primer y ang d igunakan hanya s atu u ntuk s atu ar ah p embacaan, t idak d ua (sepasang) seperti PCR ddNTPs ( dideoxy-Nucleotide Triphosphate) a dalah m odifikasi d ari d NTPs dengan menghilangkan gugus 3-OH pada ribosa. Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya

Saat p roses ek stensi, en zim p olimerase a kan m embuat r antai b aru D NA salinan dari template dengan m enambahkan dNTP-dNTP sesuai d engan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses p olimerisasi a kan t erhenti karena d dNTP t idak m emiliki g ugus 3 -OH yang seharusnya bereaksi d engan g ugus 5 -Posfat d NTP berikutnya m embentuk ikatan posfodiester.

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

Pada ak hir cycle sequencing, y ang d ihasilkan ad alah f ragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini? Cara Klasik Metode y ang pertama k ali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah y ang m asing-masing b erisi s emua p ereaksi y ang d ibutuhkan. K husus untuk d dNTP, y ang d itambahkan hanya 1 j enis u ntuk setiap t abung. S etiap tabung d iberi t anda, A j ika y ang d itambahkan ad alah d dATP, G j ika d dGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP. Setelah r eaksi cycle sequencing selesai, k eempat h asil r eaksi t ersebut dilarikan p ada g el el ectrophoresis sehingga f ragmen-fragmen y ang d ihasilkan dapat t erpisah. U rutan b asa D NA dapat d itentukan d engan m engurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP. Prinsip Sanger Method dengan primer labelling Dye Primers dengan Label Berbeda

Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan l ebih m udah k arena k eempat r eaksi d ipisahkan d alam s atu l ajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?

Dye-Terminators Sequencing Cara y ang l ebih s imple ak hirnya d itemukan j uga. P ara i lmuwan c erdas menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbedabeda u ntuk ddA TP, ddC TP, ddG TP d an ddTTP. Dengan de mikian, r eaksi c ycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 t abung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, p roses pemisahan f ragmen d an p embacaan u rutan ba sa D NA d apat d ilakukan d engan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai d ari 1, 4 , 16 , 4 8 h ingga 9 6 k apiler d alam s atu m esin, s emakin b anyak jumlah k apiler, s emakin b anyak p ula j umlah sampel DNA y ang bi sa d itentukan urutan basanya. Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peakpeak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya. Teknik D NA S equencing y ang be rbasis f ragment an alysis s aat i ni t idak hanya d igunakan u ntuk m enentukan u rutan bas a-basa D NA s emata, t api b isa dikembangkan u ntuk berbagai a plikasi, s eperti p enentuan S NP (Single Nucleotide P olymorphism), analisa keragaman g enetik s eperti DNA Microsatellite d an A FLP ( Amplified F ragment L ength P olymorphism), community a nalysis s eperti t RFLP ( Terminal R estriction F ragment L ength Polymorphism) d an s egudang a plikasi l ainnya. B anyaknya aplikasi D NA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini meskipun kini tergolong lambat s etelah d itemukannya h igh-throughput s equencing akan t etap j adi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh d unia. D an t ak heran p ula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.

Faktor sequencing

Penentu

Keberhasilan

Analisa

DNA

Ekstraksi DNA untuk DNA sequencing Ekstraksi D NA ad alah l angkah p ertama y ang s angat p enting d alam langkah-langkah k erja an alisis DNA sequencing. K ualitas s ecara k eseluruhan, akurasi d an p anjang p embacaan u rutan bas a D NA d apat d ipengaruhi s ecara signifikan ol eh k arakter sample i tu s endiri, d an m etode y ang d ipakai u ntuk ekstraksi D NA. M engisolasi DNA d engan k ualitas t inggi d ari b erbagai j enis sample memiliki t antangan t ersendiri, d an m etode yang ideal ak an be ragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari s umbernya, d an bagaimana sample d itangani at au disimpan s ebelum diekstrak. M etode u ntuk i solasi a sam n ukleat s ering d ikerjakan m enggunakan penghancuran m ekanik atau m etode kimiawi, y ang k adang-kadang j uga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan,

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

kita h arus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, d engan menghindari e kspos t erhadap p anas, c ahaya, freeze-thaw yang be rulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, l aboratorium harus d iatur sedemikian r upa u ntuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample. Desain Primer dan Amplifikasi Urutan k erja DNA sequencing secara u mum m engharuskan k ita mengamplifikasi h asil ekstraksi D NA s ample s ebelum d isekuen. Un tuk mengamplifikasi DNA sample, kita m embutuhkan DNA polymerase, n ukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler. Sequencing Chemistries Cycle sequencing merupakan m etode s ederhana y ang m ana t erdiri a tas proses d enaturasi, a nnealing d an ek stensi y ang b erulang-ulang d alam s ebuah mesin thermal cycler, m enghasilkan a mplifikasi linear p roduk-produk e kstensi. Produk in i k emudian d iinjeksikan k e d alam sebuah k apiler. Un tuk A pplied Biosystems, a da 2 k ategori p endekatan s equencing c hemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.

Sequencing menggunakan Dye Primers Ketika m enggunakan s equencing c hemistry b erbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5 -nya dengan menggunakan dye fluorescent y ang b erbeda. M asing-masing k eempat r eaksi i ni akan m engandung ap akah p rimer y ang dilabel w arna biru, hijau, k uning at au merah. W arna s etiap r eaksi berkorespondensi d engan A , C , G a tau T . Dideoksiribonukleotida ( ddNTP) t erdapat d alam s etiap c ampuran r eaksi, d an menterminasi s intesis DNA s ecara a cak, m enghasilkan f ragmen-fragmen D NA dengan p anjang y ang be rvariasi. K arena d igunakan p rimer y ang d ilabel fluorescent u ntuk ek stensi, s eluruh fragmen y ang d iterminasi t erlabel fluorescent. Setelah b eberapa s iklus y ang c ukup u ntuk t erbentuknya p roduk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer.

Sequencing menggunakan Dye Terminators DNA sequencing fluorescent dapat j uga dilakukan m enggunakan s uatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu t abung r eaksi u ntuk r eaksi dye terminator, b ahan k imia in i l ebih simple untuk d igunakan d ibanding dye primer chemistry. Template DNA, p rimer t ak dilabel, buffer, empat jenis d NTP, empat jenis ddNTP y ang t erlabel f luorescent, dan D NA p olymerase d itambahkan k e d alam t abung r eaksi. F ragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa s ebuah w arna dye yang be rbeda. D engan d emikian semua f ragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3-nya.

BigDye Cycle Sequencing Chemistries BigDye p rimers d an t erminators mengutilisasi m olekul-molekul transfer en ergi t unggal, y ang m encakup s ebuah p ewarna ( dye) d onor dan akseptor energi yang terhubung oleh sebuah penghubung ( linker) transfer energi yang s angat ef isien. D alam s truktur m olekul B igDye, ak septornya ad alah sebuah dye dichlororhodamine. Dye dichlororhodamine (dRhodamine) merupakan s uatu p enyempurnaan a tas dye rhodamine k onvensional. dRhodamine terpisah lebih baik secara spektral terdapat overlap spektral yang jauh l ebih s edikit p ada p anjang g elombang e ksitasi m aksimumnya, d an p roduk sequencing y ang d ihasilkan m emperlihatkan background noise yang j auh berkurang. S ehingga m enghasilkan s ignal y ang l ebih b ersih d an ak urasi base calling yang l ebih besar p ada p embacaan y ang l ebih p anjang. S uatu linker transfer en ergi m eng-couple fluorescein d onor d an dye dRhodamine a kseptor untuk t ransfer en ergi y ang ef isien d alam s atu m olekul t unggal. Dye yang l ebih terang d an b ersih i ni m enghasilkan s ebuah sequencing chemistry yang se suai untuk kebanyakan aplikasi. Pemurnian sample Setelah r eaksi s equencing, s angat p enting u ntuk m embuang dye terminators yang t idak m enempel d an g aram-garam y ang d apat be rkompetisi saat i njeksi elektrophoresis kapiler. Terminator yang tidak menempel dapat turut b ermigrasi b ersama template sequencing, m engakibatkan basecalling errors dan kelebihan garam mengakibatkan rasio signal-to-noise menjadi buruk. Elektroforesis Pada p roses e lektroforesis k apiler, produk-produk reaksi cycle sequencing diinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer. D engan d iberikannya t egangan l istrik t inggi m aka fragmen D NA y ang

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

bermuatan n egatif a kan bergerak m elalui p olimer d i d alam k apiler m enuju elektroda p ositif. D engan d iberikannya t egangan l istrik t inggi m aka f ragmen DNA y ang be rmuatan n egatif ak an bergerak m elalui p olimer di d alam k apiler menuju el ektroda p ositif ( gambar 4 ). E lektroforesis k apiler d apat m emisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaan bobot molekul hanya satu nukleotida.

Beberapa saat sebelum mencapai elektroda positif, fragmen DNA terlabel fluorescent yang t erpisah b erdasarkan u kuran, b ergerak m elalui lintasan s inar laser. Sinar laser menyebabkan dye pada fragmen berpendar. Sebuah alat pendeteksi op tis p ada m esin D NA a nalyzer m endeteksi fluorescent (gambar 5 ). Software Data Collection mengkonversi s ignal f luorescent m enjadi d ata d igital, kemudian merekam datanya dalam sebuah file *.ab1. Karena masing-masing dye mengemisikan c ahaya p ada p anjang gelombang y ang b erbeda k etika t ereksitasi oleh laser, sehingga keempat warna yang mewakili keempat basa dapat dideteksi dan dibedakan dalam satu injeksi kapiler. Analisa Data Setelah e lektroforesis, software Data Collection membuat s ebuah f ile sample d ari data m entah. D engan m enggunakan ap likasi software, an alisa d ata selanjutnya diperlukan untuk menterjemahkan image data warna yang diperoleh menjadi basa-basa nukleotida yang berhubungan. Analisa Primer Tool-tool ini m engkonversi g ambar yang d iperoleh s elama Data Collection menjadi em pat w arna, y ang m erepresentasikan k eempat b asa nukleotida y ang b erhubungan ( gambar 1 ). S ebagai c ontoh, Software Sequence Analysis adalah p erangkat an alisa p rimer y ang h arus d igunakan setelah pengumpulan data selesai. Aplikasi software Sequence Analysis memungkinkan pengguna untuk m elakukan basecall dan basecall ulang, memotong ujung data, menampilkan, m enyunting d an m encetak f ile-file s ample. Software analisa primer m emproses d ata m entah p ada f ile * .ab1 m enggunakan algoritma d an menerapkan pengaturan analisa berikut kepada hasil:

Basecalling

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

Koreksi Pergeseran Mobility File Mobility mengkompensasi perubahan dalam mobilitas fragmen DNA yang d isebabkan o leh m olekul dye yang t erikat p ada f ragmen D NA d an mengubah p enetapan w arna basa-basa bergantung p ada j enis chemistry yang digunakan untuk melabel DNA. Quality Value (QV) Jika m enggunakan K B ba secaller u ntuk analisa, software memberikan suatu Q V u ntuk s etiap bas a. Q V m emprediksi p robabilitas s uatu g alat basecall. Contohnya, s uatu QV 2 0 m emprediksi t ingkat g alat 1 %. A lgoritma p emrediksi kualitas d ikalibrasi u ntuk m emperoleh Q V y ang m emenuhi h ubungan standarindustri y ang d itetapkan ol eh software Phred. J ika a lur k erja k ita m encakup analisa m enggunakan software Phred u ntuk m emberikan Q V s etelah d ata dibasecall, k ita d apat m enyederhanakan workflow dan m enggunakan K B Basecaller saja. KB Basecaller dapat melakukan basecalling dan memberikan QV. Kemudian, k ita d apat m embuat f ile * .phd.1 at au * .scf m enggunakan K B Basecaller untuk diintegrasikan dengan workflow kita. Analisa Sekunder Tool-tool ini m emungkinkan kita u ntuk l ebih m enyempurnakan hasil. Algoritma dalam produk-produk software analisa sekunder melakukan sejumlah aplikasi p endukung f ungsi-fungsi s eperti d eteksi m utasi d an g enotyping, d an menghasilkan output-output grafis.

Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing 1. Apakah Sanger Dideoksi Sequencing itu dan apa bedanya dengan Fluorescent Sequencing Applied Biosystems?

DNA p olymerase d apat b erinkorporasi j uga d engan b asa n ukleotida analognya. M etode d ideoksi p ada DNA sequencing yanG d ikembangkan oleh Sanger e t a l. ( 1977) m emanfaatkan k euntungan k emampuan i ni d engan menggunakan 2-3-dideoksi sebagai substrat. Ketika sebuah dideoksinukleotida berinkorporasi p ada ujung 3rantai yang sedang memanjang, pemanjangan rantai d ihentikan s ecara s elektif p ada A, C , G at au T , k arena r antai k ekurangan gugus 3-hidroksil (lihat gambar 8).

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

2. Apakah Cycle Sequencing itu? Cycle Sequencing adalah sebuah metode sederhana dimana pengulangan denaturasi, an nealing d an ekstensi s ecara berturut-turut dalam t hermal c ycler menghasilkan a mplifikasi l inear pr oduk-produk ek stensi ( lihat g ambar 9 ). Produk i ni k emudian d i-load k edalam d el at au d iinjeksikan k e d alam k apiler. Applied B iosystems m enggunakan p rotokol c ycle s equencing i ni d alam k it DNA sequencingnya. 3. Apakah keuntungan dari cycle sequencing? Keuntungannya adalah sebagai berikut: Protokolnya sangat baik dan mudah untuk dilakukan

Cycle sequencing membutuhkan DNA template yang jauh lebih sedikit dibandingkan metode ekstensi temperatur tunggal. Cycle s equencing l ebih s esuai d ibandingkan m etode p elabelan t emperatur tunggal t radisional y ang m embutuhkan langkah d enaturasi k imiawi u ntuk template utas ganda. Temperatur y ang tinggi mengurangi s truktur sekunder sehingga ekstensi berjalan lebih sempurna Temperatur tinggi mengurangi annealing sekunder primer ke template Protokol yang sama digunakan untuk DNA utas ganda maupun utas tunggal Protokol ini bekerja dengan baik untuk sequencing langsung PCR produk Template-template y ang s ulit, s eperti bacterial artificial chromosomes (BACs), dapat disekuen 4. Apakah Dye Terminator Cycle Sequencing itu? Dengan p elabelan dye terminator, m asing-masing k eempat dideoxy terminators (ddNTPs) d itandai d engan suatu fluorescent dye yang berbedabeda. R antai y ang t umbuh d iterminasi d an d ilabel s ecara s imultan d engan dye yang b erkorespondensi d engan b asa t ersebut ( lihat g ambar 10 ). S uatu p rimer yang tidak dilabel dapat d igunakan. R eaksi dye terminator dapat d ilakukan

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

dalam sebuah tabung. Protokol ini membutuhkan langkah pemipetan yang lebih sedikit d ibanding r eaksi dye primer. R eaksi y ang d ilabel d engan e mpat w arna dye di-load dalam sebuah lajur gel tunggal atau satu injeksi kapiler. Jika terjadi kesalahan t erminasi, y aitu f ragmen y ang t idak d iterminasi o leh dideoksinukleotida, m aka t idak ak an t erdeteksi k arena t idak a da dye yang menempel. 5. Apakah Dye Primer Cycle Sequencing itu? Dengan p elabelan dye primer, p rimer d itandai d engan em pat p ewarna fluorescent yang berbeda. Produk terlabel terbentuk dalam empat reaksi spesifik basa y ang be rbeda. P roduk d ari k eempat r eaksi i ni l alu d icampur d an d i-load kedalam s atu l ajur g el at au s atu i njeksi kapiler ( lihat g ambar 1 1). Dye primer chemistries umumnya m enghasilkan intensitas sinyal y ang lebih b aik dibanding dye terminator chemistries. Primer yang terlabel tersedia secara komersial untuk situs-situs pr imer y ang u mum. K ita d apat j uga m elabel c ustom p rimer. R eaksi yang d ilabel d engan e mpat w arna dye di-load k e d alam l ajur t unggal at au s atu injeksi kapiler. 6. Apakah Matrix Standard itu? Overlap s pektral y ang p resisi a ntara k eempat dye diukur d engan menjalankan (running) fragmen DNA yang dilabel menggunakan masing-masing dye dalam k alibrasi s pektral p ada m esin AB I P RISM G enetic An alyzer. Fragmen DNA yang dilabel dye ini dinamakan matrix standards. Software Data Utility k emudian m enganalisa d ata d ari sample matrix s tandard d an m embuat file m atrix. N omor-nomor i ni a dalah i nternetan f luorescent y ang d inormalisasi dan merepresentasikan suatu deskripsi matematis overlap spektral yang teramati diantara dye-dye. F ile-file m atrix d alam f ile i nstrumen d igunakan u ntuk j enis chemistry ya ng s pesifik, d an me nyediakan i nformasi b agi software Sequence Analysis sehingga memungkinkannya untuk mengkoreksi overlap spektral. 7. Apakah BAC End-Sequencing itu? Bacterial artificial c lones a lias B AC ad alah segmen be sar D NA ( 100kb200kb) y ang d iklonkan k e d alam bakteri d ari spesies lain. Beberapa salinan dapat dibuat setelah kloning. Sekuen dari ujung BAC menyediakan penanda yang sangat s pesifik. S ekuen i ni k emudian d apat d ibandingkan d engan p ustaka B AC untuk konformasi. 8. Apakah yang dimaks dengan Checking Clone Constructs?

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

Ini merupakan cara untuk memverifikasi bahwa DNA yang kita inginkan sudah diklon dengan baik kedalam vektor menggunakan DNA sequencing. 9. Apakah Multicomponent Analysis itu? Multicomponent analysis merupakan p roses y ang m emisahkan k eempat warna dye fluorescent m enjadi k omponen-komponen s pektral t ersendiri. Meskipun s etiap dye mengemisikan f luoresensi m aksimumnya p ada p anjang gelombang yang berbeda, terdapat beberapa overlap pada spektrum emisi antara keempat dye (lihat g ambar 12) . T ujuan multicomponent analysis adalah mengisolasi s ignal dari s etiap dye sehingga n oise pa da d ata m enjadi s esedikit mungkin. 10. Apakah De Novo Sequencing itu? Proses ek sperimental p enentuan u rutan basa n ukleotida s uatu d aerah (region) D NA d engan m elabel setiap n ukleotida d engan p enanda f luorescent untuk mengidentifikasinya. 11. Apakah yang dimaksud dengan Multi-Locus Sequence Typing (MLST)? MLST adalah suatu prosedur yang tidak ambigu untuk mengkarakterisasi isolat b akteri m enggunakan s ekuen f ragmen i nternal d ari 7 g en housekeeping. Prosedur i ni m enggunakan f ragmen internal (~450-500 bp) d ari s etiap g en, sehingga mereka dapat disekuen pada kedua utasnya secara akurat dengan mesin DNA s equencer t erotomatisasi. U ntuk s etiap g en h ousekeeping, s ekuen-sekuen yang terdapat dalam suatu spesies bakteri dinyatakan sebagai alel yang jelas, dan untuk setiap isolat, alel pada masing-masing ketujuh loci mendefinisikan profice allelic atau jenis sekuen (IST) 12. Apakah yang dimaksud dengan Deteksi berbasis SNP atau Resequencing? Sebuah heterozygote mengandung alel-alel yang berbeda pada suatu locus (posisi) pada kromosom homolog. Deteksi heterozygote dilakukan dengan primer spesifik. 13. Apakah HLA Typing itu? Pengujian human leukocyte antigen (HLA) m endeteksi a ntigen-antigen (penanda g enetik) pada s el darah putih. T erdapat 4 jenis human leukocyte antigens yaitu: H LAA, H LAB, H LAC, d an H LAD. Tes H LA me nguji

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

kompatibilitas j aringan d an p enentuan j enis j aringan r eseptor/donor. T es i ni juga d igunakan p ada k onseling g enetik d an p engujian p aternitas. ( hanya u ntuk riset.) 14.apakah Deteksi Metilasi itu? Metilasi DNA t erjadi p ada situs C pG, y ang m ana s ekuen DNA d engan sitosin b erada d ekat d engan g uanin. M etilasi d imediasi o leh suatu e nzim ( DNA methyltransferase). Situs CpG jarang terdapat pada genom eukariot, kecuali pada wilayah y ang d ekat d engan p romoter s uatu g en eu kariotik. W ilayah i ni d ikenal sebagai CpG islands, d an k eadaan metilasi pa da s itus-situs C pG pe nting b agi aktifitas/ekspresi gen. 15. Apakah mtDNA sequencing itu? mtDNA adalah k ependekan d ari m itokondria. M olekul m itokondrial terdapat d alam j umlah 10 0-1000 salinan p er s el, l ain d engan D NA i nti y ang terdapat h anya d ua s alinan p er s el. B anyaknya m tDNA m emungkinkan diskriminasi a ntara in dividu-individu a tau s ampel-sampel b iologis, k hususnya jika DNA inti rusak atau tidak tersedia. 16. Apakah Resequencing? yang dimaksud dengan Comparative Genomic

Comparative Genomic Resequencing adalah p erbandingan g enomgenom d an in dividu-individu d alam s uatu g enom. C omparative genomics memungkinkan a plikasi i nformasi y ang d iperoleh d ari s uatu g enom s ampel menjadi s uatu g enom y ang l ebih k ompleks. I ni m erupakan d asar u ntuk memahami variasi genetik dalam suatu populasi. 17. Apakah Metode SAGE itu? SAGE ad alah s ebuah m otede u ntuk analisa k uantitatif, p ola e kspresi gen pada genome. Suatu tag sekuen pendek (10 25 bp) mengandung informasi yang cukup untuk mengidentifikasi suatu transkrip. 18. Apakah yang dimaksud dengan profiling mutasi menggunakan analisa, deteksi atau validasi SNP itu? Sebuah single nucleotide polymorphism (SNP) adalah substitusi satu basa atas y ang l ainnya. B eberapa m etode b erbasis s equencing t ersedia u ntuk pencarian dan analisa SNP.

Kris Cahyo Mulyatno ITD UA

DAFTAR PUSTAKA
http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dnasequencing/ http://sciencebiotech.net/mengenal-teknik-dna-sequencing/ http://sciencebiotech.net/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dnasequencing/