Anda di halaman 1dari 7

Tropomyosin dan S-peptida Serangkaian faktor yang menentukan struktur coiled coil Tropomyosin Circular dichroism Denaturasi/renaturasi tropomyosin

Rantai recognition, association, registration a. Serangkaian faktor revisit coiled coils H X X -H P X - P H X X H P X - P- H X X - H-P X P Gambar helical wheel Catatn: interaksi rantai sisi diatas dan dibawah sederhana Sekarang coba ubah rangkaian 18: Rangkaian: Residu 1, 4 : inti yang hidrofobik 5,7 : selektif dan polar 2, 3, 6 : interaksi kuartener; fungsi seluler Mungkin : tetapi untuk TM dan coiled coils lain, mudah untuk melihat sandi mereka. Coba ulangi struktur urat Derajat teta; Gelombang cahaya memotong vibrasi; bisa memvibrasi dalam variasi bidang tegak lurus untuk arah perambatan b. Tropomyosin IN vitro unfolding/refolding of a coiled-coil: Tropomyosin: Sifat tropomyosin Denaturasi/renaturasi TM Reversibel Memasangkan struktur sekunder dan tersier Dari kurva denaturasi: konformasi = f (rangkaian + lingkungan) Reaksi yang mungkin

Apakah konformasi ini atau organisasi sub unit mengkode serangkaian asam amino; mungkin protein bergabung dengan struktur komponen lain? Walaupun, untuk struktur ini, hanya berbeda serat; bukan kristal 3D, bukan struktur yang tinggi, bukan dalam PDB.kenyataannya dalam edisi pertma Branden and Tooze tidak menyebutkan coiled coils, karena kelarutan protein globular tidak ada. kenapa tropomyosin memberikan alfa heliks konformasi kritis untaian polipeptida keratin? Apa pengujian keratin pada keratin heliks menggunakan metodologi invitro anfinsen? Tidak mungkin: limit dalm sistem ini Serat yg dwasa crosslinkingnya kovalen

Kelarutan menyediakan perlakuan sederhana dan tidak menghasilkan populasi rantai protein yang homogen Hanya untuk memperoleh prekursor yang membentuk untaian s keratin lebih dulu untuk melipat dan memasngkan pada rambut. Dari budaya dan dari produk kloning gen. Fungi tropomyosin dan organisasi Mengingatkan Anda tentang struktur otot lurik: Thin filamen dari M Band filamen tebal yang bipolar: Tropomyosin Struktur: rodlike, 2nm x 41 nm saat diamati dalam mikroskop elektron sebagai molekul larut. berat molekul 65.5 kd. dua rantai dari 284 residu, a dan b, dengan sedikit perbedaan dalam urutan (39 residu) Hampir 100% alpha heliks dan terdiri dari dua heliks rantai alpha membungkus sekitar satu sama lain. Linear: Tidak berubah Relatif tingginya konsentrasi dibebankan asam amino, tapi luar biasa stabil terhadap perubahan Ph pada kedua asam dan basa sisi, menunjukkan bahwa interaksi elektrostatik tidak penting untuk pemeliharaan alpha struktur kumparan melingkar heliks Berinteraksi dengan filamen aktin untuk membentuk struktur filamen panjang yang terletak pada masing-masing dua alur jangka panjang di sisi berlawanan dari filamen tipis dalam otot. pak kepala ke ekor dengan 8-9 tumpang tindih residu Bind Troponin Subunit - Troponin protein peraturan lainnya dalam filamen tipis terikat untuk setiap molekul tropomiosin. Aktin: tropomysoin: troponin hadir di 07:01:01 stoikiometri. Fungsinya adalah batang kendali membatasi sumbu kelompok kepala myosin aktin filamen, bergerak bolak-balik selama siklus kontraksi otot, diatur oleh kalsium Dimurnikan tropomyosin belum pernah diamati untuk membentuk kristal tiga D, Jadi tidak ada struktur kristal, (bahkan tidak dalam Indeks Branden dan Tooze) Namun membentuk 2-D jaring kristal terbuka; Data struktural asli berasal dari hamburan sinar-X dan mikroskop elektron yang tidak biasa dua bentuk kristal dimensi, layang-seperti. C. Edaran dichroism Cahaya merupakan getaran melintang, dapat terpolarisasi, terbatas pada pesawat tertentu; Sebuah sinar terpolarisasi pesawat adalah satu di mana vektor listrik bergetar hanya dalam satu arah dalam bidang tegak lurus terhadap propagasi Bidang polarisasi dapat memutar, sehingga sirkuler terpolarisasi, baik searah jarum jam atau tidak, kiri atau kanan, polaroids memiliki kristalit yang menyerap satu komponen tidak berlawanan, dibentuk di bawah tekanan sehingga kristalit selaras; Asam amino L kiral diferensial menyerap cahaya dengan sinar vektor kiri dan kanan sirkuler terpolarisasi, dua komponen sehingga perjalanan pada kecepatan yang berbeda melalui polipeptida dan protein, yang menghasilkan rotasi bidang polarisasi Diferensial penyerapan cahaya kiri dan kanan sirkuler terpolarisasi; Jauh UV sinyal (200-230) - Monitor backbone konformasi peptida obligasi itu sendiri, dekat UV - cincin penyerapan pada panjang gelombang lebih panjang Fungsi dari panjang gelombang, sehingga memindai ellipticity vs panjang gelombang

Analog dengan spektrum serapan, pemindaian terhadap panjang gelombang Dinyatakan sebagai theta, ellipiticity molar, mengukur perbedaan antara cahaya terpolarisasi kiri dan kanan dibandingkan dengan cahaya masukan. Untuk protein heliks, bersih negatif, sehingga lebih negatif, lebih heliks: Terbaik untuk helix alpha karena dip ganda; Membedakan heliks alfa, beta lembaran dan gulungan acak akal juga. D. Denaturasi dan Renaturation dari tropomyosin Pertama: Pertimbangkan termal-denaturasi protein Anda sudah familiar dengan: Putih telur: lisozim ditambah ovalbumen? Susu: Kasein + alphal lactalbumen? Kolagen (gelatin)? Gluten? aktin Hasil dari proses denaturasi termal tergantung pada protein itu sendiri, umumnya tidak menampilkan rantai polipeptida; Sekarang mari kita mempertimbangkan lipat dan asosiasi dimurnikan rantai tropomyosin: Apakah tropomyosin refold dari negara didenaturasi?? Artinya, apakah tropomyosin urutan asam amino dengan sendirinya menentukan melingkar-coil konformasi?? Denaturasi Equilibrium: Semua pengukuran setelah proses telah datang ke keseimbangan atau steady state, sering bingung dalam literatur, tapi saya akan menyuguhkan data kesetimbangan yang benar. Ini harus dibedakan dari analisis kinetik, reaksi sebagai fungsi waktu. Ini adalah data RNase. Tropomyosin menunjukkan transisi leleh yang berbeda bila dipanaskan: Lori L. Isom, Marilyn Emerson Holtzer dan Alfred Holtzer (1984) alpha-heliks untuk Acak-Coil Transisi Dua-Chain, Coils digulung. Percobaan pada Denaturasi termal dari alpha dan beta-tropomyosin-tropomyosin makromolekul, 17 2.445-2.447. Dimurnikan tropomyosin berkurang: Kelinci jantung otot: Dua rantai alpha dan beta; berbeda dengan 39 residu, 11 di antaranya berada di posisi hidrofobik: Setiap titik duduk 10 menit, sepenuhnya reversibel, kesetimbangan benar; Menggambar tes-tabung: perubahan air mandi: Atau beberapa sampel dimasukkan ke dalam pemandian air yang berbeda: Tm adalah sekitar 50 C. Apa kondisi rantai polipeptida?? Tentu saja tidak helix alpha: tapi urutan asam amino tetap sama, tapi kami mengatakan urutan menentukan lipat!!?? Lipat = f (urutan; lingkungan) Namun, ketika dingin (menarik garis putus-putus), kurva identik: Hal ini dimungkinkan untuk menentukan berat molekul dari molekul dalam sampel oleh sejumlah teknik: Cahaya hamburan Sedimentasi kecepatan Sedimentasi ekuilibrium Tentukan berat molekul di atas Tm = sama dengan 1/2 dari mulai MW. Bahan ini adalah setengah berat molekul bahan awal!!

Jadi monomer. Apa konformasi: tidak alpha heliks, "teratur, acak" Jadi alpha helicity digabungkan ke dimerisasi, dan sebaliknya, kehilangan alpha helicity digabungkan ke disosiasi. Apa Pathway Pembentukan Coil digulung?? Apa yang akan Anda memprediksi sebagai keadaan fisik kondisi ini? Jadi Apa langkah-langkah dalam reaksi? Bagaimana bisa Anda menguji model? Apakah ada bukti untuk keuntungan alpha helicity sebelum peningkatan berat molekul? Tidak. Ketergantungan Konsentrasi: Mungkin tergantung pada persegi konsentrasi? Diencerkan dengan dua, ada perubahan? Bahkan encer oleh 1.000 - tidak mudah mendeteksi: dipertanyakan: Rute yang lebih langsung: Gunakan hamburan cahaya untuk mengikuti ukuran molekul: Data: L Jumlah rantai versus suhu untuk rantai dikurangi atau blok, untuk mencegah udara silang oksidasi menghubungkan. Kurva hamburan cahaya mengikuti kurva CD persis: Denaturasi dan disosiasi erat: NB: Ini alpha heliks sekuens asam amino tidak heliks alpha ketika bebas dalam larutan: Struktur sekunder adalah fungsi dari struktur tersier (?!): Penting untuk menghindari kesalahan intelektual berpikir bahwa konformasi adalah f sederhana (urutan); selalu f (urutan / lingkungan) jadi: Registrasi informasi dibangun ke urutan asam amino: Apa yang akan salah memprediksi tentang helicity; Pathway: heliks Formulir kemudian mengasosiasikan: Apa prediksi: helicity versus suhu? Pathway: Tidak ada helix sampai asosiasi: Stabilitas harus f (konsentrasi) Ya: Tapi sangat sulit untuk mendeteksi; Kami akan kembali ke ini Bahkan molekul tropomyosin paket paralel, dalam register. Mungkinkah ini heliks mengasosiasikan jika dalam register? Jadi bukan hanya Folding, Asosiasi, tetapi juga Pendaftaran! Ada bisa keluar dari intermediet mendaftar? 1 .... 14 .............................................. 284 1 ..... 14 ........................................... 284 Tropomyosins berbeda dalam otot yang berbeda, misalnya antara otot rangka Striated, dan otot jantung halus, variasi yang dihasilkan oleh splicing diferensial pada tingkat RNA messenger: 13 ekson Perhatikan bahwa banyak dari urutan tersedia untuk melakukan hal-hal lain: Apa Peran Situs Tersisa di urutan? Residu "b, c dan f" berbaring di permukaan terluar dari molekul kumparan digulung dan mungkin memiliki peran khusus dalam agregasi dari molekul kumparan digulung menjadi perakitan yang lebih besar dan fungsi molekul. Dalam otot ini jelas: situs-situs yang terlibat dalam interaksi dengan monomer aktin pada filamen aktin! Kesimpulan: Informasi Folding tersebar melalui Urutan Asam Amino!!

Dalam rangka untuk memahami aturan, perlu tahu mana asam amino membawa informasi untuk konformasi. Jika ulangi heptad menentukan struktur coil digulung, dan setiap ulangi heptad dapat membentuk kumparan melingkar, bagaimana mereka menemukan mitra yang tepat mereka? Pengakuan / kekhususan dalam asosiasi rantai, Tapi karena lipat bentuk asosiasi tidak uncoupled, tidak bisa uncouple lipat dari Pada 1980-an ada kemajuan yang signifikan dalam desain dan konstruksi spektrometer yang dapat mengukur dichroism melingkar, dan juga penghargaan yang lebih canggih dari struktur kumparan melingkar: Untuk memberikan rasa aspek dari masalah, biarkan saya menjelaskan studi yang lebih baru pada tropomyson, dan bagaimana alpha mengakui rantai beta: Sebuah penelitian yang sangat tajam dilakukan oleh Lehrere Sherwood dan rekan-rekannya di Boston Biomedical Research Institute: Mereka tertarik pada pertanyaan awalnya apakah di otot ada populasi yang berbeda dari tropomysins: bermain peran regulasi yang berbeda, otot rangka dibandingkan otot jantung Alpha / alpha Beta / beta Atau alpha beta: Menjadi jelas bahwa dalam otot spesies utama adalah alpha / beta, Yang mengangkat pertanyaan tentang bagaimana alpha dan rantai beta pilih heteropartner atas homopartner: Sherwin S. Lehrer, Yude Qian dan Soren Hvidt (1989) "Majelis Heterdoimer asli Rana esculenta Tropomysoin oleh Bursa Rantai" Ilmu,, 246 926-928. Percobaan Lehrer dilakukan dengan TM dari Rana Frog Equilibrium berlangsung: sampel menetaskan pada suhu untuk waktu yang telah ditentukan, spektrum catatan, mengungkapkan sebagai helix%: Kurva untuk alpha / alpha: 50 C Kurva untuk beta / beta = 36 C Kurva untuk alpha beta, tampak seperti dua populasi: tapi karakterisasi fisik menunjukkan satu. Bagaimana berpikir tentang titik-titik tengah: bisa dua populasi yang stabil, tetapi sangat jarang: Aha: Tidak transisi tunggal, dua transisi, satu di bawah 36 satu suhu tajam kedua pada suhu yang lebih tinggi, titik tengah 50 C. kemungkinan: Heterogenitas dalam sampel: TM adalah campuran dari dua spesies: homogen sampel: Dua domain yang berbeda, satu tinggi tm, tm rendah lainnya Pada pendinginan, mengamati transisi suhu yang lebih tinggi, namun kehilangan transisi suhu yang lebih rendah, dan tidak kembali tingkat yang sama helicity sebagai wild type: Mungkin refolds domain satu, lainnya tidak, atau refolds satu spesies, atau tidak Melanjutkan untuk memurnikan oleh chromotography pertukaran ion (garam yang berbeda) alpha rantai dan rantai beta. Dalam kondisi fisiologis alpha / alpha dimmer, dimer / : Melaksanakan leleh: ALHA / alpha menunjukkan transisi tunggal dengan titik tengah sekitar 50 C / transisi menunjukkan pada suhu yang jauh lebih rendah: sekitar 30 C

Keduanya menunjukkan bahwa disosiasi dimer yang digabungkan dengan hilangnya alpha helicity: Terungkapnya refolded material; kurva pas dengan jumlah alpha / alpha dan beta / beta Dengan kondisi tersebut, dua rantai lipat kembali ke dimer homo, kurva leleh adalah campuran: Transisi pertama alp TM asli [ha / beta harus reaksi pertukaran bentuk 2alpha/beta >> alpha / alpha + 2 karena kalah helicity, tetapi masih memiliki hadiah spesies yang menunjukkan transisi koperasi identik dengan alpha / alpha Dalam kondisi dimana struktur asli yang stabil, keseimbangan cepat antara [Asli} 2,> [I]? N <> 2 [U] 2 Tidak ada spesies yang lama tinggal cukup untuk mengkarakterisasi secara langsung: Mari kita memeriksa tingkat proses ini: memakan waktu sekitar 50-100 detik untuk mendinginkan dari 60 C menjadi 34 C; Helicity kembali rapidily: Sekarang terus menetaskan selama 5.000 detik sekitar 8 jam: Helicity dan termostabilitas kembali E. Rantai Recognition, Asosiasi, Pendaftaran Proses pengenalan, inisiasi helicity> pendaftaran> propogation> Hati-hati investigasi Pengakuan Rantai: Erin O'shea, Rheba Rutkowski, Walter F. Stafford III, Peter S. Kim (1989) Heterodimer Preferential Pembentukan oleh Ritsleting Leusin terisolasi dari Fos dan Jun Ilmu, 245, 646-648. DNA binding protein Fos dan Jun daerah masing-masing berisi leusin ritsleting dengan lima leucines di setiap residu ketujuh. Homologi parsial untuk GCN $. Disintesis peptida dengan sistein dan dua glycines sebagai spacer di N-terminus. Jalankan pada HPLC; Mengurangi, dua puncak tunggal peptida masing-masing; Teroksidasi puncak, tunggal; Jadi tidak ada fos / fos atau Juni / Juni di bawah ini eqilibirum condtions; Pengendalian: denaturasi di GuHCL, mengoksidasi, sekarang memulihkan semua tiga spesies Siapkan semua tiga dimer, memeriksa dengan dichroisims melingkar: Ketiganya sangat heliks: Apa yang terjadi jika bercampur homodimers; Dalam ketiadaan zat pengoksidasi: Dalam kehadiran zat pengoksidasi - heterodimer Saja! Jadi bertukar bawah transisi peleburan; Periksa stabilitas: Fos / Juni Tm sekitar 54 Juni / Juni sekitar 53 Fos / fos 37C. Fos adalah +4 muatan bersih: Juni adalah muatan bersih -4; Jadi elektrostatik stabilisasi dari heterodimer Elektrostatik tolakan di homodimers; Kelas heliks: protein berserat - larut, helicity menyimpulkan

Dalam protein globular, diamati oleh difraksi sinar-X-pegunungan ke alur kemasan Dalam digulung / koil, hamburan sinar-X dan difraksi - apakah ini kemasan pegunungan ke kebun? diisolasi?? Digulung Coils distabilkan oleh: Jalur hidrofobik interaksi muatan Charge / jembatan garam H-obligasi inti dimakamkan hidrofobik Hari ini kita akan fokus pada pembentukan heliks alfa dalam rantai polipeptida non heliks dan interaksi urutan tertentu yang menstabilkan dan menggoyahkan spesies tersebut.