Anda di halaman 1dari 15

ENZIMENZIM dandan KOENZIMKOENZIM--11

ENZIM ENZIM dan dan KOENZIM KOENZIM - - 1 1 I NYOMAN SUARSANA LOGO LABORATORIUM BIOKIMIA

I NYOMAN SUARSANA

LOGO

LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS KEDOKERAN HEWAN

LOGO LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS KEDOKERAN HEWAN 1

1

Tujuan pembelajaran Mengetahui klasifikasi, dan tata nama enzim Mengetahui mekanisme dan dasar kerja enzim
Tujuan pembelajaran
Mengetahui klasifikasi, dan tata nama
enzim
Mengetahui mekanisme dan dasar
kerja enzim
Mengetahui
faktor-faktor yang
mempengaruhi kerja enzim
Mengetahui hambatan kerja enzim
Mengetahui peran enzim dalam
diagnosis penyakit
3 Company Logo
TOPIK Pendahuluan Klasifikasi enzim Dasar dan Mekanisme kerja enzim Kinetika Reaksi Enzimatis Faktor yang
TOPIK
Pendahuluan
Klasifikasi enzim
Dasar dan Mekanisme kerja enzim
Kinetika Reaksi Enzimatis
Faktor yang mempengaruhi reaksi enzimatis
Regulasi aktivitas enzim
Kofaktor: koenzim, apoenzim, proenzim
Fungsi Biomedis Enzim
2
Company Logo
PENDAHULUAN 1. Sel sebagai reaktor kimia 2. Distribusi enzim dan struktur sel 3. Enzim ekstrasel
PENDAHULUAN
1. Sel sebagai reaktor kimia
2. Distribusi enzim dan struktur sel
3. Enzim ekstrasel dan intrasel
4. Perkembangan pengetahuan tentang
enzim
5. Enzim dan penyakit
4 Company Logo
Sel sebagai reaktor kimia Eukariotik Prokariotik 5 Company Logo
Sel sebagai reaktor kimia
Eukariotik
Prokariotik
5 Company Logo
Distribusi enzim dan struktur sel Sel menjalankan ratusan bahkan ribuan macam reaksi sekaligus Dengan teknik
Distribusi enzim dan struktur sel
Sel menjalankan ratusan bahkan ribuan
macam reaksi sekaligus
Dengan teknik histokimia, sitokima,
fraksinasi sel: diketahui distribusi dan
lokasi berbagai enzim dalam sel.
Mitokondria: enzim yang berhubungan
dengan reaksi oksidasi-reduksi
• Siklus Krebs
• Oksidasi lemak
• Katabolisme asam amino
• Fosforilasi oksidatif
• Transport elektron
7 Company Logo
Sel sebagai reaktor kimia Sel makhluk hidup dengan ukuran sangat kecil dipandang sebagai reaktor kimia
Sel sebagai reaktor kimia
Sel makhluk hidup dengan ukuran sangat
kecil dipandang sebagai reaktor kimia
Sel pusat metabolisme energi
Dalam sel reaksi berjalan tidak secara acak,
tetapi sangat terarah
Dalam sel terdapat suatu mekanisme dengan
berbagai subsistem yang bekerja secara KHAS
(SPESIFIK) yang memungkinkan makhluk hidup
menghasilkan senyawa (produk) dengan
berbagai tingkat kerumitan struktur molekul
6 Company Logo
Lisosom: enzim yang mengkatalis reaksi hidrolisis (ribonuklease, asam foafatase) Inti sel: enzim yang berperan dalam
Lisosom: enzim yang mengkatalis reaksi
hidrolisis (ribonuklease, asam foafatase)
Inti sel: enzim yang berperan dalam
biosintesis asam nukleat (DNA, RNA)
Sitoplasma: enzim glikolisis, glukonegenesis,
sintesis asam lemak,
Ribosom: enzim biosintesis protein
Retikulum endoplasma: enzim sintesis lipid,
sintesis steroid
Membran plasma: enzim ATPase (sistem
tranpor bergantung energi), transpor Na + , K +
8 Company Logo
Enzim ekstrasel dan intrasel Sel dipandang sebagai reaktor kimia, maka enzim berada dan bekerja menjalankan
Enzim ekstrasel dan intrasel
Sel dipandang sebagai reaktor kimia, maka
enzim berada dan bekerja menjalankan
fungsinya di dalam sel
Kesalah pahaman: dengan menganggap enzim
terdapat dan bekerja diluar sel dan pada
umumnya yang dimaksud adalah enzim plasma
Keperluan diagnosis: diukur enzim plasma,
serum.
Enzim ekstrasel
Penelitian: enzim-enzim pencernaan
Yang pasti enzim ekstrasel dan intrasel:
keduanya disintesis oleh sel di dalam sel
9 Company Logo
Enzim berperan dalam proses pencernaan Réumur (1963-1727) Perancis: • melakukan percobaan pemberian daging yang
Enzim berperan dalam proses pencernaan
Réumur (1963-1727) Perancis:
• melakukan percobaan pemberian daging yang dimasukan
dalam bola-bola kecil pada burung elang.
Spallanzani (1729-1799) Itali:
• melakukan percobaan pemberian daging yang dimasukan
dalam tabung kayu yang dilapisi kain
• Pengambilan cairan lambung, dan dicobakan ternyata dapat
melumatkan daging
William Beaumont (1785-1853) AS:
• Melaporkan secara rinci proses pencernaan pada lambung
manusia yang intinya sama dengan yang diamati pada
burung elang
• Pengamatan dilakukan pada lambung manusia penjelajah
Alexis St. Martin, yang mengalami luka terbuka pada
perutnya
11 Company Logo
Perkembangn Pengetahuan tentang enzim Manusia telah lama mengenal enzim: dalam bentuk pengetahuan praktis empiris dan
Perkembangn Pengetahuan tentang
enzim
Manusia telah lama mengenal enzim: dalam
bentuk pengetahuan praktis empiris dan
disebarkan secara tradisional
Mengolah bahan makanan dengan enzim
Kebiasaan membuat minuman yang diragikan
Pengolahan susu menjadi: yoghurt, koumis,
kefir, keju dll.
Pembuatana tape, tempe
10 Company Logo
Karakteristik dan sifat kimia dari enzim Awalnya diantara peneliti enzim, menggolongkan bahan ini kedalam PROTEIN
Karakteristik dan sifat kimia dari enzim
Awalnya diantara peneliti enzim,
menggolongkan bahan ini kedalam PROTEIN
ditentang keras.
Pekelharing dan Ringer (1900):
• Banyak kesamaan antara enzim dan protein
(protein getah lambung dengan pepsin mempunyai
sifat-sifat sama)
Summer (1926)
• Kristal, sifat fisikokimia enzim urease sama dengan
protein
12 Company Logo
Kunitz,Herriots, Anson dan Northrop (1931): • Berhasil mengkristalkan pepsin yang sama dengan peneliti Summer. •
Kunitz,Herriots, Anson dan Northrop (1931):
• Berhasil mengkristalkan pepsin yang sama
dengan peneliti Summer.
• Enzim adalah PROTEIN, telah diterima secara
luas dan tidak ada lagi pertanyaan
Emil Fischer (1894):
• Sudah meneliti spesifisitas kerja enzim (meskipun
sifat kimia enzim sbg protein belum diakuai). Hasil
gagasanya dikenal sebagai: MODEL KUNCI DAN
ANAK KUNCI (Lock and Key)
Michaelis dan Menten (1913)
• Pengetahuan tentang kinetika reaksi enzimatik:
yang dikenal dengan persamaan Michaelis-
Menten
13 Company Logo
KLASIFIKASI ENZIM Penggolongan dan tata nama enzim 1.Tata nama berdasarkan substrat ▪Jika dikatalis adalah glukosa:
KLASIFIKASI ENZIM
Penggolongan dan tata nama enzim
1.Tata nama berdasarkan substrat
▪Jika dikatalis adalah glukosa: enzim glukase
2.Tata nama berdasarkan jenis ikatan kimia substrat
▪ Jika dikatalis ikatan peptida: enzim peptidase
▪ Jika dikatalis ikatan ester: enzim esterease
▪ Jika dikatalis ikatan nukleotida: enzim nukleotidase
3.Tata nama berdasarkan jenis reaksi
▪ Untuk mengoksidasi glukosa: enzim glukosa oksidase
▪ Enzim yang mengkatalis pemindah gugus dinamai :
tranferase, contoh untuk memindahkan gugus NH2: enzim
lebih khas dinamai: enzim amino transferase
15 Company Logo
Enzim dan Penyakit Kalangan kedokteran dan kedokteran hewan: memanfaatkan pengetahuan enzim untuk tujuan DIAGNOSIS dan
Enzim dan Penyakit
Kalangan kedokteran dan kedokteran
hewan: memanfaatkan pengetahuan
enzim untuk tujuan DIAGNOSIS dan
PENGOBATAN
Wolgemuth (1908):
• Enzim amilase dalam urine, meningkat jumlahnya
pada radang pankreas
Kay, Kings, Bodansky dan Roberts (1920-
930):
• Enzim fosfatase alkali, penyakit hati
LaDue, Wroblewski dan Karmen (1955):
• Enzim SGOT
14 Company Logo
There are six functional classes of enzymes 16 Company Logo
There are six functional classes of enzymes
16 Company Logo
Komisi International Union of Bhiocemistry (IUB), mengklasifikasikan enzim menjadi 6 kelas, didasarkan pada reaksi
Komisi International Union of Bhiocemistry
(IUB), mengklasifikasikan enzim menjadi 6
kelas, didasarkan pada reaksi biokimia yang
dikatalisnya:
1. Oksidoreduktase: mengkatalis reaksi
oksidasi-reduksi
Yang termasuk enzim ini dengan nama
trivial:
-dehidrogenase -reduktase
-oksidase -hidroksilase
-peroksidase -oksigenase
17 Company Logo
Yang termasuk enzim transferase: a. amino transferase b. asil karnitin transferase c. transkarboksilase d.
Yang termasuk enzim transferase:
a. amino transferase
b. asil karnitin transferase
c. transkarboksilase
d. transaldolase dan transketolase
e. glukokinase
f. piruvatkinase
19 Company Logo
2.Transferase: mengkatalis pemindahan suatu gugus yang bukan H antara substrat dengan senyawa penerima gugus, seperti:
2.Transferase: mengkatalis pemindahan suatu
gugus yang bukan H antara substrat dengan
senyawa penerima gugus, seperti:
-gugus beratom C 1
-gugus aldehid dan keton
-gugus asil
-gugus alkil
-gugus nitrogen
-gugus mengandung fosfat
-gugus mengandung sulfur
18 Company Logo
3. Hidrolase: mengkatalis reaksi hidrolisis yaitu pemutusan ikatan kovalen antara karbon dengan atom lainnya dengan
3. Hidrolase: mengkatalis reaksi hidrolisis yaitu
pemutusan ikatan kovalen antara karbon
dengan atom lainnya dengan penambahan
air.
Yang termasuk enzim ini:
a. esterase
b. amidase
c. peptidase
d. fosfatase
e. glikosidase
20 Company Logo
4. Liase: mengkatalis reaksi pemecahan karbon-karbon, karbon-sulfur, dan karbon- nitrogen Yang termasuk enzim ini: a.
4. Liase: mengkatalis reaksi pemecahan
karbon-karbon, karbon-sulfur, dan karbon-
nitrogen
Yang termasuk enzim ini:
a. dekarboksilase
b. aldolase
c. sintase
d. hidrase atau dehidratase
e. deaminase
f. nukleotida siklase
21 Company Logo
6. Ligase: mengkatalis pembentukan ikatan antara C-C, C-S, C-N dan C-O. Reaksi ini perlu energi
6. Ligase: mengkatalis pembentukan ikatan
antara C-C, C-S, C-N dan C-O. Reaksi ini
perlu energi ATP
Yang termasuk enzim ini:
a. sintetase
b.karboksilase
23 Company Logo
5. Isomerase: mengkatalis reaksi isomer, baik isomer optik, geometrik maupun isomer posisi. Yang termasuk enzim
5. Isomerase: mengkatalis reaksi isomer, baik
isomer optik, geometrik maupun isomer
posisi.
Yang termasuk enzim ini:
a. epimerase
b. rasemase
c. mutase
d. isomerase
22 Company Logo
DASAR DAN MEKANISME KERJA ENZIM Enzim sebagai protein katalis Dixon dan Webb, mendefinisikan enzim sebagai
DASAR DAN MEKANISME KERJA ENZIM
Enzim sebagai protein katalis
Dixon dan Webb, mendefinisikan enzim
sebagai suatu protein bersifat katalis. Definisi
ini disebabkan oleh kemampuannya untuk
mengaktifkan senyawa lain secara spesifik.
Definisi lain: enzim adalah suatu katalisator
protein yang mempercepat reaksi kimia dalam
sistem biologis.
24 Company Logo
Kata kunci definisi enzim: 1. Aktif 2. Katalis 3. Protein 4. Spesifik Penjelasan: Protein: semua
Kata kunci definisi enzim:
1. Aktif
2. Katalis
3. Protein
4. Spesifik
Penjelasan:
Protein: semua enzim memiliki ciri dan sifat protein
Katalis: selain mempunyai kemampuan mengubah
suatu senyawa, juga kemampuan membawa atau
memindahkan suatu senyawa dari suatu keadaan ke
keadaan lain dengan cara yang sesifik
25 Company Logo
Aktif: mengingat demikian spesifik interaksi antara substrat dan enzim, maka bagian tersebut dinamai sebagai situs
Aktif: mengingat demikian spesifik interaksi
antara substrat dan enzim, maka bagian
tersebut dinamai sebagai situs aktif (active
site) atau lebih tepat lagi situs katalitik
(catalytic site)
Pertanyaanya: apakah ada senyawa spesifik
yang dikenali oleh enzim tetapi tidak dapat
diolah lebih lanjut sehingga senyawa tersebut
tidak mengalami perubahan? [INHIBITOR]
Substrat atau inbitor: dapat menempati situs
aktif enzim
27 Company Logo
Interaksi yang spesifik dari enzim dengan suatu molekul tertentu dan menyebabkan pengaktifan molekul tersebut
Interaksi yang spesifik dari enzim dengan
suatu molekul tertentu dan menyebabkan
pengaktifan molekul tersebut selanjutnya
mengakibatkan perubahan struktur sehingga
menimbulkan gagasan akan substrat.
Substrat didefinisikan sebagai senyawa yang
dikenali secara spesifik oleh enzim dan
selanjutnya diaktifkan sehingga mengalami
perubahan kimia
26 Company Logo
Chymotrypsin Has A Site for Specificity O O N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C R H R’ O -
Chymotrypsin Has A Site for Specificity
O
O
N–C–C–N–C–C
N–C–C–N–C–C
R
H
R’
O -
C
Ser
Specificity Specificity
Catalytic
Site
Site Site
ActiveActive SiteSite
28
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Specificity of Ser-Protease Family Trypsin Chymotrypsin Elastase cut at Lys, Arg cut at Trp, Phe,
Specificity of Ser-Protease Family
Trypsin
Chymotrypsin
Elastase
cut at Lys, Arg
cut at Trp, Phe, Tyr
cut at Ala, Gly
O
O
O
O
O
O
–C–N–C–C–N–
–C–N–C–C–N–
–C–N–C–C–N–
C
C
CH 3
C
C
C
Shallow and
non-polar
NH 3
+
pocket
COO
COO
- -
Non-polar
pocket
C
C
Asp
Asp
Active Site
29
Company Logo
Deep
and negatively
charged
pocket
Juang RH (2004) BCbasics
Lock and Key Analogy: lock = enzyme, key = substrate. 31 Company Logo
Lock and Key Analogy:
lock = enzyme, key = substrate.
31 Company Logo
Karena enzim adalah protein maka kemampuan mengkatalis suatu reaksi erat hubungannya dengan struktur molekul protein
Karena enzim adalah protein maka kemampuan
mengkatalis suatu reaksi erat hubungannya
dengan struktur molekul protein tersebut
1. Tempat aktif
Teori Interaksi antara enzim-
substrat dikenal sebagai Lock
and Key
Pada teori ini, substrat yang
spesifik terikat pada daerah
spesifik di molekul enzim.
Daerah ini disebut: TEMPAT
AKTIF, yaitu suatu tempat
yang terdapat dalam enzim
yang secara spesifik dapat
mengenali dan mengikat
substrat
30 Company Logo
MODEL KUNCI dan ANAK KUNCI (LOCK-and KEY MODEL) KERJA ENZIM: Tempat aktif mempunyai bentuk yang
MODEL KUNCI dan ANAK KUNCI (LOCK-and KEY MODEL)
KERJA ENZIM:
Tempat aktif mempunyai bentuk yang rigid
Hanya substrat yang spesifik yang matching dengan
tempat aktif
Substrat sebagai anak kunci (KEY) yang matching
dengan enzim sebagai kunci (LOCK)
32 Company Logo
Tempat aktif suatu enzim dibentuk oleh residu asam amino yang mempunyai 2 fungsi: 1.Menarik dan
Tempat aktif suatu enzim dibentuk oleh residu
asam amino yang mempunyai 2 fungsi:
1.Menarik dan mengorientasikan substrat kepada
gugus spesifik pada molekul substrat yang disebut
GUGUS KONTAK dengan cara yang spesifik pula
2.Ikut membentuk ikatan sementara dengan molekul
substrat, yang selanjutnya terjadi polarisasi dan
terjadi regangan pada ikatan di dalam molekul
substrat sehingga mudah dipecah dan
menghasilkan PRODUK.
asam amino yang bertindak demikian yang terletak
pada tempat aktif disebut: RESIDU KATALIK
33 Company Logo
Active Site Stabilizes Transition State Gly 193 Catalytic Triad Ser 195 Asp 194 Met 192
Active Site Stabilizes Transition State
Gly 193
Catalytic Triad
Ser 195
Asp 194
Met 192
His 57
Active Site
Cys 191
Asp 102
Thr 219
Cys 220
Specificity Site
Ser 214
Trp 215
Gly 216
Ser 218
Ser 217
35
Company Logo
Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes, p.197
H O C Ser C–O - H–N N H–O–CH 2 195 C C Asp 102
H
O
C
Ser
C–O -
H–N
N
H–O–CH 2
195
C
C
Asp 102
H
CH 2
His 57
Charge Relay in Active Site
H
Active Ser
O
C
Ser
C–O–H
N
N–H
- O–CH 2
195
C
C
Asp 102
H
CH 2
His 57
34
Company Logo
=
=
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158
Pada umumnya terdapat 2 mekanisme kerja enzim mempengaruhi reaksi katalisis 1.enzim meningkatkan kemungkinan molekul-
Pada umumnya terdapat 2 mekanisme
kerja enzim mempengaruhi reaksi katalisis
1.enzim meningkatkan kemungkinan molekul-
molekul yang bereaksi saling bertemu dengan
permukaan yang saling berorientasi.
Hal ini terjadi karena enzim mempunyai
afinitas yang tinggi terhadap substrat dan
kemampuan mengikatnya walaupun
sementara
36 Company Logo
2. Pembentukan ikatan yang sementara (non kovalen) antara substrat dengan enzim menimbulkan penyebaran elektron dalam
2. Pembentukan ikatan yang sementara (non
kovalen) antara substrat dengan enzim
menimbulkan penyebaran elektron dalam
molekul substrat dan penyebaran ini
menyebabkan suatu regangan pada ikatan
kovalen spesifik dalam molekul substrat
sehingga ikatan kovalen tersebut menjadi
mudah pecah
37 Company Logo
Concerted Mechanism of Catalysis Carboxypeptidase A (248) Active (270) Tyr site Glu 3 4 ACTIVE
Concerted Mechanism of Catalysis
Carboxypeptidase A
(248)
Active
(270)
Tyr
site
Glu
3
4
ACTIVE ACTIVE
pocket
Site for
O -
COO -
SITE SITE
H
specificity
H
+ H
O -
C
N
R
5
N
C
C
2
Substrate
O -
peptide
1
+
COO -
+ Arg (145)
chain
His
Zn
Glu
C-terminus
(72)
Check for
(196) His (69)
C-terminal
39
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Reaksi enzimatis adalah reaksi terarah yang dapat digambarkan dalam urutan sbb. 1.terjadi mendekatnya gugus-gugus aktif
Reaksi enzimatis adalah reaksi terarah yang
dapat digambarkan dalam urutan sbb.
1.terjadi mendekatnya gugus-gugus aktif dari
kedua belah pihak,
2.terjadi pengkiblatan yang tepat dari elektron
orbit gugus-gugus aktif,
3. jika 1 dan 2 tercapai, maka substrat
diregang, disusul dengan transaksi proton
sehingga terbentuklah senyawa baru
[PRODUK], yang dilepaskan enzim. Enzim
kembali kekeadaan semula dan dapat
memulai lagi pekerjaanya.
38 Company Logo
Non-Enzyme Catalytic Mechanisms Secara umum proses katalis bukan enzim dapat dikelompokan ke dalam Katalisis oleh
Non-Enzyme Catalytic Mechanisms
Secara umum proses katalis bukan
enzim dapat dikelompokan ke dalam
Katalisis oleh asam-basa (Acid-base
catalysis).
Katalisis kovalen (Covalent catalysis)
Katalisis ion logam (Metal ion catalysis)
Katalisis elektrostatis (Electrostatic catalysis)
40 Company Logo
Katalisis asam-basa: asam-basa mempunyai kemampuan katalisis dengan memberi elektron (asam) dan menerima elektron
Katalisis asam-basa: asam-basa mempunyai
kemampuan katalisis dengan memberi
elektron (asam) dan menerima elektron
(basa)
Katalisis logam-elektrostatis: katalisis
seringkali melibatkan logam bekerja sama
membentuk ikatan elektrostatis
Katalisis kovalen:katalisis mellaui
pembentukan ikatan kovalen sementara
antara substrat dengan melekul katalis (ada
gugus cenderung memberikan elektron ke
gugud lain)
41 Company Logo
KINETIKA REAKSI ENZIM Dalam mengkatalis suatu reaksi, diasumsikan enzim berikatan lebih dulu dengan susbtrat. Akibat
KINETIKA REAKSI ENZIM
Dalam mengkatalis
suatu reaksi,
diasumsikan enzim berikatan lebih dulu
dengan susbtrat. Akibat ikatan ini
terbentuklah apa yang dinamai:
KOMPLEKS ENZIM-SUBSTRAT.
Reaksi ini dapat terdiri dari beberapa fase:
Pembentukan kompleks substrat (ES),
dimana E=enzim, S=substrat
Modifikasi dari substrat membentuk produk
(P), yang masih terikat enzim (EP)
Pelepasan produk dari molekul enzim
43 Company Logo
Acid-Base Catalysis Specific Induced to transition state Acid-base Catalysis Acid + + catalysis N N
Acid-Base Catalysis
Specific
Induced to transition state
Acid-base
Catalysis
Acid
+
+
catalysis
N
N
O
H
H
O
C
O
O
H
C
N
C
H
Both
C
C
H
H
N
H
C
H
N
H
C
H
N
C
O
H
H
H
O
H
O
H
H
H
H
O
H
H
-
-
H
H
O
O
O
O
Base
C
C
catalysis
Slow
Fast
Fast
Very Fast
42
Company Logo
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.167
=
=
=
=
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252
Ketiga fase tersebut dapat ditulis dengan persamaan reaksi: k 1 k 3 E + S
Ketiga fase tersebut dapat ditulis dengan
persamaan reaksi:
k 1
k 3
E + S
ES
E + P
(v )
k 2
o
[ES]
[E] [P]
k 1 =
k 3 =
[E] [S]
[ES]
44 Company Logo
Enzyme Kinetics Student A ☺ Student B ☺ Student C 0 1 2 3 4
Enzyme Kinetics
Student A
Student B
Student C
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
Exam Chapters
Substrate concentration
Meningkatnya konsentrasi enzim,
perubahan aktivitas enzim
45
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Enzyme activity
Score
Essential of Enzyme Kinetics SteadySteady StateState TheoryTheory E + S E S E + P
Essential of Enzyme Kinetics
SteadySteady StateState TheoryTheory
E
+
S
E S
E
+
P
47
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
(in a fixed period of time) 0 1 2 3 4 5 6 7 8
(in a fixed period of time)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
S
+
E
80
Product
60
P
Increase Substrate Concentration
40
20
0
0
2
4
6
8
Substrate (μmole)
46
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Concentration Constant ES Concentration at Steady State S P ES E Reaction Time 48 Company
Concentration
Constant ES Concentration at Steady State
S
P
ES
E
Reaction Time
48
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
An Example for Enzyme Kinetics (Invertase) 1)1) Use predefined amount of Enzyme → E 2)2)
An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)
1)1) Use predefined amount of Enzyme
→ E
2)2) Add substrate in various concentrations → S (x 軸)
3)3) Measure Product in fixed Time (P/t)
→ v o (y 軸)
4)4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → V max
5)5) When y = 1/2 V max calculate x ([S])
→ K m
V
max
1
v
v
o
o
1/2
- 1
1
K
m
V
max
Double reciprocal
1/S
K
Direct plot
S
m
49
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
EnzymesEnzymes k = V max [S] 1 k 2 S E S E P v
EnzymesEnzymes
k
= V max [S]
1
k
2
S
E
S
E
P
v
k
K m + [S]
-1
20
5
15
4
-K m , V max
10
3
0.5
V max
5
2
0
1
-5
-10
0
-50
-30
-10
10
30
50
0
10
20
30
40
50
[S], mM
[S], mM
Eric Niederhoffer
SIU-SOM
51
Company Logo
v, µmol/min
v, µmol/min
A Real Example for Enzyme Kinetics Substrate Product Velocity Double reciprocal [S] Absorbance v (μmole/min)
A Real Example for Enzyme Kinetics
Substrate
Product
Velocity
Double reciprocal
[S]
Absorbance
v (μmole/min)
no
1/S
1/v
1
0.25
0.21
→ 0.42
4
2.08
2
0.50
0.36
→ 0.72
2
1.56
3
1.0
0.40
→ 0.80
1
1.35
4
2.0
0.46
→ 0.92
0.5
1.16
(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per μmole
(2) Reaction time was 10 min
2.0
1.0
v
1/v
1.0
1.0
0.5
-3.8
0
0
-4
-2
0
2
4
0
1
2
[S]
1/[S]
50
Company Logo
Direct plot
Data
Double reciprocal
Juang RH (2004) BCbasics
Inhibition Enzyme Kinetics Direct plot Significance zero order k cat /K m v o =
Inhibition
Enzyme Kinetics
Direct plot
Significance
zero order
k cat /K m
v o = V max [S]
K m + [S]
1st order
k
cat
E3
Turn over
Observe v o change
under various [S],
resulted plots
yield V max and K
E2
number
E1
m
k 3 [E t ]
K
V max &
m
Competitive
Double reciprocal
Activity Unit
Maximum
Affinity with
velocity
substrate
1 μmole
min
Non-competitive
Specific Activity
unit
Activity
mg
Bi-substrate reaction also
follows M-M equation, but
one of the substrate should
be saturated when estimate
the other
Uncompetitive
52
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Significance of Enzyme Kinetics v 0 = V max × K = k 3 [Et]
Significance of Enzyme Kinetics
v 0 = V max × K
= k 3 [Et] × K
Obtain V max and K m
V max [S]
v o =
K m + [S]
zero order
E3
E2
1st order
E1
[S] = Low → High
[S] = Fixed concentration
Proportional to
enzyme concentration
53
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
K m : Hexokinase Example Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP Glucose Allose Mannose
K m : Hexokinase Example
Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP
Glucose
Allose
Mannose
Substrate
number
1 CHO
CHO
CHO
2 H-C-OH
H-C-OH
HO-C-H
3
HO-C-H
H-C-OH
HO-C-H
4
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
5
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
6
H
2 -C-OH
H
2 -C-OH
H
2 -C-OH
K m =
8
8,000
5 μM
55
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
K m : Affinity with Substrate v o = V max [S] K m +
K m : Affinity with Substrate
v o = V max [S]
K m + [S]
V max
If v o
=
2
When using different substrate
V
V max [S]
max
=
V
max
2
K m + [S]
S2
S1
S3
1/2
K m + [S] = 2 [S]
S1 S2
S3
K m = [S]
K
Affinity changes
m
54
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Turn Over Number, k cat k k 1 3 E + S ES E +
Turn Over Number, k cat
k
k
1
3
E + S
ES
E + P
(v )
k
o
2
When substrate excess, k 3 = k cat , turn over number (t.o.n)
When [substrate] is low
(IV)
Second order
V max [S]
[E][S]
k
3
v o =
= k 3
[E][S]
K m + [S]
K m + [S] =
K
m
Start from M-M eq.
Omit the [substrate]
Substrate specificity
56
Company Logo
Juang RH (2004) BCbasics
Turn Over Numbers of Enzymes Enzymes Substrate k cat (s -1 ) Catalase 40,000,000 H
Turn Over Numbers of Enzymes
Enzymes
Substrate
k cat (s -1 )
Catalase
40,000,000
H 2 O 2
Carbonic anhydrase
HCO 3
-
400,000
Acetylcholinesterase
Acetylcholine
140,000
β-Lactamase
Benzylpenicillin
2,000
Fumarase
Fumarate
800
RecA protein (ATPase)
ATP
0.4
The number of product transformed from substrate
by one enzyme molecule in one second
Company Logo
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263
57
Enzyme Activity Unit S → P μmole t v o = [P] / min Slope
Enzyme Activity Unit
S → P μmole
t
v o = [P] / min
Slope
tan
Unit =
μmole /min
0
10
20
30
40
Reaction time (min)
Specific
Activity Units
y
y
Activity =
= tan
Protein (mg)
x
x
59
Company Logo
Product [P]
Juang RH (2004) BCbasics
Chymotrypsin Has Distinct k cat /K m to Different Substrates O R O H 3
Chymotrypsin Has Distinct k cat /K m to Different Substrates
O
R
O
H
3 C–C–N–C–C–O–CH 3
H
H
R =
k cat / K m
Glycine
–H
1.3
╳ 10 -1
Norvaline
–CH 2 –CH 2 –CH 3
3.6
╳ 10 2
Norleucine
–CH 2 –CH 2 –CH 2 –CH 3
3.0
╳ 10 3
Phenylalanine
–CH 2 –
1.0
╳ 10 5
(M -1 s -1 )
58
Company Logo
Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379
=
=
suarsana65@yahoo.com LOGO 60
suarsana65@yahoo.com
LOGO
60