INTRODUCCION

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar el colorante. En el presente informe se desarrollarn los mtodos de coloracin simple y diferencial, as como la tincin cido resistente dndose a conocer los resultados obtenidos en la prctica.

PRACTICA N 04 METODOS DE COLORACION

1. Objetivos: Realizar coloraciones ms utilizadas en el laboratorio de microbiologa a partir de materiales biolgicos y explicar sus fundamentos. Reconocer a travs de la observacin microscpica la existencia de microorganismos en diversos materiales biolgicos. Conocer el mecanismo bsico y ventajas de una tincin. Aprender conceptos bsicos relacionados a: Proceso de preparacin de un frotis Tincin Gram Tincin cido-Resistente Tincin de Esporas Tincin de Cpsula (negativa). Identificar caractersticas en las bacterias en estudio en base a las diferentes tinciones.

2. Marco terico Coloracin simple Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina). Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo 6 que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composicin qumica, de modo que se tien selectivamente

con ciertos colorantes. Ej; tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizarse uno o ms colorantes.

Coloracin de Gram Esta tincin fue desarrollada por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realizan para cualquier identificacin bacteriana. El distinto comportamiento en la tincin Gram es debido a la distinta composicin de la pared de las clulas bacterianas. Gram (+) se tien de violeta. Mono estratificada. Esta formada por una gruesa capa, amorfa y densa de mucopolisacridos (murena, etc.). Esta densa capa evita la extraccin del complejo cristal-violeta-yodo por el disolvente (alcohol o acetona) Gram (-) pared multiestratificada de mayor complejidad. Se tien de rosa con el colorante de contraste (safranina). Esta formada por una capa de murena ms delgada (tan slo un 10 % de la estructura) y encima de ella una capa de lpidos y glucolpidos. La decoloracin con alcohol incrementa la porosidad por arrastre de lpidos, aumentando la tincin diferencial.

Coloracin de cido - resistencia Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lpidos y en cidos miclicos y que no pueden ser calificadas por la tincin de Gram. Esta tincin demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teidas de resistir a la decoloracin por cidos y alcoholes. Esta propiedad se correlaciona con el alto contenido de componentes lipoideos y creos de su envoltura celular, que confiere un ambiente muy hidrfobo, de tal forma que este tipo de bacterias presentarn grandes dificultades a la hora de teirse con los colorantes convencionales que no pueden penetrar en el interior de las bacterias. De ah que se necesiten, para este tipo de tinciones, colorantes altamente concentrados as como la presencia de calor que facilite su penetracin al interior de dichas bacterias; de tal forma que, siguiendo tales instrucciones, una vez que dichas bacterias han quedado teidas, su decoloracin posterior no es posible, resistiendo incluso a decoloraciones cido-alcohlicas. Dicha tincin se emplea principalmente para el diagnstico y estudio de enfermedades producidas por bacterias cido resistentes, como son la tuberculosis y la lepra.

COLORACION DE ESPORAS: La esporognesis y la germinacin no son medios de reproduccin, son mecanismos de supervivencia de la clula. La composicin qumica de la bacteria la hace resistente a: Calor extremo o excesivo Congelacin Radiacin Desecacin Agentes qumicos

COLORACION NEGATIVA: Con la tincin negativa, conoceremos la morfologa de los microorganismos, realizando una coloracin de fondo, sin que se coloreen las bacterias o las estructuras que se tratan de observar. Este procedimiento se aplica para observar la forma de todos los microorganismos presentes en una muestra La pared celular de las bacterias tiene una ligera carga negativa, por eso utilizamos colorantes bsicos que se adhieran a su pared y as poder observarlos, pero en el caso de la tincin negativa, utilizamos un colorante cido (Tinta china o Nigrosina), de forma que las bacterias repelen el colorante en vez de absorberlo, y por tanto veremos todo el campo teido y veremos las bacterias como zonas brillantes en las cuales no penetr el colorante.

MATERIALES: Cultivos bacterianos: Cultivo de Escherichia coli

Cultivo de staphylococcus aureus

Lamina fijada con frotis de Mycobacterium tuberculosis

1. Coloracin simple: - azul de metileno

2. Coloracin gram: - violeta de gensiana (colorante primario)

- lugol (mordiente)

- alcohol-acetona(decolorante)

- fucsina bsica (colorante de contraste)

3. Materiales: - asa bacteriana

mechero

portaobjetos

piceta

Microscopio

4 muestras bacterianas

Solucin cristal-violeta

Solucin acetona alcohol

- Solucin de safranina

- Solucin de iodo

- Solucin acetona- alcohol

Aceite de inmersion