Analisa Kuantitatif Modern (Spektroskopi)

Terbagi menjadi beberapa cara :

Spektroskopi Ultaviolet dan Visible Spektroskopi Inframerah o Analisis Inframerah-dekat (Near-infrared analysis, NIRA) Spektrofotometri Atom o Spektrofotometri Emisi Atom (SEA) o Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) Spektroskopi Emisi Molekul o Spektrofotometri Fluoresensi o Spektrofotometri Raman Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Spektrometri Massa

1. Spektroskopi ultraviolet dan visible Prinsip : radiasi pada rentang panjang gelombang 200-700 nm dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron-elektron pada ikatan di dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga menempati keadaan kuantum yang lebih tinggi dan dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan tersebut. Semakin longgar elektron tersebut ditahan didalam ikatan molekul, semakin panjang gelombang (energi lebih rendah) radiasi yang diserap. Penerapan : Metode yang kuat dan terandalkan untuk kuantifikasi obat-obat dalam formulasi yang tidak ada interferensi dari eksipien. Penentuan nilai pKa beberapa obat. Penentuan koefisien partisi dan kelarutan obat Digunakan untuk menentukan pelepasan obat dari formulasi seirin waktu, misalnya dalam uji disolusi. Dapat digunakan untuk memantau kinetika reaksi penguarain obat. Spektrum UV suatu obat sering digunakan sebagai salah satu dari sejumlah pemerikasaan identifikasi pada Farmakope. Instrumentasi : diagram sederhana suatu spektrofotometer UV/Visible memiliki 3 komponen utama (gambar 4.4) Sumber cahaya : lampu deuterium untuk daerah UV dari 190 sampai 350 nm dan lampu halogen kuartz atau lampu tungsten untuk daerah visible dari 350 sampai 900 nm. Monokromator :digunakan untuk menghamburkan cahaya kedalam panjang gelombang unsur-unsurnya, yang diseleksi lebih lanjut dengan celah. Monokromator berotasi sehingga rentang panjang gelombang dilewatkan melalui sampel ketika insrument tersebut memindai sepanjang spektrum. Optik : dirancang untuk memisahkan berkas cahaya sehingga berkas tersebut melewati dua kompartemen sampel, dan pada instrument

berkas rangkap tersebut, larutan blangko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk memperbaiki pembacaan atau spektrum samplel tersebut. Blangko umumnya adalah pelarut yang dapat melarutkan sampel. Langkah-langkah analisa : contohnya dalam uji disolusi obat Sampel obat di larutkan dalam pelarutnya, kemudian diambil 1,0 mL kemudian di encerkan hingga 10 mL, Kalibrasi instument seperti, kalibrasi skala absorbans, dan kalibrasi skala panjang gelombang, Sampel dimasukkan kedalam.. kemudian sesuaikan panjang gelombang zat aktif pada sampel yg lihat dari Farmakope, Tekan tombol.. maka akan muncul nilai absorbansi dari sampel tersebut dilayar alat spektroskopi UV/Visible 2. Spektroskopi Inframerah Prinsip : Rentang radiasi elektromagnetik yang berkisar antara 400 cm1 -1 dan 4000 cm (2500 dan 20000 nm) dilewatkan pada suatu sampel dan diserap oleh ikatan-ikatan molekul didalam sampel sehingga molekul tersebut meregang atau menekuk. Panjang gelombang radiasi yang diserap merupakan ciri khas ikatan yang menyerapnya. Penerapan : Sidik jari kualitatif memeriksa identitas bahan baku yang digunakan di pabrik dan untuk mengidentifikasi obat. Digunakan dalam kimia sintetik sebagai pemerikasaan pendahuluan identitas senyawa, terutama untuk memeriksa ada tidaknya gugus karbonil, yang sulit diperiksa dengan metode lain. Dapat digunakan untuk mengarakterisasi sampel-sampel dalam keadaan padat dan setengah padat seperti krim dan tablet. Digunakan sebagai uji sidik jari unruk selaput tipis, penyalutan, dan plastik pengemas. Dapat digunakan untuk mendeteksi polimorf obat-obat (polimorf adalah bentukbentuk kristal molekul yang berbeda dan memiliki sifat-sifat fisik yang berbeda seperti kelarutan dan titik lebur, yang mungkin penting dalam proses manufaktur dan ketersediaan hayati). Instrumentasi : Dua jenis instrument yang biasa digunakan intuk memperoleh spektrum Inframerah (IM), yaitu : Instrumen Dispersif : menggunakan suatu monokromator untuk memilih masing-masing bilangan gelombang secara berurutan untuk memantau intensitasnya setelah radiasi telah melewati sampel. Instrument transformasi Fourier : menggunakan interferometer yang menghasilkan sumber radiasi dengan masing-masing bilangan gelombang dapat dipantau dalam 1 detik pulsa radiasi tanpa memerlukan dispersi.

Langkah-langkah dalam analisa : (lihat gambar 5.3) penyusun optik yang sebenarnya jauh lebih rumit dari pada diagram ini, tetapi diagram tersebut menunjukan bagian-bagian komponen penting untuk suatu instrument IM Dispersif. Filamen yang digunakan terbuat dari oksida logam, seperti oksida zirkonium, itrium, torium, dan dipanaskan untuk memancarkan cahaya di udara. Sampel diletakkan didalam cakram atau sel yang terbuat dari halida logam alkali. Jika cahaya telah melewati sampel, cahaya tersebut didispersikan sehingga satu bilangan gelombang atau sedikit bilangan gelombang dapat dipantau secara berurutan dengan detektor yang melintasi rentang spektrum tersebut. Dalam suatu instrument IM transformasi Fourier (Fourier Transform Infrared, FTIR), prinsipnya sama kecuali bahwa monokromator digantikan oleh suatu interferometer, yang menggunakan cermin bergerak untuk memindahkan bagian radiasi yang dihasilkan oleh suatu sumber (gmbr 5.4).Kentungan teknik ini adalah bahwa seluruh hasil pindai spektrum dapat diperoleh dalam waktu 1 detik, dibandingkan 2-3 menit yang diperlukan agar suatu instrument Dispersif mendapatkan satu spektrum. Selain itu karna instrument terbut telah dihubungkan pada komputer, beberapa hasil pindai spektrum dapat diambil dan dihitung rata-ratanya untuk memperbaiki rasio sinyal derau untuk spektrum tersebut. Analisis Inframerah-dekat (Near-infrared analysis, NIRA) o Prinsip : radiasi elektromagnetik antara 1000 dan 2500 nm diserap secara lemah oleh ikatan-ikatan X-H molekul-molekul, menyebabkan ikatan tersebut meregang. Panjang gelombang radiasi yang diserap tersebut ditandai oleh ikatan yang menyerapnya. 3. Spektrofotometri Atom Spektrofotometri Emisi Atom (SEA) a. Prinsip : Atom-atom secara termal tereksitasi sehingga atom tersebut memancarkan cahaya dan radiasi yang dipancarkan dapat diukur. b. Penerapan : Kuantifikasi logam alkali dalam: garam-garam, infus, dan larutan dialisis logam alkali. Penentuan pengotor logam di dalam beberapa garam anorganik lain yang digunakan dalam penyiapan larutan ini. c. Instrumentasi : Suatu Spektrofotometer Emisi Atom (gmbr 6.2) terdiri atas beberapa komponen-komponen berikut ini : i. Nyala. Sampel yang mengandung logam diuapkan dalam suatu nyala udara dipadatkan/gas alam pada 2000o C. Suhu yang lebih tinggi (2500o C) dapat dicapai dengan menggunakan udara/asetilen dan dibutuhkan untuk analisis Mg dengan menggunakan SEA

ii.

iii.

Monokromator / Filter. Radiasi yang dipancarkan oleh atom-atom tereksitasi dilewatkan melalui suatu filter, atau suatu monokromator di dalam instrumen yang lebih mahal. Jadi, suatu pita sempit radiasi yang dipancarkan dipilih dan manginterferensi sumber-sumber radiasi seperti nyala, sedangkan komponen-komponen lain di dalam sampel ditapis. Detektor. Intensitas radiasi yang dipilih kemudian diukur dengan menggunakan suatu sel fotosensitif.

d. Langkah-langkah analisa : Agar dapat mengukur sampel dengan Spektrofotometer Emisi Atom (SEA), suatu kurva kalibrasi dibuat dengan menyedot larutan-larutan yang konsentrasinya diketahui ke dalam nyala tersebut. Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) a. Prinsip : Atom-atom suatu logam diuapkan dalam suatu nyala dan serapannya pada suatu pita radiasi sempit yang dihasilkan oleh suatu lampu katode rongga, dilapisi dengan logam tertentu, yang sedang ditentukan, diukur. b. Penerapan : Penentuan residu-residu logam yang tersisa dari proses pembuatan obat-obatan. c. Instrumentasi : Suatu Spektrofotometer Serapan Atom (gmbr6.5) terdiri atas beberapa komponen-komponen berikut ini : i. Sumber cahaya. Lampu katoda berongga yang dilapisi dengan unsur yang sedang dianalisis. ii. Nyala. Nyala biasanya berupa udara/asetilen, menghasilkan suhu 2500 o C. Dinitrogen oksida/asetilen dapat digunakan untuk menghasilkan suhu sampai 3000o C, yang diperlukan untuk menguapkan garam-garam dari unsur-unsur seperti aluminium atau kalsium. iii. Monokromator. Monokromator digunakan untuk menyempitkan lebar pita radiasi yang sedang diperiksa sehingga diatur untuk memantau panjang gelombang yang sedang dipancarkan oleh lampu katode berongga. Ini akan menghasilkan interferensi oleh radiasi yang dipancarkan dari nyala tersebut, dari gas pengisi di dalam lampu katode rongga, dan dari unsur-unsur lain di dalam sampel tersebut. iv. Detektor. Detektor berupa sel fotosensitif. d. Langkah-langkah analisa : Spektrofotometer Serapan Atom (SSA) terutama digunakan dalam uji batas untuk logam-logam di dalam obat sebelum dimasukkan dalam formulasi. Sampel biasanya dilarutkan dalam asam nitrat 0,1 M untuk menghindari pembentukan hidroksida logam dari logam berat, yang relatif non-volatil dan menekan hasil pembacaan SSA. 4. Spektroskopi Emisi Molekul Spektrofotometri Fluoresensi

a. Prinsip : Molekul-molekul tertentu, terutama yang memiliki kromofor dan struktur kaku, dapat tereksitasi oleh radiasi UV/Visible, dan kemudian akan memancarakan radiasi yang diserap oleh panjang gelombang yang lebih panjang. Radiasi yang dipancarkan selanjutnya dapat diukur. b. Penerapan : Penentuan obat-obat berfluoresensi dalam formulasi dosis-randah dengan adanya eksipient takberfluoresensi. Dalam melakukan uji batas dengan pengotor berfluoresensi atau dapat dijadikan berfluoresensi dengan mudah. Bermanfaat untuk mempelajari pengikatan obat-obat pada komponen-komponen di dalam formulasi kompleks. Banyak digunakan dalam analisis hayati untuk mengukur obat-obat dalam jumlah sedikit dan untuk mempelajari ikatan obat-protein. c. Instrumentasi : lihat diagram (gbr. 7.2) Cahaya yang sedang dipancarkan diamati pada sudut-sudut yang tepat pada cahaya yang sedang digunakan untuk mengeksitasi sampel. Instrument ini memiliki dua monokromator: satu untuk memilih panjang gelombang yang akan digunakan untuk eksitasi sampel, dan satu lagi untuk memindai rentang panjang gelombang cahaya yang dipancarkan oleh sampel. Lampu yang digunakan, yang berupa lampu halogen kuarsa atau xenon, yang menghasilkan radiasi yang berintensitas tinggi untuk memanfaatkan keuntungan dari fakta bahwa kekuatan fluoresensi tersebut berkaitan dengan jumlah foton yang akan diserap dikalikan dengan kuantum fluoresensi yang dihasilkan (). Untuk senyawa berfluoresensi kuat, mendekati 1; untuk senyawa takberfluoresensi, = 0. Beberapa radiasi pengeksitasi dapat dideteksi dengan detektor emisi karena radiasi yang dihamburkan oleh molekul-molekul pelarut (prinsip hamburan Rayleigh) atau oleh partikel koloidal di dalam larutan (prinsip hambutan Tyndall). Adanya hamburan ini membuat penggunaan monokromator kedua tersebut menjadi penting dan juga berarti bahwa, agar pengukuran fluoresensi dapat dilakukan tanpa interferensi, pita fluoresensi harus digeser paling sedikit 20 nm diatas pita eksitasi. d. Langkah-langkah analisa : Spektroskopi Raman a. Prinsip : Efek Raman analog dengan fluoresensi kecuali efek tersebut tidak bergantung pada panjang gelombang dan tidak mensyaratkan molekul tersebut memiliki suatu kromofor. Pergeseran energi dalam cm-1 akibat penghamburan nonelastik radiasi laser yang diukur, bukan panjang gelombang. Pergeseran yang diukur berkaitan dengan bilangan gelombang pita-pita yang ada pada spektrum IM-tengah molekul tersebut. b. Penerapan : Memiliki potensi untuk mengidentifikasi sampel yang kompleks, misalnya obat-obat dalam formulasi dan dalam kemasan.

Sampel-sampel seperti bahan-bahan farmasi peptida dapat dianalisis perubahannya didalam struktur tiga dimensinya. Memberikan informasi identits sidik jari tambahan yang melengkapi spektroskopi Inframerah-tengah.

c. Instrumentasi : (lihat gbr. 7.9) geometri suatu spektrometer raman analog dengan geometri suatu instrument fluoresensi. Laser digunakan untuk menghasilkan radiasi berintensitas tinggi dalam daerah visible, biasanya di suatu tempat antara 450 nm dan 800 nm. Laser mengasilkan beberapa garis emisi dan, dalam hal suatu molekul yang berfluoresensi, satu garis dapat dipilih yang mengahasilkan hamburan Raman dan fluoresensi tidak menggangu pengukuran. 5. Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti a. Prinsip : radiasi pada daerah frekwensi radio yang digunakan untuk mengeksitasi atom-atom, biasanya proton-proton atau atom-atom karbon-13, sehingga spinnya berubah dari sejajar menjadi sejajar-melawan medan magnet yang digunakan. Rentan frekuensi yang dibutuhkan untuk eksitasi dan pola-pola pembagian kompleks yang dihasilkan sangat khas pada struktur kimia molekul tersebut. b. Penerapan : Suatu teknik yang sangat kuat untuk karakterisasi strukture yang tepat pada bahan baku dan produk jadi Dapat menetukan pengotor, termasuk pengotor enantiomerik, tanpa pemisahan, sampai lebih kurang 10% kadar Sangat potensial pada penentuan sidik jadi campuran Memiliki potensi yang baik untuk analisis kuntitatif obat-obatan dalam formulasi tanpa perlu melakukan pemisahan sebelumnya. c. Instrumentasi : gbr. 8.3 memberikan tata ruang dasar pada suatu spektrometer RMI gelombang kontinue. Instrument ini adalah tipe asli instrument tersebut dan telah banyak digantikan oleh instrumen transformasi Fourier. Sampel diletakkan didalam tabung RMI kaca sempit dan diputarkan dalam medan magnet tetap pada lebih kurang 30 revolusi/menit dengan menggunakan alat turbin udara sehingga memastikan keseragaman medan magnet yang melewati sampel tersebut dengan arah horizontal. Sampel dianalisis dalam larutan dalam suatu pelarut terdeuterasi untuk memastikan tidak ada interferensi dengan sinyal dari proton sampel oleh proton pelarut dalam jumlah yang jauh lebih banyak. 6. Spektrometri Massa a. Prinsip : molekul bermuatan atau fragmen molekul dihasilkan dalam suatu ruang sangat hampa, atau segera sebelum suatu sampel memasuki ruang sangat hampa, dengan menggunakan berbagai metode untuk produksi ion. Ionion dihasilkan dalam fase gas sehingga ion tersebut kemudian dapat

dimanipulasi dengan penerapan pada medan magnet atau medan listrik agar dapat menentukan bobot molekulnya.

b. Penerapan : Spekrtometri massa memberikan suatu metode yang sangat penting untuk menentukan atau memastikan identitas atau struktur obat dan bahan baku yang digunakan dalam pembuatannya. Spektrometri massa bersama kromatografi gas (KG-SM) ataupun kromatografi cair (KC-SM) memberikan suatu metode untuk mengarakterisasi pengotor dalam obat dan eksipien formulasi. KG-SM dan KC-SM memberikan metode yang spesifik dan sangat peka untuk menentukan obat-obat dan metabolitnya di dalam cairan biologis dan jaringan. Spektrometri massa telah menjadi suatu alat yang penting dalam proteomik, yang menjadi alat utama dalam penemuan obat. c. Instumentasi : suatu gambaran skematik spektrometer massa magnetik diperlihatkan dalam gbr.9.1 i. Sampel dimasukkan ke dalam sumber instrument dengan memanaskannya pada akhir suatu sensor sampai menguap airnya, dibantu dengan keadaan sangat hampa di dalam instument tersebut. ii. Jika berada dalam fase uap, analit dibombardir dengan elektron-elektron yang dihasilkan oleh filamen rhenium atau tungsten, yang diakselerasi menuju suatu target positif dengan energi sebesar 70 eV. Analit tersebut dimasukksan antara filamen dan target, dan elektron tersebut menyebabkan ionisasi sebagai berikut : M + e M+ iii. Karena elektron-elektron yang digunakan memiliki energi yang lebih jauh lebih tinggi daripada kekuatan ikatan di dalam analit tersebut (4-7 eV), fragmentasi ekstensif analit tersebut biasanya terjadi. iv. Dua jenis sistem yang biasanya digunakan untuk memisahkan ion-ion berdasarkan perbandingan muatan terhadap massanya.