Anda di halaman 1dari 10

PEMERIKSAAN ANTI-HCV ELISA MENGGUNAKAN REAGENSIA HEPANOSTIKA HCV ULTRA

Hari, tanggal praktikum Tempat praktikum

: Jumat, 8 November 2013 : Laboratorium Unit Tranfusi Darah PMI Sanglah

I.

Tujuan Untuk dapat mendeteksi secara kuantitatif antibodi HCV (Hepatitis C Virus) pada sampel serum pasien.

II.

Metode Metode yang digunakan adalah ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

III. Prinsip Plate dilapisi oleh antigen penangkap. Sampel serum dimasukkan ke dalam plate, kemudian antibodi yang ada dalam serum berikatan dengan antigen penangkap. Antigen pendeteksi berlabel enzim mengenali dan berikatan dengan antibodi. Enzim bereaksi dengan substrat menghasilkan produk yang berwarna. Hasil reaksi akan memunculkan warna yang bisa diukur secara kuantitatif dengan alat kolorimetrik (mikroplate reader) yang dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm dan panjang gelombang 620-630 nm sebagai referensi.

IV. DASAR TEORI A. Hepatitis C Penyakit yang mempengaruhi hati meliputi kelainan sekunder pada berbagai penyakit sistemik dan kelainan primer yang lebih spesifik bagi hati itu sendiri. Ada beberapa penyakit yang ditemukan akibat gangguan hati antara lain hipertensi porta, pirav vena-porta, sistemik splenomegali, ikterus/jaundice/penyakit kuning, sirosis, dan hepatitis. Dari beberapa

contoh ini yang paling sering dijumpai dalam beberapa kasus adalah hepatitis (Corwin, 2000). Hepatitis adalah peradangan pada hati. Penyakit ini dapat disebabkan oleh infeksi atau toksin termasuk alcohol, dan dijumpai pada kanker hati. Hepatitis disebabkan oleh virus. Telah ditemukan 6 atau 7 kategori virus yang menyebabkan hepatitis (Corwin, 2000). Penyakit hepatitis C adalah penyakit hati yang disebabkan oleh virus hepatitis C (HCV = hepatitis C virus). HCV adalah virus RNA yang digolongkan dalam Flavivirus bersama-sama dengan cirus hepatitis G, Yellow fefver, dan Dengue. Virus ini umumnya masuk ke dalam darah melalui transfusi atau kegiatan-kegiatan yang memungkinkan virus ini langsung terpapar dengan sirkulasi darah. Kehadiran virus hepatitis C di organ hati memicu dikeluarkannya sistem kekebalan tubuh yang mengakibatkan proses peradangan. Proses peradangan yang terus-menerus mengakibatkan penumpukan jaringan parut di hati. Maka terjadilah apa yang dinamakan sirosis hati.. Hati yang menjadi sirotik dapat gagal melakukan fungsinya secara normal. Hal ini disebut dengan gagal hati. Gagal hati dapat mengakibatkan banyak komplikasi penyakit, bahkan kematian. Selain itu sirosis hati juga meningkatkan kemungkinan terjadinya kanker hati (Anonim, 2010).

B.

ELISA (Enzim-linked immunosorbent assay) Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau dalam bahasa indonesianya disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim, merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya). Namun seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, teknik ELISA juga diaplikasikan dalam bidang patologi tumbuhan, kedokteran, dll. Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik

ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang

menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich. Dewasa ini, teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagai macam jenis teknik. Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain: 1. ELISA direct Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang

diinginkan pada sampel yang diuji. ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain: a. Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan enzim. b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal. c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda. d. Amplifikasi signal hanya sedikit. e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct. Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain: a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

2.

ELISA indirect Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji. ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain: a. Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal. Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain: a. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara komersial di pasar. b. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak

terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda. c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder. 3. ELISA Sandwich Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus

dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak

dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi. Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: a. Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter. b. Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen. Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda). 4. ELISA Biotin Streptavidin (Jenis ELISA modern) Pada perkembangan selanjutnya, teknik ELISA sandwich ini juga dikembangkan untuk mendeteksi antibodi dengan tingkat sensitivitas relatif lebih tinggi. Teknik ini dikenal sebagai teknik ELISA penangkap antibodi,

dimana prinsip kerjanya sama dengan ELISA sandwich, hanya saja yang digunakan pada teknik ini adalah antigen penangkap dan antigen detektor (antigen bertaut enzim signal, bersifat optional apabila antibodi yang diinginkan tidak tertaut dengan enzim signal). 5. ELISA Kompetitif Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu. Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan suatu kompetitor ke dalam lubang microtiter. Teknik ELISA kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi. Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang mengandung antibodi atau antigen yang diinginkan, tapi hasil yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat sifat spesifisitas dari antibodi dan antigen. 6. ELISA Multiplex Teknik ELISA multiplex merupakan pengembangan teknik ELISA yang ditujukan untuk pengujian secara simultan, sedangkan prinsip dasarnya mirip dengan teknik ELISA terdahulu.

V.

Alat dan Bahan A. Alat 1. Strip mikroelisa Hepanostika HCV Ultra 2. Mikropipet 10 3. Yellow tip 4. Inkubator 5. Washer 6. Timer 7. Mikroplate reader 100

B. Bahan 1. Sampel serum dengan kode 042 2. Sampel serum dengan kode 043

3. Reagensia Hepanostika HCV Ultra (No. Lot : BJ02681, Exp. Date : 05 2014) yang terdiri dari : a. Kontrol positif b. Kontrol negatif c. Spesimen diluents d. Conjugate Working Solution e. TMB Substrate 4. Sulfuric acid 1 mol/liter

VI. Cara Kerja 1. Strip mikroelisa disiapkan sebanyak bahan yang akan diperiksa ditambah dengan 3 kontrol positif dan 1 kontrol negatif. 2. Specimen diluent dipipet sebanyak 100 sumur mikroelisa. 3. Sampel serum dipipet sebanyak 10 dimulai dari sumur nomor E1. 4. Kontrol negatif dipipet sebanyak 10 5. Kontrol positif dipipet sebanyak 10 nomor B1, C1, dan D1 6. Mikroelisa ditutup dengan seal dan diinkubasi pada suhu 370C selama 30 2 menit 7. Plate dicuci sebanyak 6 kali 8. Conjugate working solution dipipet sebanyak 100 masing sumur 9. Mikroelisa ditutup dengan seal dan diinkubasi pada 370C selama 30 2 menit 10. Plate dicuci sebanyak 6 kali. 11. TMB substrate dipipet sebanyak 100 ke dalam masing-masing sumur. 12. Mikroelisa ditutup dengan seal dan diinkubasi pada 20-300C selama 30 2 menit. 13. Reaksi distop dengan menambahkan 100 dalam masing-masing sumur. 1 mol/L sulfuric acid ke ke dalam masingke dalam sumur A1 ke dalam masing-masing sumur ke dalam masing-masing sumur ke dalam masing-masing

14. Hasil dibaca dengan mikroplate reader pada panjang gelombang 620-630 nm. 15. Hasil pengamatan dicatat dan dihitung.

VII. Hasil Pengamatan A. Identitas Pemeriksaan Nama pemeriksa : Satya Nugraha Tanggal Nomor plate No. Lot : 15 11 2013 :I : BJ02693

Tanggal Kadaluarsa: 11/2014

B. Tabel Nilai Absorbansi HCV Sumur A B C D E Plate NC1 PC1 PC2 PC2 SM1 Absorbansi 0,071 1,059 0,728 0,888 0,050 0,207 0,104 0,423 0,061 0,253 0,045 0,187

SM2

SM3

SM3

C. Perhitungan
1.

Rata-rata positif control

2.

Control negatif NC = 0,071

3.

Cut off Cut off = PCx x 0,27

= 0,891 x 0,27 = 0,241

4.

Valid Valid = PCx NC 0,400 = 0,891 0,071 0,400 = 0,820 0,400

D. Hasil pemeriksaan HCV Sampel 1 Pengerjaan I: non reaktif

Sampel 2 Pengerjaan I: non reaktif

Sampel 3 Pengerjaan I: non reaktif Pengerjaan II : non reaktif

Keterangan : 1. 2. Sampel reaktif bila absorbansi nilai cut-off Sampel negatif bila absorbansi < nilai cut-off

http://www.scribd.com/doc/11489129/Hepatitis-c http://www.scribd.com/doc/78431758/Makalah-WBA-Dan-ELISA http://www.scribd.com/doc/39010855/ELISA