Anda di halaman 1dari 35

BAB XVII

Pengembangan Metode Analisis dan Validasi Metode

Pendahuluan
Kimia analisis merupakan ilmu teoritis dan terapan yang telah dipraktekkan di analisis secara hamper rutin semua laboratorium. divalidasi, Metode-metode dikaji secara dikembangkan,

bersama-sama diaplikasikan. Komplikasi metode-metode analisis muncul di sejumlah kompedia seperti Farmakope Indonesia, US !united States harmacopeia", #$#% !#ssociation o& $&&icial #nalytical %hemist", dan sebagainya. Proses Validasi 'alidasi merupakan suatu proses yang terdiri atas paling tidak ( langkah nyata, yaitu ) !*". 'alidasi perangkat lunak !so&t+are validation", !," validasi perangkat keras-instrument !instrument-hard+are validation", !." validasi metode, dan !(" kesesuaian system !system suitability", sevagaimana dijelaskan dalam gambar */.*. roses validasi dimulai dengan perangkat lunak yang tervalidasi dan system yang terjamin, lalu metode yang divalidasi menggunakan system yang terjamin dikembangkan. #khirnya, validasi total diperoleh dengan melakukan kesesuaian system.

Masing-masing tahap dalam proses validasi ini merupakan suatu proses yang secara keseluruhan bertujuan untuk mencapai kesuksesan validasi.

Perangkat keras/Hardware

Validasi Metode

Validasi

erangkat lunak-So&t+are 0ambar */.* Proses Validasi

Kesesuaian Sistem

(Sumber : Swartz and Krull, 1

!"

Kuali&ikasi merupakan bagian !subset" proses validasi yang akan memveri&i&kasi modul dan kinerja system sebelum suatu instrument diletakkan secara on line !atau diletakkan pada tempatnya dalam suatu laboratorium". 1ika instrument tidak terjamin dengan baik sebelum digunakan, maka akan muncul suatu masalah yang sulit untuk diidenti&ikassi. 0ambar */.,. menjelaskan garis +aktu kejadian-kejadian pada saat proses validasi.

Sisi pemasok pengguna (vendors site) site)

sisi pengguna (users site) 'alidasi &ungsional

sisi (users kalibrasi

pemmeliharaan 'alidasi so&t+are) system Sesuai IS$ 2333 4 System pembelian penggunaan
#ambar 1!$% #aris &a'tu Validasi (Sumber: Swartzand Krull, 1 !"

instalasi I4

operasional $4

kinerja 4

kesesuaian $4, setelah

sebelum penggunaan

Kuali(i'asi
Sebagaimana dijelaskan oleh gambar */.,, validasi dia+ali dari sisi pemasok !vendor5s site" sebagai bagian terstruktur pada tahap validasi. ada tahap ini, instrument dan perangkat lunak

dikembangkan, didesain, dan dihasilkan dalam suatu lingkungan yang tervalidasi sesuai dengan praktek laboratorium yang baik !good laboratory practices, 06 " dan atau standar IS$ 2333. Selama tahap kuali&ikasi atau validasi &ungsional, amak dilakukan kuali&ikasi instalasi !installation 7uali&ication, I4", kuali&ikasi operasional !$perational 7uali&ication, $4", dan kuali&ikasi kinerja !per&ormance 7uali&ication, 4". Setelah instrument diletakkan secara online !atau diletakkan pada tempatnya dalam laboratorium" dan setelah instrument digunakan dalam +aktu tertentu, maka alat harus dikalibrasi, dan dilakukan standarisasi, yang mana proses seperti ini kadang-kadang dirujuk sebagai kuali&ikasi pera+atan !maintance 7uali&ication, M4". *. Kuali&ikasi Instalasi (Instalation Qualification, IQ) roses I4 dapat dibagi menjadi dua langkah yaitu pre-instalasi dan instalasi &isik. Selama pre-instalasi, semua in&ormasi yang berhubungan dengan instalasi yang benar, operasionalisasi, dan pera+atan instrument harus dikaji. Selama instalasi &isik, nomor seri harus dicatat. 8okumentasi yang menggambarkan bagaimana instrument install, siapa yang melakukan instalasi, dan rincian-rincian lain yang terkait dengan instrument harus diarsipkan. ,. Kuali&ikasi $perasional (Operational Qualification, OQ) roses $4 menjamin bah+a modul-modul yang menjelaskan secara spesi&ik system operasional instrument sesuai dengan operasional instrument telah sesuai dengan spesi&ikasi yang ditentukan, misalkan akurasinya, presisinya, lineritasnya. roses ini mungkin merupakan suatu veri&ikasi terhadap modul itu sendiri.

.. Kuali&ikasi Kinerja (Performance Qualification, PQ) roses 4 memveri&ikasi kinerja system. Uji 4 dilakukan di ba+ah kondisi penggunaan instrument yang sebenarnya pada kisaran kerja yang telah diantisipasi. Meskipun demikian, pada prakteknya antar $4 dan 4 sering kali dilakukan secara bersaama-sama khsususnya untuk uji linearitas dan presisi !repitibilitas atau keterulangan". Pengembangan Metode, )*timasi, dan Pende'atan Validasi$ *. engembangan metode engembangan metode analisis biasanya didasarkan pada literature yang sudah ada menggunakan instrument yang sama atau yang hampir sama. Saat ini jarang kita temu penmgembangan suatu metode !missal K%K9" yang tidak menggunakan pendekatan dengan menghubungkan atau membandingkan metode yang sedang eksis. Sebagai contoh, suatu metode yang dibutuhkan untuk menetapkan kadar toluene dalam air mungkin diambil dari metode yang sudah ada untuk penetapan kadar ben:ene dalam air. Matriks sampel adalah sama, dan kedua analit mempunyai si&at-si&at yang hampir sama sehingga memungkinkan untuk menggunakan cara isolasi, identi&ikasi, dan kuanti&ikasi ben:ene, untuk selanjutnya digunakan pada analisis toluene. 8i sisi lain, suatu metode yang dibutuhkan untuk menetapkan kadar ben:ene dalam air bukanlah suatu pilihan terbaik. #dopsi metode penetapan senya+a organic

lain dalam tanah mungkin merupakan langkah a+al yang lebih baik. engembangan metode biasanya membutuhkan pemilihan syarat-syarat metode tertentu dan memutuskan jenis alat apa yang akan digunakan dan kenapa. ada tahap pengembangan, keputusan yang terkait dengan pemilihan kolom, &ase gerak, detector, dan metode kuanti&ikasi harus diperhatikan. #da beberapa alasan valid untuk mengembangkan suatu metode analisis baru, yaitu ) 9idak ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam matriks sampel tertentu Metode yang ada terlalu banyak menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah ada tidak reliable !presisi dan akurasinya rendah" Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan +aktu banyak, membutuhkan banyak energi, atau tidak dapat diautomatisasikan. Metode yang kurang memiliki spesi&itas yang mencukupi pada sampel yang dituju Instrumentasi dan tekhnik yang lebih baru memberikan kesempatan untuk meningkatkan kinerja metode tersebut, yang meliput peningkatan identi&ikasi analit, peningkatan batas deteksi, serta akurasi dan presisi yang lebih baik. #da suatu kebutuhan untuk mengembangkan metode alternative, baik untuk alasan legal ataupun alasan sainti&ic.

,. $ptimasi Selama tahap optimasi, serangkaian kondisi a+al yang mungkin pada tahap pertama pengembangan metode harus dimaksimalkan !resolusi, bentuk puncak, jumlah lempeng, asimetri, kapasitas, +aktu elusi, batas deteksi, batas kuanti&ikasi, dan keseluruhan kemampuan untuk melakukan kuanti&ikasi analit tertentu yang dikehendaki. $ptimasi metode dapat mengikuti dua pendekatan yang umum yaitu) !*" manual, dan !," dengan mendasarkan pada computer. endekatan manual melinatkan variasi * variabel percobaan dalam satu +aktu. Sedangkan variable yang lainnya dibuat tetap lalu respon yang terjadi dicatat. 'ariable-variabel dapat berupa ) kecepatan alir, komposisi &ase diam dan atau &ase gerak, suhu, panjang gelombang deteksi, p;. endekatan ini terhadap system optimasi bersi&at lambat, membutuhkan +aktu yang lama, dan berpotensi membutuhkan biaya yang banyak !mahal". Meskipun demikian pendekatan ini dapat memberikan tentang prinsip-prinsip dan teori yang terlibat dan juga interaksi-interaksi berbagai variable. ada pendekatan kedua !dengan computer" e&isiensi dioptimasi, akan tetapi input eksperimental menjadi minimal. endekatan secara otomatis dengan computer ini secara signi&ikan akan mengurangi +aktu, energy, dan lari. .. endekatan validasi metode Sangat sulit untuk membedakan secara sempurna antara pengembangan metode dan optimasi dari validasi,

karena +ilayah ketiganya saling tumpah tindih. Meskipun demikian, harus masih dimungkinkan untuk untuk membedakan bah+a validasi dengan optimasi. ada tahap validasi, suatu usaha dikerahkan mendemonstrasikan metode bekerja dengan sampel yang mengandung analit tertentu, pada suatu konsentrasi yang diharapkan dalam suatu maatriks sampel, dengan tingkat presisi dan akurasi yang tinggi. 'alidasi metode yang sempurna hanya dapat terjadi jika metode tersebut sudah dikembangkan dan dioptimasi. #da beberapa pendekatan untuk melakukan validasi metode yaitu metode spiking buta nol !:ero-blind spiking", spiking buta tunggal !single-blind spiking", dan metode studies" spiking < dan buta-ganda pendekatan !double-blind dengan spiking" < pendekatan kolaborati& antar laboratorium !interlaboratori& membandingkan metode baru yang diterima. a. Metode spiking i. Metode spiking buta nol endekatan metode buta nol melibatkan analisis tunggal menggunakan suatu metode yang akan divalidasi untuk melakukan analisis suatu sampel yang mengandung level analit tertentu yang sudah diketahui, untuk dapat didemonstrasikan perolehan kembali berguna subjekti&. ii. Metode spiking buta tunggal !recovery-nya", akan tetapi presisinya, terjadi akurasinya. hal yang Secara umum, pendekatan ini cepat, sederhana, dan rentan

eningkatan pada

metode

spiking

buta

tunggal yang

ini

melibatkan satu analis yang menyiapkan sampel konsentrasi yang bervariasi tidak diketahui konsentrasinya untuk diberikan kepada analis kedua yang selanjutnya dikumpulkan dan dibandingkan. Meskipun pendekatan ini tidak bisa di a+alnya, akan tetapi pendekatan ini dapat kehilangan kebutaannya pada tahap yang paling krusial. =akni ketika , hasil analisis dibandingkan. iii. Metode spiking buta ganda endekatan metode spiking buta ganda ini melibatkan tiga analis. #nalis pertama menyiapkan sampel pada konsentrasi yang diketahui, analis kedua melakukan analisis sampel dan analis ketiga !atau administrator" membandingkan kedua data yang dihasilkan kedua analis. >aik analis pertama maupun analis kedua tidak dapat mengakses data yang dihasilkan oleh masing-masing buta analis. ini endekatan metode spiking ganda

merupakan pendekatan yang paling objekti& dengan asumsi tidak bias yang dihasilkan analis ketiga !administrator". b. Metode endekatan dengan analisis bahan rujukan

terstandar !standar re&rence material, S?M" #nalisis dengan bahan re&rens buku atau sampel otentik pada umumnya merupakan pendekatan validasi yang diterima. US , @IS9 !@ational Institute o& standard and

9echnology" dan organisasi lain telah menyiapkan, menjamin, dan memasarkan berbagai macam spesies analit dalam berbagai matriks sampel yang berbeda. Ketika menunjukkan menggunakan bah+a S?M, analis yang harus metode digunakan

memberikan pengukuran analit yang akurat dan teliti dalam matriks sampel tertentu. 8engan pendekatan ini bias juga dapat terjadi, terutama jika analis mengetahui banyaknya kandungan analit dalam S?M. c. endekatan kolaborati& antar laboratorium Uji banding antar laboratorium mungkin merupakan prosedur yang paling diterima untuk melakukan validasi metode analisis baru. endekatan ini sangat amhal dan membutuhkan +aktu yang lam, bahkan sampai tahunan mulai dari validasi sampai akhir validasi. Selama melakukan validasi dengan cara ini, analis harus mengeluarkan segala usahanya untuk mengkoordinasikan proses validasi, membagi sampel, menerima hasil, menganilis hasil dengan cara statistic, menginterpretasi hasil, dan akhirnya melakukan interpretasi dan memveri&ikasi data. Metode ini jarang dilakukan ketika suatu metode untuk pertama kalinya muncul di literature. d. endekatan dengan membandingkan metode baru yang diterima

Membandingkan

metode

analisis

yang

akan

divalidasi dengan metode analisis yang sudah ada yang telah diterima merupakan suatu pendekatan lain untuk mengembangkan metode analisis. endekatan ini biasanya dilakukaan analis tunggal, akan tetapi da<pat juga dilakukan dua analis yang mana sampel yang akan dikerjakan dipecah menjadi dua. endekatan ini juga emnggunakan hasil-hasil yang diperoleh dari metode analisis yang telah ada sebagai veri&ikasi untuk metode analisis baru yang akan divalidasi. #danya kesesuaian hasil antara metode baru dengan metode yang telah ada mengarahkan bah+a metode baru tersebut akan valid, sebaliknya ketidaksesuaian hasil antara metode baru dengan metode yang telah ada merupakan masalah serius untuk menjadikan metode baru tersebut dapat diterima dan digunakan. Meskipun demikian, adanya ketidaksesuaian ini juga dapat dimaknai adanya kemungkinan bah+a metode yang telah ada tidak valid dan menimbulkan kesalahan. 1ika seorang analis dapat membuktikan bah+a suatu metode yang telah ada tidak valid, maka analis harus memulai suatu pendekatan lain untk melakukan validasi metode baru. ertanyaan yang sering muncul adalah berapa banyak sampel yang harus dianalisis dalam pendekatan validasi ini. Secara umum, semakin banyak sampel maka semakin baik, dan semakin bervariasi konsentrasi sampel, amka semakin baik. Idealnya, suatu metode

harus

divalidasi

untuk

suatu

analit

menggunakan

berbagai macam jenis sampel yang berbeda. Validasi Metode Analisis 'alidasi metode menurut United States harmacopeia !US " dilakukan untuk menjamin bah+a metode analisis akurat, spesi&ik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan veri&ikasi bah+a parameter-parameter problem analisis, kinerjanya karenanya cukup suatu mampu metode untuk harus mengatasi

divalidasi, ketika ) Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bah+a metode baku tersebut harus direvisi. enjaminan mutu yang mengindikasikan bah+a metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya +aktu Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda. Untuk mendemonstrasikan !Unites States kesetaraan antar , metode, seperti antara metode baru dan metode baku. Menurut US */... harmacopeia", ada A langkah dalam validasi metode analisis sebagaimana terlihat dalam gambar

resisi

#kurasi >atas deteksi 'alidasi metode >atas kuanti&ikasi Spesi&isitas

6inearitas dan rentang Kekasaran ! ?uggedness"

Sementara

itu

I%;

Ketahanan %on&erence !International !?obutness"

on

;armani:ation" membagi karakteristik validasi metode yang sedikit berbeda dengan US sebagaimana dalam gambar */.(.
resisi #kurasi

>atas deteksi 'alidasi metode >atas kuanti&ikasi Spesi&isitas

6inearitas Kisaran !range"

Ketahanan !?obutness" Kesesuaian sistem

1$ Kete*atan (a'urasi" #kurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konversi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan. #kurasi dikur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian senya+a obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar !standart re&erence material,S?M" Untuk mendokumentasikan akurasi, I%; merekomendasikan pengumpulan data 2 kali penetapan kadar dengan . konsentrasi yang berbeda !missal . konsentrasi dengan . kali replikasi3. 8ata harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali. %$ Presisi resisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel yang berbeda signi&ikan secara statistic. Sesuai dengan I%;, presisi harus dilakukan pada . tingkatan yang berbeda yaitu ) keterulangan !repeatability", presisi antara !intermediate precision" dan ketertiruan ! reproducibility"

a. Keterulangan yaitu ketepatan ! precision" pada kondisi yang b. sama !berulang" baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun +aktunya. resisi antara yaitu ketepatan !precision3 pada kondisi percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun +aktunya. c. Ketertiruan merujuk pada hasil B hasil laboratorium yang lain. 8okumentasi presisi seharusnya mencakup ) simpangan baku, simpangan baku relative !?S8" atau koe&isien variasi !%'", dan kisaran kepercayaan. engujian presisi pada saat a+al validasi metode seringkali hanya menggunakan keyika , parameter melakukan yang uji pertama, banding yaitu antar )keterulangan dan presisi antara. ?eprodusibilitas biasanya dilakukan akan laboratorium. resisi seringkli diekspresikan dengan S8 atau

standar deviasi relative !?S8" dari serangkaian data. Untuk menghitung S8 dapat dilihat pada bab II, sementara itu nilai ?S8 dirumuskan dengan )

*33 C S8 ?S8 D data, dan S8 < yang namanya E merupakan rata B rata E

adalah standar deviasi Serangkaian data

8ata untuk menguji presisi seringkali dikumpulkan sebagai bagian kajian B kajian lain yang berkaitan denga presisi seperti linearitas atau akurasi. >iasanya replikasi F -*G dilakukan pada sampel tunggal untuk tiap B tiap konsentrasi. untuk ada pengujian dengan K%K9, nilai ?S8 antara *-,H biasanya dipersyaratkan senya+a B senya+a akti& dalam jumlah yang banyak< sedangkan untuk senya+a B senya+a dengan kadar sekelumit, ?S8 berkisar antara G-*GH. +$ S*esi(isitas Spesi&isitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesi&ik dengan adanya komponen B komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks. I%; membagi spesi&isitas dalam , kategori, yakni uji identi&ikasi kan uji kemurnian atau pengukuran. Untuk tujuan identi&ikasi, spesi&isitas ditunjukkan dengan kemampuan suatu metode uji analisis untuk dan membedakan antar senya+a yang mempunyai struktur molekul yang hamper sama. Untuk tujuan kemurnian tujuan pengukuran kadar, spesi&isitas ditunjukkan oleh daya pisah , senya+a yang berdekatan !sebagimana dalam kromatogra&i". Senya+a B senya+a tersebut biasanya adalah komponen utama atau komponen akti& dan atau suatu pengotor. 1ika dalam suatu uji terdapat suatu pengotor !impurities" maka metode uji harus tidak terpengaruh dengan adanya pengotor ini. enentuan spesi&isitas metode dapat diperoleh dengan , jalan. =ang pertama !dan yang paling diharapkan", adalah

dengan melakukan optimasi sehingga diperoleh senya+a yang dituju terpisah secara sempurna dari senya+a B senya+a lain !resolusi senya+a yang dituju I ,". %ara kedua untuk memperoleh spesi&isitas adalah dengan menggunakandetektor selekti&, terutama untuk senya+a B senya+a yang terosolusi secara bersama B sama. Sebagai contoh, detector elektrokimia atau detector &luoresen hanya akan mendeteksi senya+a tertentu, sementara senya+a yang lainnya tidak terdeteksi. enggunaan detector U' pada panjang gelombangyang spesi&ik juga merupakan cara yang e&ekti& untuk melakukan pengukuran selekti&itas. 8eteksi analit secara selekti& dengan detector U' dapat ditingkatkan dengan menggunakan teknik derivatisasi dan dilanjutkan tertentu Sebagai dengan contoh pengukuran terhadap adalah pada panjang yang gelombang dihasilkan. (untuk yang spesi&ik derivate klorida

penggunaan

senya+a !8#>S-%l"

dimetilaminoa:oben:ena-(5-sul&onil

menderivatisasi asam amino yang mana derivate yang terbentuk dapat dideteksi dengan U' pada panjang gelombang (.F nm. ,$ Batas -ete'si (limit of detection, LOD) >atas deteksi dide&inisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuanti&ikasi. 6$8 merupakan batas uji yang secara spesi&ik menyatakan apakah analit di atas atau di ba+ah nilai tertentu. 8e&inisi batas deteksi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah bah+a batas deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar blanko !yb" ditambah dengan . simpangan baku blanko !.Sb".

6$8 seringkali diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pada rasio signal terhadap derau !signal to noise ratio" yang biasanya rasionya , atau . dibanding *. I%; mengenalkan suatu konversi metode signal to noise ratio ini, meskipun demikian I%; menggunakan , metode pilihan lain utnuk menentukan 6$8 yakni) metode non instrumental visual dan dengan metode perhitungan. Metode non instrumental visual digunakan pada teknik kromatogra&i lapis tipis dan metode titrimetri. 6$8 juga dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi !S8" respond dan kemiringan (slope, S) kurva baku pada level yang mendekati 6$8 sesuai dengan rumus, 6$8 D .,. !S8-S". standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi. .$ Batas Kuanti(i'asi (limit of quantification, /)0" >atas kuanti&ikasi dide&inisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Sebagaimana 6$8, 6$4 juga diekspresikan sebagai konsetrasi !dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan". Kadang-kadang rasio sinal to noise *3 )* digunakan untuk menentukan 6$4. erhitungan 6$4 dengan rasio signal to noise *3)* merupakan aturan umum, meskipun demikian perlu diingat bah+a 6$4 merupakan suatu kompromi antara konsentrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan. 1adi, jika konsentrasi 6$4 menurun maka presisi

juga

menurun.

1ika

presisi

tinggi

dipersyaratkan,

maka

konsentrasi 6$4 yang lebih tinggi harus dilaporkan. I%; mengenalkan metode rasio signal to noise ini, meskipun demikian sebagaimana dalam perhitungan 6$8, I%; juga menggunakan , metode pilihan lain untuk menentukan 6$4, yaitu ) !*" metode non instrumental visual dan !," metode perhitungan. Sekali lagi, metode perhitungan didasarkan pada standar deviasi respon !S8" dan slove !S". kurva baku sesuai dengan rumus ) 6$4 D *3 !S8-S". standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan standar deviasi blanko pada standar deviasi residual garis regresi liniear atau dengan standar deviasi intersep-y pada garis regresi. 1$ /inearitas 6inearitas dengan merupakan kemampuan apada suatu kisaran metode yang untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional konsentrasi analit diberikan. 6iniearitas suatu metode merupakan ukuran berapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon !y" dengan konsentrasi !C". liniearitas dapat diukur dengan melakuakn pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. 8ata yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan !slope", inntersep, dan koe&isien korelasinya. %ara perhitungan ketiga parameter ini adapat dilihat pada bab ,. !$ Kisaran (range"

Kisaran suatu metode dide&inisikan sebagai konsentrasi terndah dan tertinggi yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi, presisi, dan liniearitas yang mencukupi. Kisaran-kisaran konsentrasi yang diuji tergantung dari jnis metode dan kegunaannya. Untuk pengujian komponen utama !mayor", maka konsentrasi baku harus diukur di dekat atau sama dengan konsentrasi kandungan analit yang diharapkan. Suatu strategi yang baik adalah mengukur baku dengan kisaran ,G,G3,/G,*33,*,G, dan *G3H dari konsentrasi analit yang diharapkan. 2$ Ke'asaran (3eggedness" Kekasaran !?eggedness" merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh di ba+ah kondisi yang bermacam-macam yang diekspresikan sebagai persen standar deviasi relative !H ?S8". Kondisi-kondisi ini meliputi laboratorium, analis, alat, reagen, dan +aktu percobaan yang bebeda. Kekasaran suatu metode mungkin tidak akan diketahui jika suatu metode dikembangkan pertama kali, akan tetapi kekasaran suatu metode akan kelihatan jika digunakan berulang kali. Suatu pengembangan metode yang bagus mensyaratkan suatu evaluasi yang sistematik terhadap &actor-&aktor penting yang mempengaruhi kekasaran suatu metode. Strategi untuk menentukan kekasaran suatu metode akan bervariasi tergantung pada kompleksitas metode dan +aktu yang tersedia untuk melakukan validasi. enentuan kekasaran metode dapat di batasi oleh kondisi-kondisi percobaan yang kritis, misalkan pengecekan pengaruh kolom kromatogra&i yang bebeda !pabrik dan jenis yang sama" atau pengaruh-pengaruh operasionalisasi metode pada laboratorium yang berbeda. 8alam kasus seperti ini, semua &actor harus dijaga konstan seperti &ase gerak dan reagen-reagen yang digunakan. $ Ketahan (3obutness"

Ketahanan merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil. Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameterparameter metode seperti ) persentase pelarut organic, p;, kekutan ionic, suhu, dan sebagainya. Suatu praktek yang baik untuk mengevaluasi ketahanan suatu metode adalah dengan menvariasi parameter-parameter penting dalam suatu metode secara sistematis lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan. Sebagai contoh, jika suatu metode menggunakan asetonitril .FH-air sebagai &ase geraknya, maka seorang analis lalu menvariasi persentase asotonitrilnya menjadi misalkan ..,.F dan .2H lalu melihat pengaruhnya pada +aktu retensi analit yang diuji. 14$ Stabilitas Untuk memperoleh hasil-hasil analisis yang reprodusibel dan reliable, maka sampel, reagen dan baku yang digunakan harus stabil pada +aktu tertentu !misalkan * hari, * minggu, * bulan, atau tergantung kebutuhan". Sebagai contoh, suatu analisis untuk pengujian * sampel dapat membutuhkan *3 atau lebih perlakuan kromatogra&i< yakni untuk menentukan kesesuaian system, termasuk di dalamnya konsentrasi baku untuk membuat kurva baku dan juga untuk membuat , atau . kali reprikasi terhadap sampel yang akan diuji. 8engan demikan, untuk melakukan analisis suatu sampel saja dibutuhkan +aktu beberapa jam, karenanya selama anlaisis harus di pastikan bah+a sampel, ?eagan, dan pelarut yang digunakan stabil. Untuk urinalisis sampel dalam jumlah banyak, maka di butuhkan +aktu yang lebih lama lagi, sehingga stabilitas dapat menjadi &actor yang kritis pada validasi metode. Stabilitas semua larutan dan reagen sangat penting, baik ynag bekaitan dengan suhu atau yang bekaitan dengan +aktu. 1ika larutan tidak stabil pada suhu kamar, maka penurunan suhu hingga ,-A3c dapat meningkatkan stabilitas sampel dan standar. endingin dalam autosampel biasanya tersedia untuk keperluan ini. Stabilitas juga penting, terkait dengan +aktu

pengerjaan. Sebagai contoh, analisis secara gradient selama *33 menit tentunya membutuhkan &ase gerak dengan stabilitas yang lebih tinggi di bandingkan analisis secara isokratik selama G menit. Fase gerak haruslah dipilih sedemikian rupa sehingga menghindari masalah-masalah yang terkait dengan stabilitas. seabagai Setiap hari dengan menggunakan 9;F yang baru. >eberapa &ase gerak yang mengandung bu&er dapat mengakibatkan masalah, misalkan &ase gerak yang mengandung &os&at dan asetat akan mudah ditumbuhi bakteri, karena &os&at dan asetat merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikrobia. @atrium a:ida dengan konsentrasi 3,*H biasanya ditambahkan untuk menghindari pertumbuhan bakteri ini. enambahan pelarut organik dengan konsentrasi lebih dari * H juga merupakan cara yang e&ekti&. 11$ Kesesuaian Sistem Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan bah+a sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. ;al ini dapat dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem yang bah+a dide&inisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin dapat diterima.

metode tersebut dapt menghasilkan akurasi dan presisi yang ersyaratan-persyaratan kesesuaian sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan pengembangan metode dan validasi metode. Farmakope #merika !United States harmacopeia, US " menetukan parameter-parameter yang dapat digunakan untuk

menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis.

arameter-

parameter yang digunakan melalui ) bilangan lempeng teori !@", &aktor tailing, kapasitas !k5 atau J" dan nilai standar de&iasi relati& !?S8" tinggi puncak dan luas puncak dari serangkaian injeksi. ada umumnya, paling tidak ada , kriteria yang biasanya dipersyaratkan unutk menunjukkan kesesuaian sistem suatu metode. @ilai ?S8 tinggi puncak atau luas puncak dari G kali injeksi larutan baku pada dasarnya dapt diterima sebagai salah satu kriteria baku untuk pengujian komponen yang jumlahnya banyak !komponen mayor" jika nilai ?S8 K *H untuk G kali injeksi. Sementara untuk senya+a-senya+a dengan kadar sekelumit, nilai ?S8 dapat diterima jika antara G-*GH. Llemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji 'alidasi >aik US *. ,. .. (. US maupun I%; telah memperkenalkan bah+a tidak yang atau selamanya parameter untuk mengevaluasi validasi metode diuji. membagi metode-metode analisis kedalam kategori enentuan bahan akti&. enentuan pengotor !impurities) atau produk-produk hasil degradasi. enentuan karakteristik-karakteristik kinerja engujian identi&ikasi kuantitati& komponen-komponen utama terpisah yaitu )

5abel 1!$1$ 6lemen7elemen data 8ang dibutuh'an untu' u9i :alidasi (sumber : Swartz and Krull, 1 !"

Parameter Kiner9a Analisis #kurasi resisi Spesi&isitas 6$8 6$4 6inieritas Kisaran !range" ?uggedness

Pengu9ian 'ategori Pengu9ian 'ategori 1 % Kuantitat i( =a =a =a 9idak 9idak =a =a =a =a =a =a 9idak =a =a =a =a ;9i Batas M 9idak =a =a 9idak 9idak M =a

;9i 'ategori + M =a M M M M M =a

Untuk uji kategori *, evaluasi nilai 6$8 dan 6$4 tidak begitu penting karena komponen utama atau bahan akti& pada umumnya berada pada jumlah yang besar. 1ika yang diharapkan adalah engujian kategori , dapat dibagi in&ormasi kuantitati&nya, maka lagi menjadi , sub-kategori, yaitu analisis kuntitati& dan uji batas. parameter 6$8 tidak begitu penting., tetapi parameter yang lain dibutuhkan. Keadaan yang berla+anan berlaku untuk uji batas,

karena in&ormasi kuantitati&nya tidak dibutuhkan maka pengukuran 6$8, spesi&isitas, dan kekasaran sudah mencukupi. Untuk mengetahui elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi dapat diliha pada tabel */.*, sementara itu karakteristik validasi meurut I%; dan jenis prosedur analisisnya dapat dilihat pada tabel */., 5abel 1!$% Kara'teristi' Validasi dan 9enis *rosedur analisisn8a (sumber : Swartz and Krull, 1 ;9i Kemurnian Identi(i 'asi 9idak Kuantitati ( =a ;9i Batas 9idak Pengu9ian =a !"

<enis Prosedur Analisis #kurasi resisi ?epeatibilita s resisi antara Spesi&isitas 6$8 6$4 6inieritas

=a 9idak 9idak =a =a 9idak =a 9idak

=a 9idak 9idak 9idak

=a 9idak =a =a

=a =a 9idak 9idak

=a 9idak 9idak =a

Proto'ol Validasi Metode Suatu protokol validasi metode disajikan pada tabel */... contoh protokol ini adalah pengujian senya+a obat dalam sediaan tablet dengan K%K9 &ase terbalik. Meskipun demikian, prinsipprinsip umum dapat diaplikasikan untuk analisis yang lain dan metode yang lain, misalnya pengujian kemurnian suatu obat dengan K%K9, dan juga penentuan pengotor dalam jumlah sekemulit dengan K%K9 atau dengan kromatogra&i gas. 5abel 1!$+$ =ontoh *roto'ol Validasi Metode (Sumber:Sn8der etal, 1 !"

engujian komponen utama !bahan akti& dalam jumlah banyak" Suatu sediaan &armasi. S*esi(isitas *. Injeksikan sampel yang yang mengandung terkait dengan analit dan semua senya+a-senya+a analit. Senya+a-

senya+a ini juga meliputi kontaminan, reagen B reagen, prekusor sintetik, dan hasil-hasil degradasi yang paling mungkin ada dalam reaksi. Senya+a-senya+a yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai ?esolusi !?s" N ,

,. Injeksikan sampel dan bahan-bahan tambahan lain

!misalkan

yang digunakan dalam satu sediaan tabel". Semua senya+a yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai ?esolusi !?s" N , .. erlakukan bahan akti&-senya+a obat pada kondisi-kondisi berikut !supaya +aktunya e&isien" sehingga suatu obat akan terdegradasi *3 B .3 H ) a. ;%6 3,* @ !kondidi asam" b. @a$; 3,* @ !kondisi basa" c. 8ipanaskan sampai G3o% d. 8isinari dengan lampu ultraviolet e. 8itambah dengan larutan hidrogen peroksida . H 1ika kondisi-kondisi perubahan berlangsung sangat ekstrim !degradasinya I .3 H", maka &aktor-&aktor yang menyebabkan degradasi harus diturunkan. Kondisi-kondisi ekstrim harus dihindari, kecuali jika senya+a tersebut akan diperlakukan pada keadaan ekstrim. Semua senyawa yang dipisahkan dari puncak analit harus mempunyai esolusi ( s) ! " (. Kumpulkan puncak analit senya+a obat yang dituju, dan ) a. Sampel diinjeksikan kembali pada kromatogra&i yang berbeda !misalkan dengan K69, K0, elektro&oresis, dll" b. uncak dianalisis dengan menggunakan teknik spektra yang lain !I?, MS, @M?, dll" #idak ada $ukti munculnya senyawa lain% G. Kumpulkan puncak analit senya+a obat dalam . bagian !a+al, tengah, dan akhir" dan lakukan analisis lagi dengan K%K9.

F. ?ubahlah kondisi-kondisi metode K%K9 !persen pelarut organik dalam &ase terbalik, jenis pelarut, kemiringan gradien dalam elusi bergradien, suhu, kekuatan ionik dan atau bu&er" dan lihatlah puncak-puncak tambahan yang terpisah dari puncak analit. #idak ada $ukti munculnya ($entuk puncak) senyawa&senyawa tam$ahan% A'urasi /. Kedalam larutan matriks blanko suatu tablet !yang mengandung semua bahan tambahan kecuali senya+a obat" di- spiking dengan senya+a obat pada level G3, /G, *33, *,G, dan *G3 H dari target konsentrasi obat yang akan dianalisis. rosedur ini harus dilakukan paling tidak . kali menggunakan matriks blanko yang disiapkan secara terpisah dari senya+a obat dan lebih terpilih jika dilakukan , hari atau lebih. ;asil analisis dengan K%K9 harus dibandingkan dengan baku senya+a uji yang ditambahkan pada masing-masing level spiking. ata&rata perolehan kem$ali (recovery) analit harus antara '' ( )*)+ pada tiap level% /inieritas A. Karakteristik in haruslah dievaluasi sebagai bagian dari studi akurasi diatas. 6inieritas dapat diuji dengan menyiapkan larutan baku senya+a obat sendiri, lebih terpilih jika menggunakan &ase geraknya sebagai pelarut pada kisaran konsentrasi analisis rutin. Suatu kisaran yang diperluas dapat juga diuji !misalkan O

G3H dan I*G3H dari target konsentrasi analit" jika diharapkan untuk jenis analisis yang lain. ,etode harus menun-ukkan linieritas dalam kisaran yang diharapkan% .inieritas harus diukur dan dilaporkan se$agai suatu konstanta faktor respon pada kisaran pengukuran& pengukuran yang diharapkan% Presisi : Pengu'angan In9e'si 2. Siapkan larutan baku senya+a obat !lebih terpilih dalam pelarut &ase gerak". Injeksikan suatu sampel larutan baku paling sedikit *3 kali ! lebih terpilih jika dilakukan injeksi lebih dari *3 kali, misalkan .3 B (3 kali". ;itunglah respon masing-masing injeksi dan hitunglah ?S8-nya. @ilai standar deviasi relati& !?S8" respon K *,3 H Presisi *engulangan(antar *engu9ian" *3. Secara individual, siapkan larutan senya+a obat dengan konsentrasi yang berbeda-beda ! lebih terpilih dalam pelarut &ase gerak". Injeksikan masing-masing sampel . kali !lebih terpilih jika dilakukan injeksi lebih dari *3 kali, misalkan .3-(3 kali". ;itunglh respon masing-masing injeksi dan hitunglah ?S8nya. @ilai standar deviasi relati& !?S8" respon K ,,3H Presisi :antara **. Ujilah suatu sampel senya+a obat beberapa kali dalam kisaran +aktu yang berbeda, paling tidak dalam beberapa hari !lebih terpilih dalam pelarut &ase gerak". Uji juga larutan baku yang

sesuai dan gunakanlah kondisi percobaan yang sama akan tetapi analis, alat, dan lain-lain yang digunakan berbeda. ;itunglah presisinya. @ilai standar deviasi relati& !?S8" harus K,,3H Kisaran *,. Kisaran metode yang digunakan dapat ditentukan dari uji akurasi, linieritas, dan presisi diatas . /isaran harus mencakup semua level analisis rutin% .inieritas, akurasi, dan presisi harus sesuai dengan syarat&syarat yang dise$ut di atas untuk semua kisaran level% nilai uji masing-masing sampel dan hirunglah

Batas dete'si *.. 8engan lakukan misalkan menggunakan pengenceran dengan larutan dan ukur baku senya+a obat yang menghasilkan rasio signal to noise !S-@" paling sedikit .3, dengan metode analisis, hingga K%K9. 6anjutkan pengenceran

diperoleh rasio S-@ kurang lebih .. Batas 'uanti(i'asi *(. 8engan menggunakan larutan baku senya+a obat yang menghasilkan rasio signal to noise !S-@" paling sedikit .3, lakukan pengenceran sampel dan buatlah pengukuran berlipat !paling sedikit F kali injeksi masing-masing larutan yang konsentrasinya berbeda" dengan metode analisis, misalkan

dengan K%K9. 6anjutkan prosese ini sampai salah satu keadaan berikut terjadi ) a. ?asio S-@ kurang lebih *3 b. .H. Stabilitas *G. Stabilitas sampel. Siapkan larutan baku senya+a obat pada matriks tablet dan analisislah larutan yang sama beberapa kali. 1ika hanya stabilitas jangka pendek yang dikehendaki, maka analisis dilakukan dalam * hari. Stabilitas jangka panjang larutan sampel yang sama dapat ditentukan dalam beberapa hari atau beberapa kinggu. Sta$ilitas sampel harus mencukupi untuk dilakukannya metode analisis secara rutin di$awah kondisi perco$aan la$oratoriumyang normal *F. Stabilitas reagen. %ek stabilitas reagen-reagen yang kritis yang meliputi !tapi tidak hanya terbatas pada" ) a. c. elarut-pelarut 9ambahan-tambahan lainnya. reagen&reagen, pelarut&pelarut harus mencukupi b. >u&er-bu&er Sta$ilitas resisi !S8" terhitung untuk serangkaian F pengukuran K

untuk dilakukannya metode analisis secara rutin di $awah kondisi perco$aan la$oratorium yang normal% 3uggedness (Ke'asaran" */. 8engan cara yang serupa dengan studi stabilitas, larutan baku senya+a obat dengan matriks-nya harus dianalisis secara

sistematis dengan memvariasi kondisi-kondisi operasional. @ilai terukur senya+a obat dan pengaruh-pengaruhnya pada akurasi, presisi, dan &aktor-&aktor pemisahan harus dicatat. Kondisikondisi yang diuji harus mencakup !tapi tidak hanya terbatas pada") a. $perator-operator yang berbeda pada laboratorium yang sama b. #lat-alat yang berbeda pada laboratorium yang sama c. d. e. 6aboratorium-laboratorium yang berbeda engubahan sumber reagen dan pelarut engubahan kolom dengan yang baru !dengan jenis dan pabrik pembuat yang sama" ,etode harus cukup kasar terkait dengan semua parameter kritis sehingga memungkinkan untuk digunakan analisis secara rutin% 3obustness (Ketahanan" *A. ?ubahlah sedikit parameter-parameter pemisahan yang meliputi persentase pelarut organik !P , sampai G H", kemiringan gradien yang digunakan !dengan , sampai G H", suhu kolom !P * sampai Go%", p; bu&er !sampai P 3,G unit p;", kekuatan ionik bu&er, konsentrasi bahan-bahan tambahan dalam larutan bu&er dalam &ase gerak. Kromatogram yang representati& harus disiapkan untuk menunjukkan pengaruhpengaruh variabel yang diukur dibandingkan dengan kondisi normal. lotkan atau buatlah tabel hasil-hasil uji !&actor respon, nilai yang diukur,dll".

,etode harus cukup kuat terkait dengan semua parameter kritis sehingga memungkinkan untuk digunakan analisis secara rutin% Veri(i'asi Metode 'eri&ikasi metode pada dasarnya berbeda dengan validasi metode. 'eri&ikasi metode dilakukan pada semua metode standar !metode baku" atau metode yang telah divalidasi pada +aktu mulamula digunakan dan pada jarak +aktu tertentu secara berkala. 9ujuan veri&ikasi metode antara lain) Untuk memastikan bah+a analisis dapat menerapkan metode nalisis dengan baik. Untuk menjamin mutu hasil uji.

'eri&ikasi dilakukan dengan menetapkan presisi, akurasi, dan batas deteksi !jika perlu" pada suatu metode analisis. engujian berulang pada sampel yang ada engujian berulang pada sampel &ormulasi sintetik engujian berulang pada bahan rujukan berserti&ikat enetapan akurasi sampel dapat dilakukan dengan salah satu pengujian berikut) engujian sampel dengan penambahan baku !spiking" engujian sampel yang telah diketahui koposisinya, yang secara tepat meniru jenis sampel yang menggunakan metode ini. -A>5A3 P;S5AKA enetapan presisi dapat dilakukan dengan salah satu pengujian berikut)

!%?M"

#chmad, M dan #bdul, ?, !Lditor", ,33F, Pengantar /imia 0armasi 1nalisis2 3olumetri dan 4ravimetri, ustaka elajar, =ogyakarta. #damovics, 1. #., *22/, 5hromatographic 1nalysis of Pharmaceuticals, ,nd Ldition, Marcel 8ekker, @e+ =ork. #ninim, *22(, 0armakope Indonesia, Ldisi I', 8epartemen Kesehatan ?epubluk Indonesia, 1akarta. >asset, 1., 8enny, ?. %., 1e&&erry, 0. ;., and Mendham, 1., *22A, 3ogels #e6t$ook of Quantitative 5hemical 1nalysis, Fi&th Ldition, 6ongman Scienti&ic Q 9echnical, 1ohn Riley Q Sons Inc., @e+ =ork. >eckett, #;., and Stenlake, 1. >< *2/3, Practikal Pharmaceutical 5hemistri, ,nd Ld, ?obert %unningham and Sons 6td, US#. %lark, L. 0. %., *2/(, Isolation and Identification of 7rugs in Pharmaceutical, 8ody 0luid and pos&mortem material, 9he ress, 6ondon. %onnors, K. #., *2A,, 1 #e6t$ook of pharmaceutical 1nalysis, 1hon Riley and Sons, @e+ =ork. %serhati, 9. #nd Forgacs, L., *222, 5hromatography in 0ood science and #hecnology, 9echnomic ublishing, 6ancaster, >asel. harmaceutical

8ay, 1r, ?. #., and Under+ood, #. 6., *22A, Quantitative 1nalysis, Fth Ld., ditejemehkan oleh Iis Sopyan, enerbit #irlangga, 1akarta. Lckshlager, K., *2/,, 9rror ,easurements and 1nalysis, 'an @ostrand ?einhold %ompany 6td., 6ondon. esult on 5hemical