Anda di halaman 1dari 25

BAB I PENDAHULUAN 1.

1 latar Belakang Penentuan mutu makanan pada umumnya sangat bergantung pada beberapa faktor diantaranya cita rasa, warna, tekstur dan nilai gizinya, disamping itu ada faktor lain , misalnya mikrobiologis. Tetapi sebelum faktor-faktor lain dipertimbangkan, secara visual faktor warna tampil lebih dahulu dan kadangkadang sangat menentukan. ( Winarno, 1992 ) Selain sebagai faktor yang ikut menentukan mutu, warna juga dapat digunakan sebagai indikator kesegaran atau kematangan. Baik tidaknya cara pencampuran atau cara pengolahan dapat ditandai dengan adanya warna yang seragam dan merata.( Cahyadi, 2008 ) Zat warna sudah sejak lama dikenal dan digunakan, misalnya daun

pandan atau daun suji untuk warna hijau dan kunyit untuk warna kuning. Kini dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi telah ditemukan zat warna sintetis, karena pengunaanya lebih praktis dan harganya lebih murah. ( Cahyadi, 2008 ) Menurut Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No 033 Tahun 2012, yang dimaksud dengan pewarna adalah bahan tambahan pangan berupa pewarna alami dan sintetis, yang ketika ditambahkan atau diaplikasikan pada pangan, mampu memberi atau memperbaiki warna. ( Depkes, 2012 ) Secara garis besar, berdasarkan sumbernya dikenal dua jenis zat warna yang termasuk kedalam golongan tambahan pangan , yaitu pewarna alami dan pewarna sintetis. Pewarna alami adalah pewarna yang dibuat melalui proses

ekstraksi, isolasi atau derivitisasi ( sintesis parsial ) dari tumbuhan, hewan, mineral, atau sumber alami lain, termasuk pewarna identik alami. Pewarna sintetik adalah pewarna yang diperoleh secara sintesa kimia. ( Depkes, 2012 ) Di Negara maju, suatu pewarna sintetik harus melalui berbagai prosedur pengujian sebelum dapat digunakan sebagai pewarna pangan. Zat warna yang di izinkan penggunaanya dalam pangan disebut sebagai permitted color atau certified color. ( Cahyadi, 2008 ) Zat pewarna makanan yang paling umum dibahas adalah tartrazine

(E102), zat warna makanan sintetis yang telah diidentifikasi menyebabkan kondisi seperti asma, eksim, urtikaria dan migrain (Rowe et al. 1994). Perubahan perilaku, seperti hiperaktif, kegelisahan dan gangguan tidur, berkaitan dengan konsumsi yang banyak pada anak-anak . (Metcalfe et al. 2003). Bukti menunjukkan juga bahwa anak-anak mungkin lebih rentan daripada orang dewasa terhadap zat pewarna sintetis tertentu dan mereka terpapar, disamping itu

konsumsi mereka seringkali lebih besar dibandingkan orang dewasa (Goldman 2000) Tartrazin merupakan pewarna sintetis yang diperbolehkan penggunaanya oleh Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No 033 Tahun 2012 dalam batas maksimum yaitu 300 mg/kg ( Badan POM, 2013 ) . Zat pewarna ini digunakan oleh masyarakat untuk memberi warna kuning pada makanan dan minuman , biasanya dijumpai pada kerupuk, kue kering, keripik pisang, minuman dan lain-lain. ( Mudjajanto, 2007 ) . Namun kadang zat pewarna yang terdapat pada makanan dan minuman tersebut melebihi batas sehingga perlu dilakukan

penelitian untuk mengetahui jenis dan kadar zat warna yang digunakan ( Trianto, 2007 ) Berdasarkan hal diatas, maka perlu dilakukan penelitian terhadap jajanan anak sekolah di sekitar Sekolah Dasar Negeri 17 Gunung Pangilun Padang

dengan Metoda Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ).

1.2

Perumusan Masalah

Apakah zat warna sintetik tartrazin yang terdapat didalam jajanan anak sekolah kadarnya sesuai Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No

033 Tahun 2012. 1.3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui berapa kadar zat warna sintetik tartrazin yang terdapat didalam jajanan anak sekolah.

1.4

Hipotesa Penelitian

1. Apakah

kadar zat warna sintetik tartrazin yang terdapat didalam

jajanan anak sekolah yang melebihi ambang batas yang di persyaratkan. 2. Apakah kadar zat warna sintetik tartrazin yang terdapat didalam jajanan anak sekolah yang tidak melebihi ambang batas yang di persyaratkan.

1.5

Mamfaat Penelitian Dengan mengetahui berapa kadar zat warna sintetik yang terdapat didalam

jajanan anak sekolah, diharapkan kepada masyarakat dapat berhati-hati dalam mengkonsumsinya dan membatasi jumlahnya.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 2.1.1

Tinjauan Kimia Tartrazin Monografi Pewarna Tartrazin Tartrazin merupakan serbuk berwarna kuning jingga, tidak berbau yang

mudah larut dalam air, dengan larutannya berwarna kuning keemasan. Kelarutannya dalam alkohol 95 % hanya sedikit, dalam gliserol dan glikol mudah larut.( Depkes, 1979 ) Tartrazin tahan terhadap cahaya, asam asetat, HCl, dan NaOH 10 %. NaOH 30 % akan menjadikan warna berubah kemerah-merahan. Mudah luntur oleh adanya oksidator, FeSO4 membuat larutan zat berwarna menjadi keruh, tetapi Al tidak berpengaruh. Adanya tembaga ( Cu ) akan mengubah warna kuning menjadi kemerah-merahan. ( Winarno, 1992 )

Gambar 1. Struktur kimia Tatrazin

2.1.2

Identifikasi Zat Warna Tartrazin ( Depkes RI, 1979 ) Larutkan 0,1 g zat dalam 100 ml air ; terjadi warna kuning. Larutkan 0.1

gran dalam 100 ml amonium asetat 0.02 N, encerkan 1 ml larutan dengan amonium asetat 0.02 N hingga 100 ml; larutan mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 428 2 nm. Pada 5 ml larutan zat (1=1000) tambahkan 1 ml asam klorida P; tidak terbentuk endapan dan warna larutan tidak berubah. Pada 5 ml larutan zat (1=1000) tambahkan 1 ml larutan natrium hidroksida P (1=10); warna merah agak lebih nyata. Larutkan 0,1 g zat dalam 10 ml asam sulfat P; terjadi warna kuning, tambahkan 2 tetes atau 3 tetes larutan pada 5 ml air; terjadi warna kuning.

2.1.3

Penetapan Kadar Zat Warna Tartrazin ( Depkes RI, 1979 ) Timbang seksama lebih kurang 1,5 g zat, larutkan dalam air hingga 250,0

ml. Lanjutkan penetapan menurut Cara Titaniumtriklorida ( Cara c) yang tertera pada Pemeriksaan pewarna, menggunakan 50 ml larutan. Tiap ml

titan(III)klorida 0,1 N setara dengan 13,36 mg C16H9N4Na3O9S2.

2.1.4 Sintesa 2.2 Tinjauan Farmakologi ( Cahyadi,2008 ) Zat warna diabsorpsi didalam saluran pencernaan makanan dan sebagian dapat mengalami metabolisme oleh mikroorganisme dalam usus. Dari saluran pencernaan dibawa langsung kehati, melalui vena portal atau melalui system

limpatik ke vena kava superior. Di dlam hati, senyawa dimetabolisme dan atau di konjugasi, lalu ditransporasikan ke ginjal untuk dieksresikan bersama urine. 2.3 Tinjauan Farmasetik

2.4 Bahan Tambahan Makanan 2.5 Pewarna 2.5.1 Pengertian zat warna 2.5.2 Penggolongan zat warna 2.6 Analisa kualitatif dan kuantitatif zat warna tartazin didalam makanan dan minuman. 2.6.1 Metoda Kromatografi Lapis Tipis (KLT ) (Gandjar et al, 2012 ) KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Untuk meyakinkan identifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan lebih dari 1 fase gerak dan jenis pereaksi semprot. Teknik spiking dengan menggunakan senyawa baku yang sudah diketahui sangat dianjurkan untuk lebih memantapkan pengambilan keputusan identifikasi senyawa 2.6.2 Metoda Densitometri (Rohman, 2009 ) Densotometri merupakan metoda analisis instrumental yang mendasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada KLT. Densitometri lebih dititik beratkan untuk analisa kuantitatif analit-analit

dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. 2.6.3 Metoda Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT ) Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan metode pemisahan senyawa berdasarkan prinsip adsorpsi, partisi, penukar ion atau eksklusi menggunakan cairan yang dialirkan dengan sistem pompa bertekanan tinggi. Fase diam digunakan cairan yang diberi penyangga atau padatan yang disalutkan kedalam kolom dan fase geraknya berupa cairan (Gritter, Bobbit dan Schwarting, 1991; Rohman, 2009).

2.6.3.1 Prinsip Kerja KCKT Sistem KCKT dijalankan dengan prinsip sebagai berikut: fase gerak didorong melalui kolom dengan tekanan dan laju yang sesuai dengan yang diinginkan. Setelah sistem mencapai kesetimbangan, cuplikan yang dilarutkan dalam pelarut yang cocok disuntikkan kedalam sistem, biasanya melalui katup. Linarut terbawa kedalam kolom, dipisahkan dan dikeluarkan melalui detektor. Hasil detektor diteruskan ke perekam sehingga dihasilkan kromatogram (Rohman, 2009). 2.6.3.2 Macam-macam KCKT (Rohman, 2009) Berdasarkan kepolarannya, KCKT dibagi menjadi 2, yaitu : 1. Kromatografi fase normal Pada fase ini fase diam bersifat polar sedangkan fase geraknya non polar. Fase diam yang biasa digunakan adalah silika atau alumina. 2. Kromatografi fase terbalik

Fase ini kebalikan dari fase normal, dimana fase diam bersifat non polar sedangkan fase gerak polar. Sebagai fase diam digunakan silika yang telah dimodifikasi, dimana gugus OH pada silika diberi penyangga sehingga kolom lebih berifat non polar. Berdasarkan sifat fase diam atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, KCKT dapat dikelompokkan menjadi 6 kelompok : 1. Kromatografi adsorpsi Pemisahan kromatografi adsorpsi biasanya menggunakan fase normal dengan fase diamnya berupa silika gel atau alumina. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. 2. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon nonpolar seperti oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. 3. Kromatogafi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Penukar ion yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. 4. Kromatografi pasangan ion

Dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 5. Kromatografi eksklusi ukuran Digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul (BM) > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel) atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM lebih besar akan terelusi lebih dahulu daripada molekul dengan BM kecil, karena itu terjadi pemisahan. 6. Kromatografi afinitas Pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan sterik tertentu pada sampel yang sesuai. Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. 2.6.3.3 Peralatan KCKT Instrumen KCKT terdiri atas : 1. Wadah fase gerak Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT harus memenuhi persyaratan sebagai berikut : a. Harus murni secara kimia b. Harus bebas dari gas c. Harus bebas dari partikel-partikel kecil

d. Tidak bereaksi dengan pengemas kolom e. Dapat melarutkan sampel dengan baik f. Viskositas rendah 2. Pompa Pompa yang digunakan dalam sistem KCKT harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT, yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. 3. Injektor Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. 4. Kolom Kolom merupakan bagian KCKT dimana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Oktadesilsilika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena

mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. 5. Detektor Detektor berfungsi untuk mendeteksi fase gerak yang keluar dari kolom. Ada beberapa detektor yang dapat digunakan pada KCKT, yaitu : a. Detektor UV Detektor UV tersedia dalam 2 jenis, yang paling sederhana dan murah adalah detektor dengan satu panjang gelombang 345 nm. Yang kedua adalah detektor dengan panjang gelombang yang dapat diubah-ubah dan dapat diatur antara 190-700 nm, sehingga pada panjang gelombang tersebut pelarut menyerap minimum dan zat terlatur menyerap maksimum. b. Detektor fluoresensi Detektor fluoresensi lebih peka dibandingkan dengan detektor lainnya, tetapi hanya dapat dipakai untuk senyawa yang terfluoresensi. c. Detektor indeks bias Detektor indeks bias bekerja dengan cara mengukur perbedaan antara indeks bias cuplikan pelarut pengelusi yang murni dan indeks bias yang keluar dari kolom. Perbedaan ini disebabkan oleh adanya zat terlarut. Kepekaan detektor indeks bias jauh lebih rendah dibandingkan dengan detektor lain. d. Detektor daya hantar listrik Detektor ini digunakan untuk mengukur zat terlarut yang bersifat ion. 6. Rekorder atau perekam

Pada peralatan KCKT yang canggih, rekorder dilengkapi dengan pengolahan data yang dapat menghitung langsung waktu retensi, luas area dan konsentrasi zat.

Gambar 4. Skema Alat KCKT (Rohman, 2009) 2.6.3.4 Keuntungan penggunaan KCKT (Rohman, 2009) Sistem KCKT memiliki keuntungan, yaitu : 1. Waktu analisa yang dibutuhkan lebih pendek 2. Tekniknya tidak tergantung pada skill operator 3. Kolom dapat digunakan berkali-kali 4. Detektor KCKT dapat divariasikan dan banyak jenisnya 5. Ketepatan dan ketelitiannya relatif tinggi 6. Mudah dioperasikan secara otomatis. 2.6.3.5 Validasi Metode Analisa Validasi metode dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Secara singkat validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisis yang

akan digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan. Parameter dalam validasi metode analisis adalah (Rohman, 2009) : 1. Akurasi Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar senyawa yang sebenarnya. Akurasi dilakukan dengan cara : a. Membandingkan hasil metode dengan senyawa standar rujukan yang kemurniannya sudah diketahui b. Menambah sejumlah analit bahan murni kedalam sampel yang dianalisa dan hasilnya dibandingkan dengan kadar senyawa yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Kadar analit dalam metode penambahan bahan baku dapat dihitung sebagai berikut :

% perolehan kembali =

Dimana, C1 = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran C0 = konsentrasi sampel sebenarnya C = konsentrasi analit yang ditambahkan Nilai rentang recovery dianggap baik 80 110 % (AOAC, 1993). 2. Presisi Presisi merupakan ukuran kedekatan antara serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel homogen yang sama. Konsep presisi diukur dengan simpangan baku (SB) atau koefisien variasi

(KV). Kriteria keseksamaan diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (SBR) atau koefisien variasi (KV) 2 %. 3. Sensitifitas a. Batas deteksi (BD) Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi. Dalam kromatografi, batas deteksi adalah jumlah puncak yang diinjeksikan yang menghasilkan puncak dengan tinggi paling sedikit 3 kali noise garis dasar.

BD = 3 x SB/b

b. Batas kuantitasi (BK) Batas kuantitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Tinggi puncak lebih kurang 10-20 kali lebih tinggi dari noise garis dasar.

BK = 10 x SB/b

4.

Linearitas Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasilhasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Uji linearitas dilakukan dengan satu seri larutan baku yang terdiri dari minimal 5 konsentrasi dengan rentang 50 150 % dari konsentrasi

yang diharapkan. Respon haruslah linier terhadap konsentrasi baku. Garis yang diperoleh seharusnya tidak dipaksa melalui titik nol. Linearitas dinyatakan dengan nilai koefisien korelasi (r) yang mendekati 1.

2.5.3 Uji Kesesuaian Sistem Uji kesesuaian sistem atau pengujian fungsi alat bertujuan untuk mengetahui apakah sistem kromatografi yang digunakan memenuhi syarat yang telah ditentukan dalam monografi sehingga mutu data yang dihasilkan dapat dipercaya dan dipertanggungjawabkan. Uji kesesuaian sistem meliputi: 1. Waktu retensi Selang waktu yang diperlukan oleh analit mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyal secara maksimal ditangkap oleh detektor disebut sebagai waktu retensi (retention time). Waktu retensi analit yang tertahan pada fase diam dinyatakan dengan tR, sedangkan waktu retensi analit yang tidak tertahan pada fase diam atau sering disebut sebagai waktu retensi pelarut pengembang dinyatakan sebagai t0 atau tm. Waktu retensi yang dinyatakan dalam satuan menit memberikan arti yang sangat penting dalam analisa kualitatif dengan KCKT. 2. Efisensi kolom (N) Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah pelat yang didasarkan pada konsep pelat teoritis. Jumlah pelat teori (N) dihitung dengan rumus :

N = 16

Dimana : N W tR = jumlah pelat teori = lebar dasar puncak (menit) = waktu retensi solut (menit)

3.

Jarak setara pelat teori (HETP) Jarak setara pelat teori adalah panjang kolom yang dibutuhkan untuk menghasilkan suatu lempeng teoritis. Artinya, tercapainya suatu

kesetimbangan linarut diantara fase gerak dan fase diam yang disebabkan oleh pergerakan fase gerak. HETP dapat dihitung dengan rumus :

HETP =

Dimana : HETP L N = jarak setara pelat teori = panjang kolom = jumlah pelat teori

Kolom yang baik akan mempunyai bilangan lempeng (N) yang tinggi dan nilai HETP yang rendah. 4. Faktor resolusi (Rs) Resolusi adalah ukuran kemampuan kolom untuk memisahkan 2 analit. Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan antara waktu retensi 2 puncak yang

saling berdekatan (tR = tR2 tR1) dibagi dengan lebar puncak (W1 + W2). Rumus untuk menghitung resolusi adalah sebagai berikut :

Nilai R harus 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution). Resolusi yang besar akan dicapai jika perbedaan waktu retensi analit cukup besar dan lebar puncak analit dengan analit yang lainnya adalah sesempit mungkin. 5. Faktor asimetri (Faktor pengekoran) Faktor asimetri adalah terjadinya pengekoran pada suatu puncak sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak simetri.

Kromatogram yang memberikan harga TF = 1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat setangkup atau simetri. Harga TF > 1 menunjukkna bahwa kromatogram mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga TF maka kolom yang digunakan semakin kurang efisien. Dengan demikian harga TF dapat digunakan untuk melihat efisiensi kolom kromatografi. 6. Faktor kapasitas kolom (k)

Kapasitas kolom merupakan rasio dari volume fase gerak dan fase diam didalam kolom. Kapasitas kolom menyatakan waktu retensi suatu komponen dalam kolom. Faktor kapasitas kolom dihitung dengan rumus :

k tR tm

= kapasitas kolom = waktu retensi solut = waktu retensi fase gerak

Nilai optimum k adalah 1 k 10. 7. Faktor selektifitas () Selektifitas adalah rasio waktu retensi dari 2 analit. Faktor selektifitas merupakan cara untuk memperbaiki daya pisah dalam pemisahan kolom. Selektifitas dihitung dengan rumus :

Nilai optimum adalah 2 5.

BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN

3.1

Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini akan dilaksanakan kurang lebih tiga bulan di Laboratorium

Kimia Bahan Alam Fakultas Farmasi Universitas Andalas dan Laboratorium Penelitian Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian meliputi : HPLC Shimadzu LC6AD yang dilengkapi oleh system controller SPD-M20A, UV-Vis detector, kolom C18 dengan panjang kolom 25 cm (5 m, 250 x 4,6 mm), jarum suntik (20 l), spektrofotometer uv-vis, timbangan analitik, labu ukur, pipet volume, erlenmeyer, gelas piala, corong, pipet tetes, labu semprot, cawan penguap, waterbath, batang pengaduk, corong pemisah, penyaring membrane milipore 0,22 mm, alat untuk menghilangkan gas yang terdapat dalam larutan (2210 Branion Sonic), kertas saring, cawan penguap, plat tetes. 3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi : kopi bubuk bermerk dagang KA, TP dan LW yang beredar dipasaran, etanol, reagen parry, NH4OH pekat, asam klorida, kalium klorat, natrium hidroksida, kloroform p.a,

natrium sulfat anhidrat, aquabidest, metanol grade HPLC, kofein pembanding kimia.

3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel Sampel yang digunakan adalah kopi bubuk dalam kemasan sachet bermerk dagang KA, TP dan LW yang beredar dipasaran kota Padang. Masing-masing produk diambil 10 sachet, lalu dicampur dan diaduk sampai homogen. Kemudian ditimbang dan dihitung berat rata-rata satu sachet. Bobot sampel bubuk kopi yang diambil setara dengan bobot satu sachet. 3.3.2 Ekstraksi Kofein dalam Sampel Ditimbang bubuk kopi setara dengan bobot 1 sachet kemudian dimasukkan kedalam beaker glass. Ditambahkan 200 ml air mendidih, diaduk selama lebih kurang 2 menit. Kemudian larutan disaring menggunakan kertas saring. Filtrat dipindahkan ke corong pisah dan difraksinasi dengan 5 x 30 ml kloroform selama 15 menit. Lapisan kloroform diambil, kemudian digabungkan dan dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat. Akan terbentuk lapisan kloforom, dimana kofein larut didalamnya, dan endapan natrium sulfat anhidrat. Larutan disaring dan filtrat diuapkan. 3.3.3 Identifikasi Kofein dalam Sampel Ekstrak ditambah 2 tetes etanol, 1 tetes reagen parry dan 1 tetes NH4OH pekat akan menghasilkan warna hijau (Hartono, 2009).

Dilarutkan ekstrak dalam 1 ml asam klorida dan ditambahkan 50 mg kalium klorat, diuapkan di atas tangas uap sampai kering. Sisa yang berwarna kuning kemerahan dilewatkan di atas uap amoniak akan berubah menjadi merah violet yang hilang dengan penambahan larutan alkali kuat (Depkes RI, 1995).

3.3.4

Pembuatan Larutan Standar Kofein Ditimbang 10 mg kofein standar, dilarutkan dengan metanol dalam labu

ukur 10 ml, kemudian ditambahkan aquabidest sampai tanda batas hingga diperoleh konsentrasi 1000 g/ml. 3.3.5 a. Penentuan dan Pemilihan Kondisi Analisa

Panjang gelombang maksimum Dibuat larutan standar kofein 10 g/ml dengan melakukan pengenceran dari larutan standar 1000 g/ml. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 200 - 400 nm.

b.

Fase gerak Metanol : air (1:4) Diambil 100 ml metanol dan 400 ml aquabidest, dimasukkan kedalam labu ukur 500 ml dan dicampur sampai homogen. Metanol : air (3:7) Diambil 150 ml metanol dan 350 ml aquabidest, dimasukkan kedalam labu ukur 500 ml dan dicampur sampai homogen.

c.

Kecepatan alir Kecepatan alir yang digunakan adalah 0,8 ml/menit dan 1,0 ml/menit.

Untuk pemilihan kondisi analisa, dibuat larutan standar kofein 10 g/ml dengan melakukan pengenceran dari larutan standar kofein 1000 g/ml. Kemudian diinjeksikan larutan tersebut sebanyak 20 l ke alat KCKT pada panjang gelombang maksimum, dengan kecepatan 0,8 ml/menit dan 1,0 ml/menit, dengan fase gerak metanol : air (1:4 dan 3:7).

3.3.6

Pembuatan Kurva Kalibrasi Dari larutan standar kofein dengan konsentrasi 1000 g/ml, dipipet 1; 1,5;

2; 2,5; 3 ml berturut-turut dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, dicukupkan volumenya dengan fase gerak sampai tanda batas hingga diperoleh konsentrasi 100, 150, 200, 250 dan 300 g/ml. Kemudian masing-masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak 20 l ke alat KCKT dengan kondisi analisa terpilih, lalu dianalisis hubungan antara konsentrasi dengan luas puncak kromatogram dan dicari persamaan regresi linearnya. 3.3.7 a. Validasi Metoda Analisis

Linearitas Larutan standar dengan konsentrasi 100, 150, 200, 250 dan 300 g/ml diinjeksikan sebanyak 20 l ke dalam sistem KCKT. Kurva kalibrasi dibuat dengan memplot konsentrasi dan luas puncak pada masing-masing konsentrasi. Harga koefisen korelasi (r) ditentukan dengan persamaan regresi linier : y = a + bx. Dimana, y = luas puncak (AUC)

a = konstanta b = koefisien regresi x = konsentrasi (g/ml)

b.

Sensitifitas Sensitifitas ditentukan dari perhitungan nilai batas deteksi (BD) dan nilai batas kuantitasi (BK). Penentuan batas deteksi (BD) dan batas kuantitasi (BK) dihitung dari persamaan regresi kurva kalibrasi yang diperoleh dan dari data simpangan baku. y = a + bx

SB =

y yi
n 1

BD = 3 x SB/b BK = 10 x SB/b Dimana : BD = batas deteksi

BK = batas kuantisasi SB = Simpangan baku n c. = banyaknya pasangan data

Presisi Larutan standar kofein dengan konsentrasi 1000 g/ml, dipipet 0,1 ml. Kemudian dimasukkan ke labu ukur 10 ml dan dicukupkan volumenya dengan fase gerak. Lalu saring dengan penyaring membrane milipore 0,22 mm dan diinjeksikan 20 l ke sistem KCKT, dielusi dengan fase gerak yang cocok. Percobaan dilakukan sebanyak 5 kali. Lalu dihitung simpangan baku dan koefisien variasinya (KV).

d.

Uji perolehan kembali Timbang 10 mg ekstrak dimasukkan masing-masing kedalam empat buah labu ukur 10 ml. Kemudian tambahkan 0, 1, 2 dan 3 ml larutan standar kofein dengan konsentrasi 10 g/ml ke dalam masing-masing labu ukur dan diaduk sampai homogen. Dicukupkan volumenya sampai tanda batas dengan fase gerak. Pipet 0,1 ml lalu encerkan dengan fase gerak sampai tanda batas pada labu 10 ml. Kemudian larutan disaring dan diinjeksikan 20 l ke alat KCKT dengan kondisi analisa terpilih.

3.3.8

Penetapan Kadar Kofein

Timbang 10 mg ekstrak lalu masukkan kedalam labu ukur 10 ml, ditambahkan fase gerak sampai tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi 1000 g/ml. Kemudian pipet 0,1 ml dari larutan dengan konsentrasi 1000 g/ml masukkan kedalam labu ukur 10 ml, cukupkan volumenya dengan fase gerak sehingga diperoleh konsentrasi 10 g/ml. Kemudian larutan tersebut disaring dengan penyaring membrane milipore 0,22 mm dan diinjeksikan 20 l ke alat KCKT. Kromatogram yang diperoleh dibandingkan dengan kromatogram baku pembanding dan kadarnya dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi