Anda di halaman 1dari 17

TUGAS KIMIA MEDISINAL MAKALAH CYCLOPAMINE SEBAGAI OBAT KANKER

Disusun oleh: Wenny Zuricha Z. Anggita Sekarsari Intan Mutiara Sari Hanifa Rozanah Prasetyo Hadi N. Raden Bayu Indradi Willi Tri Andika 260110100106 260110100107 260110100108 260110100109 260110100110 260110100112 260110100113

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN BANDUNG 2013

1. Sejarah Penemuan Obat Cyclopamine Pada pertengahan abad ke-20, anak-anak kambing pada peternakanpeternakan di negara bagian Idaho lahir dengan cacat kraniofacial yang parah. Anakanak kambing yang baru lahir di daerah Idaho terinfeksi hingga 25%. Tingkat keparahan cacat ini disebut holoprosencephaly yang bervariasi dari ekstrim cyclopia (hanya satu mata ditempatkan langsung di dahi, disertai dengan kelainan otak) hingga rahang atas yang agak pendek. Cacat lebih parah lagi yaitu tidak lengkap atau benarbenar tak terbagi belahan otak juga penciuman dan saraf optik. Pengembala domba yang terinfeksi meminta Departemen Pertanian untuk membantu ketika penyakit telah mencapai endemik dan kerugian ekonomi tidak lagi ditoleransi. Lynn F. James, salah satu ilmuwan yang diutus, tinggal bersama domba selama tiga musim panas di akhir 1950-an dan menemukan bahwa pada saat kekeringan domba pindah ke tempat yang lebih tinggi dan merumput pada tempat dengan bunga veratrum californicum yang tumbuh melimpah. Richard F. Keeler dari Laboratorium Penelitian Tanaman Beracun kemudian tahu hubungan antara konsumsi veratrum californicum oleh domba hamil dan kejadian cyclopia dalam keturunan mereka. Dengan makan veratrum californicum, menunjukkan bahwa cacat domba hamil tersebut diinduksi dari hari ke-14 kehamilan dan kehamilan itu diperpanjang hingga 87 hari (masa kehamilan domba sehat adalah 147-152 hari) Veratrum californicum, juga dikenal sebagai semacam tumbuhan California yang salah satunya adalah tumbuhan lili dari family melanthiaceae yang asli dari belahan bumi utara tetapi terutama berlimpah di daerah pegunungan barat Amerika Serikat.

2. Identifikasi Target Obat & Target Penyakit Cyclopamine mempunyai aktivitas baik

sebagai

antitumor

maupun

teratogenik. Kemampuannya ini secara khusus menghambat respon seluler terhadap jalur sinyal Hedgedog vertebrata. Jalur sinyal Hedgedog vertebrata memiliki peran

penting dalam mengontrol pertumbuhan, terutama selama proses perkembangan, tetapi seringkali aktif berlebih dalam pembentukan tumor.

Penerimaan sinyal Hh, yang melibatkan transmembran multipass (TM), protein Patched (PTCH) dan smoothened (Smo). Selama proses sinyal Hh normal, protein Hh mengikat ke PTCH, sehingga menurunkan penekanan PTCH mediasi dari Smo, sebuah jarak relatif reseptor G-protein-coupled (GCPRs). Aktivasi Smo kemudian memicu serangkaian peristiwa intraseluler, berpuncak pada aktivasi transkripsi Gli dependent. Cyclopamine berperan mengganggu sinyal pada peristiwa tersebut dengan mempengaruhi fungsi Smo, sebagai antagonizes Hh aktivitas jalur secara PTCHindependen dan melemahkan potensi terjadinya onkogenik, dengan mengangakat bentuk aktif dari Smo.

3. Membuat Prosedur Uji Reaksi utama yang mendasari biosintesis senyawa Cyclopamine yang merupakan senyawa alkaloid adalah reaksi mannich antara suatu aldehida dan suatu amina primer dan sekunder, dan suatu senyawa enol atau fenol. Biosintesis alkaloid juga melibatkan reaksi rangkap oksidatif fenol dan metilasi. Jalur poliketida dan jalur mevalonat juga ditemukan dalam biosintesis alkaloid. Kebanyakan alkaloid diendapkan dari larutan netral atau asam oleh sejumlah reagen yang mengandung logam berat seperti merkuri (Hg) platina (Pt), bismuth (Bi) dan emas (Au), dengan membentuk ikatan garam dengan mereka Untuk memperoleh cyclopamine secara tepat dan banyak dilakukan dengan mengisolasi cyclopamine dari tumbuhan Veratum californicum. Akar dari tumbuhan dibasahi dengan 5% ammonia tersebut dikeringkan terlebih dahulu sampai benarbenar kering. Kemudian cyclopamine dibiarkan pada suhu ruangan benzena. Penyimpanan dilakukan pada suhu 00C selama beberapa bulan sampai campuran alkaloid mengkristal. Pemurnian dilakukan dengan beberapa langkah rekristalisasi untuk

memberikan hasil sekitar 320 mg per kilogram kering akar. Oleh karena kebutuhan kita untuk cyclopamine dibutuhkan jumlah yang signifikan, dibutuhkan skala besar praktis skema isolasi. Untuk mengisolasinya digunakan ekstraktor sohxlet karena dirasa lebih efisisen untuk menghasilkan jumlah cyclopamine yang cukup besar. Analisis kromatografi cair - spektrometri massa (LC-MS) menunjukkan kemanjuran metode ini. Metode baru ini menunjukkan bahwa sedikit cyclopamine yang tetap berada didalam material tumbuhan setelah ekstraksi soxhlet mencapai sepuluh siklus. Prosedur ekstraksi ini juga memungkinkan untuk penentuan kuantitatif cyclopamine dari sumber alami. LC-MS secara kuantitatif menunjukkan bahwa akar dari Veratrum californicum berisi 2,34 g cyclopamine per kg bahan tanaman kering. Ekstraksi yang

dilakukan menggunakan dua ekstraktor soxhlet dihubungkan dengan dengan mantel pemanas, dengan benzena sebagai pelarut. Teknik soxhlet digunakan karena teknik ini merupakan suatu teknik ekstraksi berulang yang sangat efisien untuk digunakan. Hal ini dikarenakan pelarut yang telah membawa zat yang terekstrak, diuapkan, kemudian didinginkan, sehingga dapat digunakan lagi. Pelarut benzena digunakan dalam proses isolasi ini karena bila dilihat dari strukturnya cyclopamine merupakan suatu senyawa organik yang dapat larut dalam benzena. Langkah berikutnya dalam proses adalah untuk mengisolasi cyclopamine dari volume besar benzena. Ini dilakukan dengan melewatkan seluruh larutan benzena melalui kolom gelas yang diisi dengan silika gel. Analisis silika gel kromatografi lapisan tipis (TLC) menunjukkan bahwa benzena merupakan pelarut yang tidak cukup kuat untuk memindahkan alkaloid dari titik asal. Ini secara efektif memungkinkan untuk menjebak semua cyclopamine dari larutan benzena. Untuk tujuan ini, benzena dari kedua soxhlet telah ditambahkan ke puncak kolom silika gel dilengkapi dengan alat vakum untuk mempercepat pemisahan. Di vakum penyaringan volume benzena melewati kolom selama 45 menit. Proses ini menghasilkan alkaloid tanaman yang terkonsentrasi (termasuk

cyclopamine) di bagian atas kolom. Sebuah keuntungan luar biasa dari metode ini adalah bahwa benzena yang mengalir berisi begitu sedikit bahan dan bisa digunakan kembali berkali-kali sebelum langkah untuk pemurnian dengan redestilasi diperlukan. Untuk mempercepat kromatografi, kolom ini terhubung ke sumber vakum untuk menarik pelarut melalui kolom. Elusi dari alkaloid ini dilakukan dengan menggunakan langkah gradient CH2Cl2-isopropanol (97:3), CH2Cl2 -isopropanol (93:7), dan kemudian CH2Cl2-isopropanol (75:25). Penghilangan pelarut dari fraksi semi-murni mengandung cyclopamine terkonsentrasi dengan pengurangan tekanan.

Rekromatografi ekstrak ini dimurnikan dengan menggunakan aliran silika gel dengan etil asetat-iso-propanol-amonia (85:14:1) menghasilkan cyclopamine murni yang cukup untuk dipadatkan oleh triturasi dengan aseton dingin.

Sampel cyclopamine dianalisis melalui LC-electrospray ionisasi (ESI) yang dihubungkan dengan spektrometri massa (MS / MS) pada sebuah perangkap ion quadrupole spektrometer massa (LCQ Classic, Thermo-Finnigan, San Jose, CA) digabungkan ke Hewlett - 1100 Packard sistem HPLC. Sebuah kolom fasa terbalik 1,2 100 mm xterra MS C-18 3,5 m C-18 LC (Waters Corporation, Milford, MA) juga digunakan. Cyclopamine mengalir selama 30 menit, gradien dimulai dengan 10% asetonitril, 0,2% asam format sampai 70% acetonitril, 0,2% asam format mengalir dengan laju 100 L / menit dan pasca -kolom 1:10 split. Larutan blanko dianalisis antara sampel untuk membatasi carryover. Beberapa massa spektra juga diperoleh baik di Waters Micromass Misa ZQ dilengkapi dengan detektor Waters 600 HPLC fotodioda pompa dan detektor array atau pada Thermo Quantum TSQ Finnegan dilengkapi dengan Agilent 1100 seri sistem HPLC. Sistem HPLC ini digunakan untuk menganalisis apakah benar senyawa yang telah diisolasi tersebut merupakan cyclopamine yang benar-benar murni. 4. Mencari Lead Compound Beberapa penelitian telah dilakukan untuk memperoleh lead compound dari cyclopamine. Pertama, sintesis 17-asetil-5 - etiojerva-12 ,14,16-trien-13-ol dari bahan kimia sederhana telah dilaporkan oleh Johnson dkk. Kemudian Masamune, dkk, melaporkan mengkonversi cyclopamine relatif jervine, di mana karbon-11 metilena di cyclopamine dioksidasi menjadi keton dalam jervine. Wolff-Kishner, juga telah melaporkan suatu cara yaitu mereduksi jervine menghasilkan cyclopamine. Namun menghasilkan hasil yang relatif rendah. Oleh karena kebutuhan senyawa yang cukup besar untuk penelitian hewan dan mamalia sehingga perlu dipikirkan suatu metode yang lebih efisien untuk

mengekstrak

dan

memurnikan senyawa

cyclopamine

dari

akar

Veratrum

californicum. Serta suatu cara untuk menganalisis karbon dan resonansi proton dari cyclopamine. 5. Hubungan Aktivitas Struktur (SAR)

Dalam strukturnya, ternyata cyclopamine ini memiliki kelemahan antara lain ketidakstabilan cyclopamine sendiri dari struktur C12-C13 double bond. Sehingga dilakukan penelitian untuk mendapatkan struktur yang lebih baik lagi yakni derivate dari cyclopamine. Derivate pertama yaitu KAAD-cyclopamine dimana memiliki kelebihan yaitu memiliki kelarutan yang lebih baik dan meningkatkan aktivitas biologi sekitar 10-20 lebih baik. Sampai sejauh mana ikatan ganda nonconjugated di posisi C5-C6 ditransformasikan ke enon sesuai dalam kondisi fisiologis masih belum diselidiki

Ada juga derivate lain yaitu D-homocyclopamine. Infinity Pharmaceuticals menerbitkan pendekatan tahapan untuk derivatif D-homocyclopamine, yaitu derivatif dengan tujuh cincin D. Derivatif ini tidak mewarisi ketidakstabilan cyclopamine, karena aromatisasi oleh pembelahan sistem eter alil tidak dapat terjadi. Beberapa turunan dari jenis ini telah disintesis dan dipatenkan, dan profil biologis mereka telah ditentukan.

6. Identifikasi Farmakofor

Fitur Pharmacophoric adalah kode warna: hijau untuk kelompok akseptor ikatan hidrogen (HBA1-3) dan biru untuk daerah hidrofobik (Hy1-3). Atom-atom dengan kode warna: abu-abu: karbon, putih: hidrogen, merah: oksigen, biru: nitrogen dan kuning: sulfur.

HBA1 dan HBA3 diisi oleh hidroksil dan atom oksigen heterosiklik, masingmasing, sementara HY2 dan HY3 ditampung cincin jenuh beranggota enam pusat dan kelompok metil pada inti piperazine, masing-masing. Baik Hy1 maupun HbA2 yang dipasang oleh pharmacophore tersebut. 7. Desain Obat Untuk Pengoptimalan Interaksi Reseptor Pada penelitian Hamon Florian tahun 2010. Prodrug glukuronida pertama dari inhibitor sinyal Hedgedog cyclopamine telah disintesis. Derivatisasi karbamoil dari cyclopamine secara signifikan menurunkan toksisitas terhadap U87 sel line glioblastoma manusia. Ketika prodrug yang diinkubasi dengan -glukuronidase dalam media kultur, obat aktif secara efisien dirilis sehingga memulihkan aktivitas antiproliferasinya.

Prodrug Glucuronide Cyclopamine

Pemecahan Cyclopamine-glucoronide menjadi Cyclopamine Pada penelitian Martin et. al tahun 2008 melaporkan sintesis antagonis Hedgedog dari cyclopamine, yang mana senyawa tersebut disebut herein. Asam sensitif D-cincin cyclopamine tersebut homolog dengan berdasarkan penataan ulang urutan cyclopropanasi kemoselektif dan stereoselektif asam-katalis. Modifikasi lanjutan dari alkohol A / B-cincin homoalilik ke keton terkonjugasi menyebabkan penemuan analog cyclopamine baru dengan sifat pengobatan ditingkatkan dan potensi vitro (EC50) berkisar antara 10 sampai 1000 nM.

8. Drug Design-Optimizing Pharmacokinetic Properties IPI-269.609 merupakan turunan pertama dari cylopamine yang kemudian dikembangkan. Hal ini disebabkan karena cyclopamine menunjukkan afinitas yang rendah dari Smo (Smoothened), biovailibilitas oral yang buruk , farmakokinetik suboptimal , dan stabilitas metabolisme yang rendah. IPI-926 merupakan analog semisintetik dari cyclopamine,yang secara substansial meningkatkan potensi dan profil farmakokinetik terhadap cyclopamine, kemudian dirancang dan disintesis. Dengan menggunakan model rekayasa genetika yang dapat bekerja untuk mematikan kanker pankreas. IPI-269609 menghambat metastasis sistemik di orthotopic xenografts yang dibentuk dari jalur sel kanker pankreas manusia. 9. Toxicologycal & Safety Test Pada beberapa penelitian cyclopamine pada domba, pengamatan efek teratogenik diperlukan pada pemberian oral perhari 2-3 g / hewan (rata-rata berat badan pada hewan 50 kg; 40-60 mg/kg). kebutuhan akan dosis tinggi yang disebabkan karena sifat farmakokinetik atau potensi yang buruk, beberapa penelitian terbaru menunjukkan beberapa pencerahan pada kedua aspek tersebut. Pada domba, eliminasi waktu paruh pendek (1,1 1 jam) diukur ketika garam tartrat cyclopamine (1,6 mg / kg) diberikan secara intravena (iv). Sedangkan pada tikus, bioavailabilitas oral cyclopamine (memberikan respon sebanyak 33% relatif terhadap intraperitonieal untuk pengamatan ini). Hal ini menunjukkan kemungkinan buruknya pengamatan ini terhadap sifat farmasetika. Banyak tes seluler yang telah dikembangkan untuk mengevaluasi potensi inhibitor jalur Hh. Cyclopamine menghambat proses Hh-dependent termasuk :

(a) Induksi HNF3B pada embrio ayam dengan pengujian lempeng saraf (IC50 pada 10 nM) (b) Pengujian Gli-reporter (c) diferensiasi c3H10T1/2 (IC50 pada 300-400 nM) Sedangkan efek teratogenik dari cyclopamine dikaitkan dengan aktivitas ontarget pada Smo dan jalur Hh, adanya bukti bahwa cyclopamine mungkin tidak sepenuhnya selektif. Konsentrasi tinggi pada cyclopamine (10 M) menunjukkan adanya efek sitotoksik pada sel kanker yang tidak mengekspresikan Smo, hal ini memperlihatkan bahwa efek yang diamati yaitu off- target. 10. Chemical Development & Production Meningkatnya kebutuhan atas cyclopamine telah mengakibatkan peningkatan jumlah derivat cyclopamine semisintetik. Semua struktur cyclopamine-like sampai saat ini disintesis dari cyclopamine natural dengan modifikasi kimia dari produk naturalnya. Karena belum ada jalur sintesis total untuk mendapatkan cyclopamine, maka hingga saat ini belum ada cyclopamine dari hasil sintesis sintesis . a. KAAD Cyclopamin KAAD-Cyclopamine adalah derivate cyclopamine pertama yang menunjukkan kelarutan yang lebih baik dan meningkatkan potensi biologis pada faktor 10 20, didapatkan dalam lima langkah dari cyclopamine natural.

b. D-homocyclopamine Infinity Pharmaceutical memublikasikan pendekatan tahapan-tahapan untuk mendapatkan derivat D-homocyclopamine. Derivat ini tidak mewarisi sifat ketidakstabilan cyclopamine, karena aromatisasi dengan pemotongan pada sistem alil eter tidak dapat terjadi. Beberapa derivat dari sistem ini telah disintesis dan

dipatenkan., dan profil biologinya telah dideterminasi.

c. Analaog dari Turunan Estrone Analog cyclopamine yang disederhanakan telah dipreparasi dari estrone melalui empat tahapan oleh Winkler et al (2009). Struktur C-nor-D-homosteroid dihilangkan, piridin digunakan pada tempat cincin piperidin, dan fenol digunakan untuk menggantikan homoalil alkohol. Meskipun modifikasi ini mempunyai pengaruh yang besar terhadap struktur, polaritas, dan keasaman, aktivitas biologi masih tetap nyata.

11. Parenting and Regulatory Affairs Clinical Trials Cyclopamine saat ini sedang diteliti sebagai agen pengobatan pada sel basal carcinoma, medulloblastoma, rhabdomyosarcoma (tumor yang dihasilkan dari aktivitas Hh berlebihan), glioblastoma , dan sebagai agen pengobatan untuk multiple myeloma . Studi menunjukkan bahwa cyclopamine berperan sebagai inhibitor utama hedgehog signaling pathway dalam sel . Jalur ini di beri nama berdasarkan ligan untuk protein sinyal yang digunakan oleh sel untuk membantu sel tersebut bereaksi terhadap sinyal kimia eksternal . Jalur ini memiliki peranan penting dalam perkembangan embrio, yang mana ketika jalur ini tidak berjalan dengan semestinya dapat mengakibatkan cacat pada embrio. Aktivasi tidak semestinya dari jalur ini dapat memicu kanker pada orang dewasa, yang dapat menyebabkan sel basal carcinoma, kanker medulloblastoma, rhabdomyosarcoma, kanker prostat, pankreas, dan payudara. Cyclopamine bekerja dengan mengendalikan jalur ini dalam mengobati kanker. Uji klinik cyclopamine dilakukan kepada pasien kanker, dengan melihat aktivitas inhibisi terhadap hedgehog pathway. Dilihat juga efek farmakologi dari cyclopamine, termasuk farmakodinamik, farmakokinetik, efek terhadap reseptor, efek terapi dan efek samping dari cyclopamine tersebut. Selanjutnya dilihat metabolisme dari cyclopamine dan organ-organ yang terlibat didalamnya, serta clearence dari cyclopamine tersebut. Derivatif cyclopamine IPI - 926 (juga dikenal sebagai saridegib) sedang dalam tahap evaluasi uji klinis oleh Infinity Pharmaceuticals untuk pengobatan berbagai jenis kanker. Infinity Pharmaceuticals melakukan uji IPI - 926 dengan menggunakan gemcitabine (analog nucleoside yang digunakan dalam chemotherapy), dibandingkan dengan plasebo gemcitabine. Infinity Pharmaceuticals Inc

menghentikan Tahap 2 studi dari target obat untuk mengobati kanker pankreas

metastatik, setelah hasil awal pengujian menunjukkan titik akhir tujuan kelangsungan hidup secara keseluruhan tidak akan terpenuhi. Kombinasi IPI - 926 menunjukkan tingkat penyakit lebih tinggi daripada kombinasi plasebo, sedangkan kombinasi Infinity menunjukkan tingkat kelangsungan hidup rata-rata kurang dari enam bulan jika dibandingkan dengan gemcitabine saja. Sehingga hasilnya di anggap tidak efektif.

DAFTAR PUSTAKA Hampn et al. 2010. Study of a cyclopamine glucuronide prodrug for the selective chemotherapy of glioblastoma. European Journal of Medicinal Chemistry 45 : 1678-1682 Martin et al. 2008. Semisynthetic Cyclopamine Analogues as Potent and Orally Bioavailable Hedgehog Pathway Antagonists. J. Med. Chem 51 (21): 6646 6649. Matthew , Herper . 2005 . The Curious Case of The One-Eyed Sheep. Available online at http://www.forbes.com/global/2005/1128/066A.html [diakses tanggal 9 November 2013]. Oatis, Jhon E. Jr, dkk. (2008). Isolation, Purification, and Full NMR Assignments of cyclopamine from Veratrum californicum. Chemistry Central Journal, [Online], Vol 2 (1), 12 halaman Tersedia : http://journal.chemistrycentral.com/content/2/1/12 [11 November 2013] Philipp, H , Lito ,T, and Athanassions , G. 2010. Cyclopamine and Hedgehog signaling :Chemistry, Biology, Medical Perspectives. Angewandte Chemie Int. Ed. 49. 2-12. Underwood, A.L dan Day, R.A. (2002). Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Erlangga