1

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Leptospirosis adalah penyakit infeksi akut yang dapat menyerang manusia maupun hewan (zoonosis). Penyakit ini disebabkan oleh bakteri Leptospira yang merupakan bakteri aerob (termasuk golongan spirochaeta) yang berbentuk spiral dan bergerak aktif. Leptospirosis merupakan zoonosis yang paling banyak tersebar luas di dunia. Penyakit ini merupakan masalah kesehatan masyarakat di seluruh dunia, khususnya negara-negara yang beriklim tropis dan sub tropis yang memiliki curah hu an tinggi. !aktor iklim ditambah dengan kondisi lingkungan buruk merupakan tempat yang baik bagi kelangsungan

hidup bakteri patogen sehingga memungkinkan lingkungan tersebut men adi tempat yang cocok untuk hidup dan berkembangbiaknya bakteri Leptospira. Lingkungan optimal untuk hidup dan berkembangbiaknya bakteri Leptospira ialah pada tempat yang lembab yaitu pada suhu sekitar "#$%, serta p&

mendekati netral (p& sekitar '). Pada keadaan tersebut bakteri Leptospira dapat tahan hidup sampai berminggu-minggu. (enurut International Leptospirosis Society (ILS) )ndonesia merupakan negara peringkat * insiden leptospirosis di dunia untuk mortalitas, dengan mortalitas mencapai ",#+-1,,-# +. Pada usia lebih dari #. tahun kematian mencapai #,+. Penderita leptospirosis yang disertai selaput mata berwarna kuning (kerusakan aringan hati), akan memiliki risiko kematian lebih tinggi. /i beberapa publikasi angka kematian dilaporkan antara *+-#-+ tergantung dari

"

sistem organ yang terinfeksi. /aerah persebaran penyakit leptospirosis di )ndonesia yaitu di daerah dataran rendah dan perkotaan seperti Pulau 0awa, 1umatra, 2alimantan dan 1ulawesi Leptospira bisa terdapat pada binatang peliharaan seperti an ing, sapi, babi, kerbau, maupun binatang liar seperti tikus, musang, tupai dan lain-lain. Leptospira hidup di gin al dan air kemihnya. (anusia biasa terinfeksi bakteri Leptospira karena kontak dengan air atau tanah yang terkontaminasi oleh urin atau cairan tubuh lainnya dari hewan yang terinfeksi bakteri Leptospira. 1alah satu hewan yang dapat men adi reser3oir dari bakteri Leptospira adalah tikus. (enurut sur3ei yang dilakukan oleh /inas 2esehatan Propinsi 0awa 4engah yang dilakukan di 2abupaten /emak, 2laten dan Pati menemukan beberapa spesies tikus yang men adi reser3oir bakteri Leptospira. 0enis tikus yang diduga kuat men adi reser3oir bakteri Leptospira antara lain Rattus tanezumi, Rattus norvegicus dan S. murinus. 5akteri Leptospira yang masuk kedalam tubuh akan memperbanyak diri terutama di dalam hati, gin al, kelen ar mamae dan selaput otak. 2uman tersebut dapat ditemukan di dalam atau di luar sel-sel aringan yang terkena. Leptospira hidup dengan baik didalam tubulus gin al. Leptospira di dalam tubuh tikus, dapat bertahan selama hewan tersebut hidup tanpa menyebabkan sakit dan Leptospira akan dikeluarkan melalui urin dan mencemari lingkungan. Penentuan adanya bakteri Leptospira pada reser3oir atau tikus merupakan salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk mengendalikan penyebaran bakteri Leptospira sehingga penularan penyakit leptospirosis dari

tikus kepada hewan lainnya maupun kepada manusia dapat dicegah. 5erberapa cara identifikasi bakteri Leptospira pada tikus yang dapat dilakukan antara lain adalah dengan pengambilan serum darah maupun pengambilan organ tubuh tikus seperti gin al, hati maupun aringan lainnya. (etode yang dapat dilakukan untuk memeriksa adanya bakteri Leptospira pada organ tubuh tikus salah satunya dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). P%6 merupakan salah satu cara untuk memperbanyak /78 suatu organisme dengan menggunakan enzim polimerase yang diarahkan oleh potongan urutan /78 yang spesifik bagi /78 mikroorganisme tersebut. Potongan /78 yang urutannya spesifik bagi mikroorganisme dikenal dengan istilah probe yang berperan sebagai penyidik atau primer yang mengawali dan menuntun perbanyakan /78 tersebut. P%6 adalah teknik cepat untuk mengamplifikasi fragmen /78 spesifik secara in vitro dengan menggunakan " primer untai tunggal pendek. /engan teknik ini se umlah kecil fragmen /78 yang diinginkan akan diamplifikasi secara eksponensial sampai utaan kali dalam beberapa am. 5alai Penelitian dan Pengembangan (Litbang) Pengendalian Penyakit 5ersumber 5inatang (P"5") merupakan salah satu balai penelitian dan pengembangan yang melakukan berbagai akti3itas penelitian dan pengembangan mengenai penyakit bersumber binatang, salah satunya adalah penyakit leptospirosis. 5alai Litbang P"5" 5an arnegara memiliki beberpa instalasi, salah satunya adalah instalasi bakteriologi. Pemeriksaan bakteri Leptospira yang dilakukan di instalasi bakteriologi 5alai Litbang P"5" 5an arnegara dapat

dilakukan menggunakan suatu metode yang disebut Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan melalui pengambilan organ tubuh tikus (gin al tikus). (elalui P%6, dapat diketahui ada tidaknya bateri Leptospira pada organ tubuh tikus yang diperiksa dalam waktu yang singkat sehingga hasil yang dibutuhkan dapat segera diperoleh. Pemeriksaan bakteri Leptospira pada tikus dengan P%6 dilakukan melalui proses yang pan ang dan membutuhkan ketelitian serta keterampilan dari operator, sehingga dalam aplikasinya memiliki beberapa kelemahan dan kelebihan. 9leh karena itu, peneliti tertarik untuk mengetahui metode pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara.

B. Rumusan Masalah 5erdasarkan latar belakang diatas, dapat diambil suatu rumusan masalah bagaimana pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara.

C. Tujuan 1. 4u uan umum (endeskripsikan cara pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara.

". 4u uan khusus a. (endeskripsikan komponen-konponen yang dibutuhkan dalam

pemeriksaan bakteri Leptospira dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara. b. (endeskripsikan prinsip ker a pemeriksaan bakteri Leptospira dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara. c. (endeskripsikan Leptospira dengan kelebihan dan kekurangan pemeriksaan bakteri

metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang

dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara.

D. Kegunaan 1. 5agi (ahasiswa a. (emperoleh gambaran umum tentang cara pemeriksaan bakteri Leptospira dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang

dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara. b. (emperoleh wawasan tentang cara pemeriksaan bakteri Leptospira dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dilakukan di di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara. c. (emperoleh pengalaman ker a secara langsung sehingga dapat digunakan sebagai bekal bagi mahasiswa ketika akan memasuki dunia ker a.

". 5agi )nstitusi (agang

a. (eningkatkan hubungan ker a sama yang baik antara 5alai Litbang P"5" 5an arneegara dengan Politeknik 5an arnegara. b. (emberikan informasi dan umpan balik (Feed ac!) demi tu uan perbaikan di institusi magang.

BAB II TINJAUAN PU TAKA A. De!"n"s" Le#t$s#"r$s"s (enurut 7ingsih ("..:), Leptospirosis adalah suatu penyakit zoonosis yang disebabkan oleh mikroorganisme berbentuk spiral dan bergerak aktif yang dinamakan Leptospira. Penyakit ini dikenal dengan berbagai nama sepert i "ud #ever, Slime #ever (Shlamn#ie er), S$am #ever, %utumnal #ever, In#ectious &aundice, Field #ever, Cane cutter dan lain-lain.

'

7ama leptospirosis berasal dari bakteri penyebabnya yaitu Leptospira. Leptospira tersusun dari dua kata yaitu lepto yang berarti tipis, sempit dan spiril yang berarti terpuntir, seperti sekrup. Leptospira mempunyai pan ang ,-". ;m dengan lebar 1 ;m, sumber lain menyebutkan pan ang #-1# ;m dengan lebar .,1 ;m dapat bergerak aktif karena memiliki flagela dan hidup dalam kondisi oksigen bebas (aerobik). Leptospira mempunyai periplasmik flagela yang memungkinkannya untuk menembus aringan (7ingsih, "..:).

B. Bakter" Leptospira 1uratmaan ("..,), menyebutkan bahwa bakteri Leptospira termasuk dalam genus Leptospira, #amily Leptospiraceae, order Spirochaetales, Leptospira terdiri dari dua kelompok yang dibedakan berdasarkan se<uen /78 yaitu L. interrogans yang patogen dan L. i#le'a yang hidup bebas (non

patogen, saprofit). 7ingsih ("..:) menambahkan, saat ini meskipun telah dikenal se umlah 1, genom species Leptospira patogen berdasarkan keterkaitan /78-nya namun secara klinis dan epidemiologis klasifikasi Leptospira lebih didasarkan pada perbedaan serologi antar species. Leptospira patogen dibagi kedalam sero3ar berdasarkan komposisi antigennya. 1upriyanto ("..#) menambahkan bahwa reservoir Leptospira adalah hewan peliharaan dan binatang liar seperti tikus. Leptospira ada di dalam tubulus renalis binatang tersebut sehingga ter adi leptuspiruria seumur hidup binatang tersebut.

%. M$r!$l$g" Bakter" Leptospira

5akteri Leptospira adalah bakteri gram negatif, berbentuk pegas, langsing, lentur, tumbuh lambat pada kondisi aerob, tumbuh optimum pada suhu "=o%-*.o%, dengan ukuran pan ang #-"# ;m, diameter .,1-.,* ;m, dan pan ang gelombang .,# ;m. 5akteri Leptospira memiliki flagella internal yang khas, sehingga dapat menembus masuk ke dalam aringan. Leptospira memiliki struktur dua membran yang terdiri dari membran sitoplasma dan dinding sel peptidoglikan yang menempel satu sama-lain, dan dilapisi oleh lapisan bagian luar. Lipopolisakarida Leptospira mempunyai komposisi yang sama dengan bakteri gram negatif yang lain, tetapi mempunyai akti3itas endotoksik yang lebih rendah (1etiawan, "..=).

&. Reser'$"r Bakter" Leptospira &ewan - hewan yang men adi sumber penularan leptospirosis ialah rodent ( tikus ), babi, sapi, kambing, domba, kuda, an ing, kucing, serangga, burung, insekti3ora ( landak, kelelawar, tupai ), sedangkan rubah dapat sebagai karrier dari leptospira. 1alah satu hewan yang dapat men adi reser3oir bakteri Leptospira adalah tikus. 5eberapa enis tikus yang sering ditemui disekitar kita dan merupakan enis tikus yang berperan dalam penyebarab penyakit antara lain> a. 4ikus rumah (Rattus tanezumi) b. 4ikus riol atau Rattus norvegicus (5erkenhout)

Pan ang u ung kepala sampai ekor *..--.. mm, ekor 1'.-"*. mm, kaki belakang -"--' mm, telinga 1=-"" mm. 6umus puting susu *?* @ 1". Aarna rambut badan atas coklat kelabu, rambut bagian perut kelabu. 5anyak di umpai di saluran airBriolBgot di daerah pemukiman kota dan pasar. c. 4ikus ladang atau Rattus e'ulans (peale) Pan ang ukuran kepala sampai ekor 1*:-*,# mm, ekor 1.=-1-' mm, kaki belakang "--*# mm, telinga 11-"= mm. 6umus puting susu "?" @ =. Aarna rambut badan atas coklat kelabu, rambut bagian perut putih kelabu. 4erdapat di semak-semak dan kebunBladang sayur-sayuran dan pinggiran hutan. 2adang-kadang masuk ke rumah.

d. 4ikus belukar atatu Rattus tiomanicus (miller) Pan ang u ung kepala sampai ekor "-#-*:' mm, ekor 1"*-""# mm, kaki belakang "---" mm, telinga 1"-": mm. 6umus puting susu "?* @ 1.. Aarna rambut badan atas coklat kelabu, rambut bagian perut putih krem. 4erdapat di semak-semak dan kebun. e. 4ikus dada putih atau Rattus niviventer (bonhote) Pan ang u ung kepala sampai ekor 1='-*'. mm, ekor 1..-"1. mm, kaki belakang 1=-** mm, telinga 1,-*" mm. 6umus puting susu "?" @ =. 5erambut kaku. Aarna rambut badan atas kuning coklat kemerahan, rambut bagian perut putih. Ckor bagian atas berwarna coklat dan bagian

1.

bawah berwarna putih. 4erdapat di daerah pegunungan, semak-semak, rumpun bambu dan hutan. f. 4ikus sawah atau Rattus argentiventer (6obinson D 2loss) Pan ang u ung kepala sampai ekor "'.-*'. mm, ekor 1*.-1:" mm, kaki belakang *"-*: mm, telinga 1=-"1 mm. 6umus puting susu *?* @ 1". Aarna rambut badan atas coklat muda berbintik-bintik putih, rambut bagian perut putih atau coklat pucat. 4erdapat di sawah dan padang alang-alang. g. 4ikus wirok atau (andicota indica (5echstein) Pan ang u ung kepala sampai ekor -..-#=. mm, ekor 1,.-*1# mm, kaki belakang -'-#* mm, telinga ":-*" mm. 6umus puting susu *?* @ 1". Aarna rambut badan atas dan rambut bagian coklat hitam. 6ambutnya agak arang dan rambut di pangkal ekor kaku seperti i uk. 5anyak di umpai di daerah berawa, padang alang-alang, dan kadangkadang di kebun sekitar rumah. h. (encit rumah atau "us musculus Linnaeus Pan ang u ung kepala sampai ekor kurang dari 1'# mm, ekor =1-1.= mm, kaki belakang 1"-1= mm, telinga =-1" mm. 6umus puting susu *?" @ 1.. Aarna rambut badan atas dan rambut bagian perut coklat kelabut. 4erdapat di dalam rumah, dalam almari dan tempat menyimpan barang lainya.

C. D"agn$s"s Leptospira

11

/iagnosis Leptospira dapat dilakukan dengan pemeriksaan mikroskopik khusus untuk mendeteksi keberadaan bakteri Leptospira atau antigennya secara langsung. Pemeriksaan langsung meliputi kultur, mikroskopis, inokulasi hewan (immuno) staining dan reaksi polimerase berantai. Pemeriksaan langsung dengan isolasi bakteri leptospira patogen merupakan diagnosis pasti leptospirosis. 1elain itu uga ada pemeriksaan secara tidak langsung dan serologi.

%. Pemer"ksaan (akter" Le#t$s#"ra Pemeriksaan bakteri Leptospira dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain>

a.

Pemeriksaan mikroskopik dan immunostaining Pemeriksaan langsung dapat mendeteksi bakteri Leptospira dalam darah dan eksudat pleura, dalam minggu pertama sakit, khususnya antara hari ke-*-' dan di dalam urin pada minggu kedua, untuk didiagnosis definitif leptospirosis. 5akteri Leptospira dapat dilihat dengan mikroskop lapang gelap. Pengu ian dengan mikroskop medan gelap atau hapusan kental yang diwarnai dengan Eiemsa kadang-kadang memperlihatkan Leptospira di dalam darah segar pada infeksi awal.

b.

"icroscopic %gglutination )est ((84) (84 adalah pemeriksaan aglutinasi secara mikroskopik untuk mendeteksi titer antibodi aglutinasi, yang terdiri dari )g( atau )gE. (84

1"

merupakan baku emas pemeriksaan serologi kuman leptospirosis dan sampai saat ini belum ada u i lain yang lebih spesifik. c. Pemeriksaan molekuler Pemeriksaan molekuler dengan reaksi P%6 (Polymerase Chain Reaction) untuk mendeteksi /78 bakteri Leptospira spesifik dapat dilakukan dengan memakai primer khusus untuk memperkuat semua strain patogen. 6eaksi P%6 lebih cepat, sensitif dan spesifik serta lebih baik dibanding u i serologi dan bakteriologi. d. *nzyme Lin!ed Immunosor ent %ssay (*LIS%) F i CL)18 sering dipakai dan dapat dilakukan dengan reagen komersial maupun antigen yang dibuat sendiri. F i ini memakai suatu antigen yang bersifat spesifik pada genus, dapat mendeteksi antibodi kelas )g( dan )gE. 2euntungan u i CL)18 untuk mengetahui enis antibodi, apakah )g( dan )gE. 8ntibodi )g( merupakan prediksi leptospirosis sebagai infeksi akut, dan )gE untuk infeksi terdahulu. (eskipun demikian perlu diingat bahwa antibodi )g( kadang dapat menetap selama beberapa tahun. e. 1erologi dengan rapid test menggunakan dip+stic! 1aat ini dikenal ada dua enis rapid test yaitu Leptote! Lateral Flo$ dan Leptote! ,ri ,ot. Leptote! ,ri ,ot adalah alat diagnosis cepat untuk leptospirosis mengandung partikel lateG berwarna biru yang diakti3asi dengan antigen Leptospira yang berspektrum luas kemudian dikeringkan di atas kertas aglutinasi. Pengu ian didasarkan pada

1*

peningkatan antara antibodi spesifik Leptospira yang terdapat di dalam serum penderita dengan antigen Leptospira yang ada di kertas aglutinasi. 8pabila di dalam serum penderita memang terdapat antibodi yang spesifik Leptospira maka akan ter adi reaksi aglutinasi dengan antigen Leptospira sehingga terbentuk granula-granula dibagian tetesan. 4ingkat kepositifan dari skrining tergantung pada umlah antibodi spesifik dalam serum specimen yang berkaitan dengan stadium penyakit dan faktorfaktor lain.

f.

5iakan 1pesimen diambil sebelum pemberian antibiotik. &asil optimal bila darah, cairan serebrospinal, urin dan aringan segera ditanam ke media, kemudian dikirim ke laboratorium pada suhu kamar.

g.

)nokulasi hewan percobaan 5akteri leptospira 3irulen dapat menginfeksi hewan percobaan, oleh karena itu hewan yang dapat dipakai untuk isolasi primer bakteri Leptospira. Fmumnya dipakai golden hamsters (umur --, minggu) dan marmut muda (1#.-1'#g) yang bukan karier bakteri Leptospira. )solasi bakteri Leptospira dilakukan dengan cara biakan darah.

&. Jen"s am#el )ang D"gunakan untuk D"agn$s"s Le#t$s#"r$s"s

1-

0enis sampel yang biasa digunakan untuk diagnosis leptospirosis antara lain> a. /arah, yang diambil 1. hari pertama sakit yang dicampur heparin (untuk mencegah pembekuan) digunakan untuk pemeriksaan biakan. /arah untuk biakan sebaiknya diambil tidak lebih 1. hari sesudah serangan penyakit, karena Leptospira sudah menghilang dari peredaran darah. 1ampel untuk biakan harus disimpan dan diangkut dalam suhu ambien, karena temperatur yang rendah dapat merusak Leptospira patogen. b. /arah beku atau serum, sampel ini sebaiknya diambil dua kali dengan selang waktu beberapa hari, yaitu saat serangan penyakit dan sesudah ter adinya serokon3ersi. c. Frine untuk biakan, bakeri Leptospira umumnya cepat mati bila tercampur dengan urine. Frine yang akan digunakan untuk biakan mempunyai nilai tinggi, bila diperoleh dalam keadaan bersih. Frine diinokulasi ke dalam media biakan dalam waktu tidak lebih dari " am sesudah pengambilan. (asa hidup Leptospira di dalam urine yang asam dapat diperpan ang dengan menetralisasi urine tersebut. d. 1ampel postmortem (sesudah meninggal), pengambilan sampel ini adalah sangat penting dan diusahakan untuk mengambil dari berbagai organ dalam, termasuk otak, cairan sere-brospinal, cairan mata, paru, gin al, hati, antung, dan darah yang berada di dalam antung untuk pemeriksaan serologis. 1ampel postmortem harus diambil secepat mungkin secara aseptik. 1ampel yang sudah diambil harus segera diinokulasi ke dalam

1#

medium biakan, dan harus disimpan dan diangkut pada suhu H -o%. 4er adinya autolisis sel pada suhu H-o% dan penurunan p& harus dicegah, dan angan ditaruh pada suhu yang rendah. e. 1ampel cairan serebrospinal dan dialisat digunakan untuk biakan.

D. D"agn$s"s Leptospira *engan Polymerase Chain Reaction (PCR) P%6 merupakan salah satu cara untuk memperbanyak /78 suatu organisme dengan menggunakan enzim polimerase yang diarahkan oleh potongan urutan /78 yang spesifik bagi /78 mikroorganisme tersebut. P%6 adalah teknik cepat untuk mengamplifikasi fragmen /78 spesifik secara in 3itro dengan menggunakan " primer untai tunggal pendek. /engan teknik ini se umlah kecil fragmen /78 yang diinginkan akan diamplifikasi secara eksponensial sampai utaan kali dalam beberapa am. 1ecara umum proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi template, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal /78 target dan e'tension (peman angan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi /78 antara 1.,-1.: kali. 8danya penemuan /78 polymerase ()a- polymerase) yang stabil pada temperatur tinggi dan pengembangan alat yang mengatur temperatur proses P%6 secara otornatis, telah membuat P%6 dapat digunakan untuk u i-u i diagnostik secara praktis. /78 polymerase adalah enzim yang dapat mensintesis rantai

1,

/78 yang baru dan /78 yang sudah ada. Penemuan enzim yang tahan panas sangat membantu untuk mensintesis /78 baru, karena tahap awal proses P%6 dilakukan dengan cara pemanasan rantai /78 yang sudah ada pada temperatur :. $%. 6eaksi 6antai Polimerase atau Polymerase Chain Reaction (P%6) merupakan suatu teknik sintesis untuk mengamplifikasi atau melipatgandakan fragmen /78 target secara in vitro dengan eksponensial yang menggunakan primer atau pemula /78 yang tepat. 5erbeda dengan proses replikasi yang berlangsung secara diskrit untuk sepan ang rantai /78, maka pada proses P%6 reaksi ini ber alan kontinu, tetapi hanya untuk satu segmen tertentu sa a dari suatu /78. %. K$m#$nen+k$m#$nen PCR 2omponen-komponen yang diperlukan dalam pemeriksaan bakteri Leptospira dengan P%6 antara lain> a. 4emplate /78 4emplate /78 adalah molekul /78 untai ganda yang mengandung se<uen target yang akan diamplifikasi. Fkuran /78 bukan merupakan faktor utama keberhasilan P%6, berapapun pan angnya asalkan mengandung se<uen yang diinginkan. /78 berbentuk sirkuler sebaiknya dilinerkan lebih dulu sebelum proses P%6. 2onsentrasi /78 template harus dioptimasi. 0ika konsentrasinya terlalu rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target, sebaliknya bila terlalu

1'

tinggi akan meningkatkan kemungkinan mispriming. /isamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena akan mempengaruhi hasil reaksi. b. Primer 1usunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan P%6. Pasangan primer terdiri dari " oligonukleotida yang mengandung 1=-"= nukleotida dan mempunyai -.-,.+ E% content. 1e<uen primer yang lebih pendek akan memicu amplifikasi produk P%6 non spesifik. F ung *I dari primer penting dalam menentukan spesifitas dan sensiti3itas P%6, u ung ini tidak boleh mempunyai * atau lebih basa E atau %, karena dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik. /isamping itu, u ung *I dari kedua primer tidak boleh komplementer satu dengan yang lainnya karena hal ini akan mengakibatkan pembentukan primerdimer yang akan menurunkan hasil dari produk yang diinginkan. F ung #I primer tidak terlalu penting untuk annealing primer sehingga memungkinkan untuk menambahkan se<uen tertentu misalnya sisi restriksi enzim, start codon atau se-uen promoter. 1pesifitas P%6 sangat tergantung pada suhu melting (4m) primer, yaitu suhu dimana separuh umlah primer annealing pada template. &asil P%6 akan baik ika 4m kedua primer serupa (dalam "-o

%) dan diatas ,.o%. 2onsentrasi primer biasanya optimal pada .,1-.,#

i(. 2onsentrasi primer yang terlalu tinggi akan menyebakan

1=

mispriming (penempelan pada tempat yang tidak spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebailiknya bila konsentrasi primer terlalu sedikit maka P%6 men adi tidak efisien sehingga hasilnya rendah.

c. /78 polymerase /78 polymerase adalah enzim yang mengkatalis polimerasi /78. 5iasanya digunakan )a- polymerase (polymerase yang tahan panas) yang stabil pada suhu tinggi karena enzim ini diisolasi dari )hermus a-uaticus ()a-) yang hidup pada sumber air panas. 4a< adalah bakteri yang tetap mampu membelah diri dalam temperature tinggi sehingga enzim polimerasenya bersifat tahan panas. /engan menggunakan 4a< polymerase, tidak lagi dibutuhkan penambahan enzim pada setiap pemanasan pada denaturasi /78. Cnzim ini masih mempunyai akti3itas eksonuklease dari #I ke *I tetapi tidak mempunyai akti3itas eksonuklease dari *I ke #I. 2onsentrasi enzim yang dibutuhkan untuk P%6 biasanya .,#-",# unit. 2elebihan umlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non spesifik, sedanghkan ika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk yang diinginkan. d. ,eo'ynucleotide )riphosphate (d74P)

1:

Proses P%6 memerlukan semua macam d74P ( d84P, dE4P, d%4P dan d44P) sebagai bahan umtuk mensintesis untai /78 komplementernya. 2onsentrasi d74P masing-masing sebesar ".-".. i( menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifitas dan ketepatan P%6. 2onsentrasi masing-masing d74P harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan penggabungan. ,eo'ynucleotide )riphosphate akan menurunkan (g"? bebas sehingga mempengaruhi akti3itas polymerase dan menurunkan annealing primer. 2onsentrasi d74P yang rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non target dan menurunkan kemungkinan perpan angan nukleotida yang salah, oleh karena itu, spesifitas dan ketepatan P%6 meningkat pada konsentrasi d74P yang lebih rendah. e. 2onsentrasi (g"? 9ptimalisasi konsentrasi ion (g"? merupakan hal yang sangat penting. 2onsentrasi ion ini mempengaruhi beberapa hal antara lain> annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk P%6, spesifitas produk, pembentukan primer-dimer serta akti3itas dan ketepatan enzim. )on (g"? bebas akan mengikat /78 template, primer dan membentuk kompleks terlarut dengan d74P untuk membuat substrat yang akan dikenali oleh enzim )a- polymerase. P%6 harus mengandung .,#-",# i( (g"? dari total konsentrasi d74P. 2onsentrasi yang lebih tinggi akan meningkatkan produk P%6 tetapi menurunkan spesifitasnya. 2onsentrasi ion ini tergantung pada konsentrasi bahan-

".

bahan yang mengikatnya seperti d74P, C/48 (Cthylenediamine tetraacetic acid) dan fosfat.

&. Taha# Kerja PCR P%6 melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai /78 templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada /78 target dan peman angan (e'tension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh /78 polimerase. 1ecara prinsip, P%6 merupakan proses yang diulang-ulang antara ".J*. kali siklus. 5erikut adalah tiga tahap beker anya P%6 dalam satu siklus> a. 4ahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, :-J:, $%) ikatan hidrogen /78 terputus (denaturasi) dan /78 men adi berberkas tunggal. 5iasanya pada tahap awal P%6 tahap ini dilakukan agak lama (sampai # menit) untuk memastikan semua berkas /78 terpisah. Pemisahan ini menyebabkan /78 tidak stabil dan siap men adi templat bagi primer. /urasi tahap ini 1J" menit. b. 4ahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian /78 template yang komplementer urutan basanya. )ni dilakukan pada suhu antara -#J,. $%. Penempelan ini bersifat spesifik. 1uhu yang tidak tepat menyebabkan tidak ter adinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. /urasi tahap ini 1J" menit.

"1

c. 4ahap peman angan atau elongasi. 1uhu untuk proses ini tergantung dari enis /78 polimerase yang dipakai. /engan )a-+polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu '" $%. /urasi tahap ini biasanya 1 menit.

BAB III ANALI I ITUA I UMUM DAN KHU U PADA UNIT KERJA

A. Anal"s"s "tuas" Umum 1. Profil )nstansi a. 7ama )nstansi > 5alai Lit5ang P"5" 5an arnegara b. 8lamat instansi > 0alan 1elamanik no. 1, 5an arnegara ". 1e arah 1ingkat 5alai Litbang P"5" 5an rnegara 5alai Litbang P"5" merupakan salah satu instansi kesehatan yang melaksanakan program penelitian dan pengembangan serta program pencegahan dan pengendalian terhadap 3ektor dan reser3oir terutama penyakit bersumber binatang serta program kesehatan lain. Kektor-3ektor penyakit yang diteliti dan dikembangkan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara antara lain 3ektor penyakit (alaria, /emam 5erdarah dan !ilariasis (Eotama, "..-).

""

5alai Litbang P"5" membawahi wilayah ker a tertentu dan mempunyai bidang-bidang kegiatan dalam rangka penelitian, pengembangan dan pencegahan penyakit yang bersumber dari binatang. Ailayah ker a 5alai Litbang P"5" 5an arnegara adalah seluruh )ndonesia. 5idang kegiatan tersebut antara lain pembiakan binatang-binatang yang men adi 3ektor penyakit (baik binatang pengerat, parasit, serangga maupun molusca), usaha penagkapan dan pengamatan secara langsung terhadap lokasi yang mengalami ke adian dan dicurigai sebagai sumber munculnya penyakit, pengendalian dan terhadap binatang 3ektor penyakit, penelitian dan pelaporan kasus (Eotama, )ndra).

Eambar *.1 1e arah 5alai Litbang P"5" 5an arnegara

1e arah 5alai Litbang P"5" 5an arnegara yaitu dari Proyek Intensi#ication o# Communica le ,isease Control . %sian ,evelopment (an! ()%/%-8/5) yang dimulai pada tahun 1::=, yaitu suatu proyek itensifikasi Pemberantasan Penyakit (enular ()PP() yang meliputi penyakit (alaria, )1P8, 45% dan Penyakit yang /apat /icegah /engan )munisasi (P/*)).

"*

Proyek )%/%-8/5 ini dilaksanakan di enam propinsi yaitu> 0awa 5arat, 0awa 4engah, 1umatera 1elatan, 2alimantan 1elatan, 1ulawesi 4engah dan 7usa 4enggara 4imur. Proyek ini terdistribusi "1 2abupaten di enam Pro3insi tersebut. Euna menun ang upaya menurunkan ke adian malaria di daerah )%/%-8/5 maka dibangun institusi penun ang proyek bernama 1tasiun Lapangan Pemberantasan Kektor (1LPK) di enam Pro3insi, salah satunya di Pro3insi 0awa 4engah, 1LPK ini berkedudukan di 5an arnegara Pro3insi 0awa 4engah dengan %nnual Parasite Incidence tertinggi diantara empat kabupaten pelaksana proyek )%/%-8/5 lainnya di 0awa 4engah, yaitu> 5an arnegara, 0epara, 2ebumen, dan Pekalongan. 1LPK ini secara adminstratif bertanggung awab kepada 2anwil /epartemen 2esehatan Pro3insi 0awa 4engah, tetapi secara teknis kepada 2epala /irektur Pemberantasan Penyakit 5ersumber 5inatang (P"5"). 1LPK 5an arnegara mulai beroperasi tanggal 1# 8gustus 1::: yang menempati rumah kontrakan di 0alan 8l (unawaroh 7o. 11 5an arnegara sampai dengan bulan 1eptember ".... Eedung baru kemudian dibangun di atas tanah Pemda 5an arnegara dengan luas tanah 1*,. m ". Pembangunan gedung mulai tanggal , 0anuari "... dan selesai tanggal * (ei ".... 2emudian baru ditempati se ak tanggal 1- 1eptember ".... 5erlakukannya FF 7o. "" 4ahun 1::: tentang Pemerintahan di /aerah, 1LPK tidak diintegrasikan ke dalam /inas 2esehatan Pro3insi, tetapi masih merupakan FP4 Pusat dibawah 5adan Litbangkes bernama FP!-

"-

PK6P. &al ini dimaksudkan agar 1LPK dapat bermanfaat lebih luas bagi kabupatenBpro3insi lain di luar 0awa 4engah. /engan berakhirnya Proyek )%/%-8/5 aset FP!-PK6P yang ada di Pro3insi harus diberdayakan. Fntuk itu oleh 5adan Litbangkes dan dibantu oleh /it en PP(-PL diusulkanlah kelembagaan FP!-PK6P kepada (enpan. /engan persetu uan (enpan, (enteri 2esehatan dengan 12 7omor> 1-.,B(C72C1B12B)LB"..*, tanggal> *. 1eptember "..* menetapkan kelembagaan FP!-PK6P di enam Pro3insi men adi Loka Litbang P"5". (eru uk Peraturan (enteri 2esehatan 7omor> =:-B(enkesBPerB)LB"..=, Loka Litbang P"5" 5an arnegara mempunyai Fnggulan Penelitian dan Pengembangan di bidang Penyakit 5ersumber 6odensia. (elalui Permenkes :".B(C72C1BKB".11 Loka Litbang P"5" 5an arnegara ditingkatkan status kelembagaannya men adi 5alai Litbang P"5" 5an arnegara, * (tiga) 5alai Litbang P"5" di lingkungan 2ementerian 2esehatan yaitu yang berlokasi di /onggala 1ulawesi 4engah, 5an arnegara 0awa 4engah dan 4anah 5umbu 2alimantan 1elatan (5alai Litbang P"5"). *. Kisi, (isi, 4ugas dan !ungsi a. Kisi 1ebagai centre o# e'cellence penelitian dan pengembangan penyakit bersumber binatang, khususnya penyakit bersumber rodensia. b. (isi

"#

1) (enghimpun, mengka i, mengembangkan, dan menyebarkan informasi )P4C2 tentang 3ektor, reser3oir, bionomik serta dinamika penularan P"5". ") (eningkatkan profesionalisme 1/( dalam bidang pengamatan dan pengka ian 3ektor, reser3oir dan dinamika penularan serta cara pengendaliannya. *) (enggalang dan mengembangkan kemitraan lintas program dan sektor terkait dalam pengamatan dan pengka ian 3ektor dan reser3oir serta dinamika penularan penyakit. c. 4ugas (elaksanakan Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit 5er sumber 5inatang. d. !ungsi 1) Penyusunan rencana dan program penelitian dan pengembangan pengendalian penyakit bersumber binatang. ") Pelaksanaan ker asama penelitian dan pengembangan pengendalian penyakit bersumber binatang. *) Pelaksanaan monitoring, e3aluasi dan penyusunan laporan penelitian dan pengembangan pengendalian penyakit bersumber binatang. -) Pelaksanaan penelitian dan pengembangan pengendalian penyakit sesuai keunggulannya. #) Penentuan karakteristik epidemiologi penyakit bersumber binatang

",

,) Pengembangan metode dan teknik pengendalian penyakit bersumber binatang. ') Pengelolaan sarana penelitian dan pengembangan pengendalian penyakit bersumber binatang serta pelayanan masyarakat. =) Pengembangan e aring informasi dan ilmu pengetahuan teknologi kesehatan. :) Pelaksanaan diseminasi dan promosi hasil-hasil penelitian dan pengembangan pengendalian penyakit bersumber binatang. 1.) Pelaksanaan urusan ketatausahaan dan kerumah tanggaan. -. 2edudukan 5erdasarkan Permenkes 7o.:".B(enkesBPerBKB".11 > 5alai Penelitian dan Pengembangan Pengendalian Penyakit 5ersumber 5inatang yang selan utnya disebut 5alai Litbang P"5" adalah Fnit Pelaksanan 4eknis di Lingkungan 5adan Penelitian dan Pengembangan 2esehatan 2ementerian 2esehatan. 5alai Litbang P"5" berada di bawah dan bertanggung awab kepada 2epala 5adan Penelitian dan Pengembangan 2esehatan, secara administratif dibina oleh 1ekretaris 5adan Penelitian dan Pengembangan 2esehatan dan secara 4eknis !ungsional dibina oleh pusat yang bersesuaian (Pusat 4eknologi )nter3ensi 2esehatan (asyarakat). #. 2emampuan /alam melaksanakan fungsinya 5alai Litbang P"5" ban arnegara didukung oleh> a. 1/(

"'

1umber daya manusia yang dimiliki oleh 5alai Litbang P"5" 5an arnegara terdiri dari beberapa orang yang bertugas sebagai 2etua, 2asie P21, 2asie Manlit, 5endahara, Peneliti, 2epala 1ub 5agian 4ata Fsaha, 1taff 4eknis, 1taff 8dministrasi, 4eknisi Litkayasa, Pramubakti, 1atpam dan Pranata lab. 0umlah masing-masing bagian tersebut dapat dilihat pada table dibawah ini> 4abel *.1 /aftar 2eadaan Pegawai di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara Per /esember ".11
7o 1 " * # , ' = : 1. 11 1" 2edudukan 2epala 5alai 2asie P21 2asie Manlit Peneliti 2epala 1ub 5agian 4ata Fsaha 5endahara 1taff 4eknis 1taff 8dministrasi 4eknisi Litkayasa Pramubakti 1atpam Pranata Lab 0umlah (orang) 1 1 1 # 1 1 1# , * , = :

b. 1arana dan Prasarana yang /imiliki 1) Eedung 2antor L" dan tiga rumah dinas ") 2endaraan > a) 4iga unit kendaraan roda - > &iline, Panther, 83anza b) /ua unit kendaraan roda " > &onda 1upra L 1"#, 1uzuki 41 1"# *) Eedung Laboratorium> a) Lab. Cntomologi

"=

b) Lab. Parasitologi c) Lab. 6odentologi d) Lab. 5akteriologi e) Lab. Cpidemiologi D 5iostatistik (EP1, P/8) -) 1arana 4eknologi informasi > L87, )nternet ((odem 8/1L, (odem F15, (odem #, 2bps, E)1) #) Peralatan 842 > mesin ketik, mesin foto copy, printer, mesin hitung elektronik ,) Personal komputer "* unit dan # buah komputer note book ') 1arana presentasi (%amera digital, %amera manual 1L6, &andycam, (ini /K, 9&P, L%/ vie$er, Slide Proye!tor, (anner, Sound System, /K/ Recorder , /K/ Player) =) Eedung (ultimedia (Layar lebar, Sound System, /K/ Recorder , /K/ Player, 4K ": inchi) :) 2apasitas (eeting 1.. orang 1.) 6uang kelas kapasitas =. orang 11) 6uang 6earing (tempat pengembangbiakan nyamuk) 1") 4empat pengembangbiakan mencit ("us musculus albino) 1*) 6uang Perpustakaan (? *.. udul buku, urnal, buletin, ma alah, K%/ tutorial) 1-) /reen 0ouse (4anaman pengusir nyamuk) 1#) (usholla 1,) 2andang 4ernak untuk umpan nyamuk peliharaan

":

c. 2emampuan /an 6encana Laboratorium 5akteriologi 1. ". Pemeriksaan air untuk bakteri Leptospira Pemeriksaan darah untuk deteksi awal leptospirosis dengan menggunakan Rapid ,iagnosti! )est 1 Lepto )e! ,ridot 2 Lateral Flo$ *. -. #. ,. '. Pemeriksaan (84 ("i!roscopi! %glutination )est) Pemeriksaan fisik dan kimia air Pemeriksaan bakteri 3ersinia pestis (pes) pada rodent (elakukan culture aringan bakteri Leptospira pada rodent (elakukan kultur aringan bakteri 3ersinia pestis (pes) pada organ rodent d. 2emampuan kegiatan yang telah dilakukan 1) ") *) -) #) ,) Pengumpulan /ata /asar (alaria, /5/, !ilaria, Leptospirosis, Pes 1ur3ei Cntomologi, 6odentologi, Parasitologi 1pot 1ur3ei /aerah !okus 4inggi 1ur3ei P1P (Pengetahuan, 1ikap, Praktek) 1ur3ei Pemetaan (E)1) (elakukan 2egiatan Laboratorium (Rearing 7yamuk, 2olonisasi "us musculus albino, Pemeriksaan &b, dan lain-lain) ') (ioassay > Pasca Penyemprotan )61, 2elambu berinsektisida

*.

=) :)

2onfirmasi Laboratorium /i Puskesmas Cndemis /esiminasi B )nformasi &asil 2egiatan (Ckspo, 5uletin, !orum )lmiah)

1.) Penyuluhan P"5" (Lea#let, (oo!let, (anner, K%/, 6eplika nyamuk) 11) (elakukan Penelitan /alam 5idang /alam 5idang P"5" 1") Peningkatan 1umber /aya (anusia 5idang Cntomologi, Parasitologi, 6odentologi (etodologi Penelitian dan 8dministrasi 1*) (elakukan 1ur3ei Cpidemiologi di /aerah 2L5 1-) 2emitraan dengan Lintas 1ektor

B. Anal"s"s "tuas" Khusus 5alai Litbang P"5" 5an arnegara merupakan salah satu balai penelitian dan pengembangan yang melakukan kegiatan dalam upaya pengendalian penyakit bersumber binatang. &al tersebut didasarkan adanya berbagai macam penyakit yang disebabkan oleh binatang-binatang baik secara langsung, sebagai 3ektor dari suatu in#ectious agent yang dapat ditularkan dari manusia yang sakit kepada manusia yang sehat maupun sebagai reser3oir dari suatu agent penyakit. /alam rangka mendiagnosis suatu penyakit, 5alai Litbang P"5" 5an arnegara memiliki suatu instansi khusus yaitu instalasi bakteriologi. )nstalasi bakteriologi. 8dapun kegiatan-kegiatan yang dilakukan pada instalasi

bakteriologi antara lain > Pemeriksaan air untuk bakteri Leptospira, pemeriksaan darah untuk deteksi awal leptospirosis dengan menggunakan Rapid ,iagnosti! )est 1 Lepto )e! ,ridot 2 Lateral Flo$, pemeriksaan "%) ("i!roscopi! %glutination )est), pemeriksaan fisik dan kimia air, pemeriksaan bakteri 3ersinia

*1

pestis (pes) pada rodent dan melakukan culture aringan bakteri Leptospira dan 3ersinia pestis (pes) pada rodent. )nstalasi bakteriologi ikelola oleh seorang koordinator, " orang staff dan seorang pranata lab. 1truktur organisasi pada instalasi bakteriologi dapat dilihat pada diagram berikut ini>

2epala 5alai 5udi 1antoso, 12(, (. 2es

2asubag 4F 8syhar 4unissea, 12(, (. 2es

2oordinator /yah Aidiastuti 1. 1i. (.1c

1taff Cndang 1etyani, 8(82 8snan Prastawa, 12(

Pranata Lab 5arata Aella 8rdhany

Eambar *." 1truktur 9rganisasi )nstalasi 5akteriologi

1alah satu kegiatan yang dilakukan di instalasi 5anteriologi adalah pemeriksaan bakteri Leptospira dengan metode Polymerase Chain Reaction

(PCR). P%6 merupakan salah satu cara untuk memperbanyak /78 suatu organisme dengan menggunakan enzim polimerase yang diarahkan oleh potongan urutan /78 yang spesifik bagi /78 mikroorganisme tersebut.

*"

BAB I, IDENTI-IKA I. PERUMU AN MA ALAH DAN PRI/RITA MA ALAH A. I*ent"!"kas" Masalah 4elah lama diketahui bahwa sifat-sifat makhluk hidup termasuk bakteri dibawa oleh material kimiawi yang dikenal sebagai ,eo'yri onucleic acid (/78). /78 berberntuk seperti benang yang saling melilit seperti spiral, membentuk pita heliG rangkap dimana setiap pita merupakan rangkaian pan ang dari molekul nukleotida. (asing-masing nukleotida tersusun atas gugus basa, yaitu %denin (8), Cytosin (%), /uanin (E) dan )hymine (4), gugus dioksiribose dan gugus fosfat. Pita atau rangkaian pan ang dalam satu alur terbentuk akibat ikatan ko3alen antar nukleotida melalui gugusan dioksiribose dan gugusan fosfatnya. 7ukleotida dalam alur yang berhadapan dihubungkan melalui gugus basa masing-masing nukleotida, dimana hubungan tersebut hanya akan ter adi antara 8 dengan 4 dan % dengan E. 1intesis /78 ter adi pada mitosis dan membutuhkan enzyme /78 polymerase. P%6 merupakan salah satu cara untuk memperbanyak /78 suatu organisme dengan menggunakan enzim polimerase yang diarahkan oleh potongan urutan /78 yang spesifik bagi /78 mikroorganisme tersebut. Potongan /78 yang urutannya spesifik bagi mikroorganisme dikenal dengan istlah probe karena berperan sebagai penyidik atau primer yang mengawali dan menuntun perbanyakan /78 tersebut.

**

)nstalasi bakteriologi pada 5alai Litbang P"5" 5an arnegara merupakan instalasi yang memiliki kegiatan untuk melakukan pemeriksaan bakteri Leptospira. 5akteri Leptospira dapat ditemukan pada organ dalam tikus, salah satunya adalah gin al tikus. Pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus di instalasi bakteriologi dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Pada proses P%6, terdapat beberapa proses seperti proses denaturasi dengan pemanasan :..% J :#.% yang dimaksudkan untuk memisahkan untai template /78. 1uhu denaturasi dipengaruhi oleh se<uen target, ika se<uen target kaya akan E-% maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. 1uhu denaturasi yang terlalu tinggi dan atau waktu denaturasi yang terlalu lama akan mengakibatkan hilangnya akti3itas enzim. Aaktu paruh adalah N " am pada suhu :",#.%, -. menit pada suhu :#.% dan # menit pada suhu :',#.%. Proses selan utnya adalah annealing primer yang dimaksudkan untuk proses penempelan primer pada se<uen target /78. 1uhu dan lamanya waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer tergantung pada komposisi basa, pan ang dan konsentrasi primer. 1uhu annealing biasanya #.% dibawah nilai 4m primer, yang berada pada range ##.%-'".%. Proses terakhir adalah e'tension, suhu e'tension ditu ukan untuk proses perpan angan se<uen /78. 1uhu e'tension yang rendah bersamaan dengan konsentrasi d74P yang tinggi akan

mengakibatkan mise'tension primer dan perpan angan nukleotida yang salah, sebaliknya kombinasi antara suhu annealing 2 e'tension yang tinggi dengan konsentrasi dntp yang rendah akan menghasilkan ketepatan produk akhir P%6

*-

yang tinggi. Lamanya waktu e'tension tergantung pada pan ang se<uen target, konsentrasi se<uen target dan suhu e'tension. 0umlah siklus yang optimum terutama tergantung pada konsentrasi awal /78 template saat parameter lain telah dioptimasi, biasanya adalah "#-*# siklus. 1iklus yang terlalu sedikit akan memberikan hasil yang sedikit, sebaliknya bila terlalu banyak akan meningkatkan umlah dan kompleksitas produk non spesifik. /eteksi produk amplifikasi dapat dilakukan dengan 3isualisasi menggunakan alat elektroforesis. /eteksi produk amplifikasi dapat dilakukan dengan 3isualisasi

menggunakan elektroforesis gel agarosa yang hasilnya dapat dilihat pada gel documentation.

B. Perumusan Masalah 5erdasarkan identifikasi masalah diatas, dapat diambil suatu perumusan masalah bagaimana pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus dengan metode Polymerase %hain 6eaction (P%6) di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara.

C. Pr"$r"tas Masalah 4ikus merupakan salah satu reser3oir dari bakteri Leptospira yang dapat menyebabkan penyakit leptospirosis. 2eberadaan bakteri leptospira pada tikus dapat berada pada organ-organ dalam seperti pada aringan dan sel. Pada aringan, bakteri leptospira dapat hidup pada organ gin al. Pemeriksaan bakteri Leptospira pada organ gin al tikus dapat dilakukan melalui metode Polymerase Chain

*#

Reaction (PCR). 5erdasarkan hal tersebut, dapat diambil suatu proiritas maslah mengenai tahapan-tahapan dalam pemeriksaan bakteri Leptospira dengan P%6 yang dilakukan melalui beberapa kegiatan, antara lain pembuatan /78, komponen dan proses P%6 pada mesin thermocycler, pembuatan agar, proses elektroforesis dan pembacaan hasil P%6 pada gel documentation serta kelebihan dan kekurangan pemeriksaan molecular dengan metode P%6.

BAB , PEMBAHA AN

*,

1alah satu perkembangan teknik biologi molekuler yang sangat membantu dalam pengembangan u i-u i diagnostik adalah P%6. P%6 dapat mengamplifikasi /78 dan umlah yang sedikit men adi umlah yang dapat dideteksi (banyak). 5alai Litbang P"5" 5an arnegara memilki instalasi bakteriologi yang salah satu kegiatannya adalah melakukan pemeriksaan bakteri Leptospira pada rodent (tikus). Pemeriksaan bakteri Leptospira pada tikus dapat dilakukan dengan pengambilan spesimen aringan berupa gin al tikus. Pemilihan organ gin al untuk deteksi bakteri Leptospira didasarkan pada kehidupan bakteri Leptospira yang sering hidup pada organ gin al. (enurut P" D PL /epkes semua tikus berpotensi menyebarkan bakteri leptospira melalui kencingnya, bakteri itu mengakibatkan penyakit leptospirosis dimana semua tikus berpotensi menyebarkan bakteri tersebut. 1alah satu metode yang dilakukan dalam diagnosis bakteri leptospira pada gin al tikus yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara adalah dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). /alam proses P%6 yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara meliputi tahapan sebagai berikut> Pembuatan /78 (ekstraksi /78), pencampuran /78 dengan komponen P%6 lain, proses P%6, pembuatan agar, elektroforesis dan pembacaan pada gel documentation. A. K$m#$nen+k$m#$nen PCR 1ebelum melakukan proses P%6, harus diketahui komponenkomponen P%6 yang digunakan, yang meliputi> 1. /78 template yang telah dibuat dari sampel berupa gin al tikus. 4emplate /78 adalah molekul ganda yang mengandung se<uen target yang akan diamplifikasi. /78 yang digunakan pada pemeriksaan yang dilakukan

*'

adalah sebanyak # OL. pembuatan /78 yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara meliputi tahap-tahap berikut ini> a. Pemecahan atau Pencampuran Pada tahap ini, dilakukan dengan cara menggerus sampel berupa gin al tikus dengan menggunakan mortar. &omogenkan "#-#. mg sampel gin al tikus dalam 1 ml /78zol. 2emudian ambil sebanyak #-1. mg sampel gin al yang telah halus dengan mikro pipet dan dimasukkan kedalam tabung kemudia dibiarkan selama #-1. menit pada suhu kamar. Fntuk meminimalisir kerusakan /78, maka dilakukan pemcampuran atau 3orteG dengan beberapa bahan tambahan yang meliputi> proteinase 2 ( untuk mempermudah dan memperbaiki kerusakan isolasi /78 akibat proses homogenisasi). %ernakan sampel gin al tikus ("#-1.. mg) dalam .,# ml /78zol tambahan dengan proteinase 2 (1.. OgBml) selama --"- am pada suhu kamar. b. 1entrifugasi Cndapan yang dihasilkan dari tahap pertama dihomogenkan dengan alat sentrifugasi selama 1. menit pada suhu --"# .% dengan kecepatan 1..... rpm. 1etelah itu, pindahkan cairan kental (supernatant) yang dihasilkan, pada tabung yang baru. 4ahap ini bertu uan untuk menghilangkan fragmen-fragmen aringan yang tidak dapat dipecahkan, sebagian cairan 678 dan kelebihan polisakarida dari cairan. c. Pengendapan /78

*=

(engendapkan /78 dari cairan dengan menambahkan ..# ml ethanol 1..+ dalam 1 ml /78zol yang digunakan untuk isolasi. %ampur sampel dengan cara membalikkan tabung beberapa kali dan didiamkan pada suhu kamar selama 1-* menit. Pastikan /78zol dan ethanol tercampur dengan baik untuk membentuk larutan se enis. /78 dengan cepat akan tampak sebagai endapan yang keruh. 2emudian pindahkan /78 pada tabung yang bersih. Letakkan tabung secara tegak lurus selama 1 menit dan hilangkan sisa ciaran dari dasar tabung. 2emudian disentrifugasi pada suhu --"# .% dengan kecepatan #.... rpm selama # menit. d. Pencucian /78 %uci /78 dengan ..=-1 ml ethanol '.+. Letakkan tabung secara 3ertikal selama .,# -1 menit sampai /78 dapat mencapai dasar tabung. 2emudian hilangkan ethanol dengan pipet atau dituang. e. Pelarutan /78 &ilangkan sisa alkohol dari dasar tabung menggunakan pipet. 1elan utnya, /78 dilarutkan dalam air. 4ambahkan = m( 7a9& atau air untuk mendekati konsentrasi /78 sebesar .,"-..* OgBOl. Pada keadaan khusus untuk sampel aringan, tambahkan .,"-.,* ml dari 7a9& = m( atau air kedalam isolasi /78 dari 1.-". mg sampel gin al. 2emudian disentrifugasi selama 1. menit dengan kecepatan 1".... rpm. ". Cnzim

*:

Cnzim yang digunakan adalah enzim /78 polymerase. /78 polymerase merupakan enzim yang mengkatalis polimerasi /78. Cnzim yang digunakan adalah sebanyak ". OL. *. Primer Primer yang digunakan pada pemeriksaan bakteri Leptospira di 5alai Libang P"5" 5an arnegara adalah primer yang didasarkan pada penelitian !onseca ("..,) dengan urutan primer E1 (#I- %4E 884 %E% 4E4 848 888 E4-*I) dan E" (#I-EE8 888 %88 84E E4% EE8 8E-*I). -. 8ir, (g"? dan d74P Proses P%6 memerlukan semua macam d74P (d84P, dE4P, d%4P dan d44P) sebagai bahan untuk mensintesis untai /78

komplementer. 2onsentrasi masing-masing d74P harus seimbang untuk meminimalkan kesalahan penggabungan. 1ementara ion (g"? merupakan ion yang sangat penting karena ion ini mempengaruhi beberapa hal antara lain annealing primer, suhu pemisahan untai template dan produk P%6, spesifitas produk serta akti3itas dan ketepatan enzim. B. Pr"ns"# Kerja Polymerase Chain Reaction (PCR) 1ebelum masuk ke proses P%6, 2omponen-komponen tersebut dicampur dan disentrifugasi pada selama 1 menit. 1etelah disentrifugasi, sampel yang diperoleh akan masuk proses P%6 dalam mesin thermocycling selama * am. /alam P%6, /78 akan mengalami tahap denaturasi (pemisahan), annealing (penempelan) dan e'tension (perpan angan). Proses-proses tersebut

-.

berlangsung dalam suhu yang berbeda dimana pengaturan suhu dapat dilakukan pada mesin dan penetuan suhu pada proses yang dilaksanakan uga didasarkan pada primer yang digunakan dimana di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara menggunakan dasar penelitian yang dilakukan oleh !onseca pada tahun "..,. Pada mesin thermocycling tersebut, berlangsung tahap-tahap denaturasi, annealing dan e'tension, dimana ketiga proses tersebut dilakukan pada suhu yang berbeda sesuai dengan primer yang digunakan serta sampel yang digunakan (sel atau aringan). 1. /enaturasi (pemisahan), tahap ini berlangsung pada suhu tinggi. Pada pemeriksaan yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara, sesuai dengan primer yang digunakan yang didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh !onseca ("..,), suhu pre denaturasi dilakukan pada suhu :- .% selama # menit dan suhu denaturasi dilakukan pada suhu :- .% selama1 menit. ". %nnealing (penempelan), tahap ini dilakukan pada suhu #" .% selama 1 menit. Pada proses annealing, suhu harus sesuai dengan primer yang digunakan (harus spesifik) sehingga suhu bisa diatur (dinaikkan atau diturunkan) untuk memperoleh hasil yang optimal. *. *'tension (perpan angan), suhu untuk tahap ini adalah '" .% selama 1 menit dan '" .% untuk # menit tambahan (post e'tension). 1uhu '" .% merupakan suhu optimum enzim )a- polymerase. Lamanya waktu e'tension tergantung pada pan ang se<uen target, konsentrasi se<uen target dan suhu e'tension.

-1

1ecara umum, proses denaturasi, annealing dan e'tension dapat dilihat pada gambar berikut ini>

Eambar #.1 Eambaran Proses /enaturasi, %nnealing dan *'tention pada P%6

/alam rangka memperoleh umlah /78 target yang sesuai, maka prosesproses tersebut dilakukan secara berulang melalui beberapa siklus. Pada pemeriksaan yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara, berdasarkan primer yang digunakan, ketiga proses tersebut dilakukan dalam *: siklus. 1elama siklus berlangsung, ter adi kenaikan dan penurunan suhu yang disesuaikan dengan masing-masing proses dimana suhu tersebut dapat diatur pada mesin thermocycling. 1etelah melalui proses P%6, hasil P%6 harus dituangkan dalam sumursumur yang dibuat pada media agar untuk proses elektroforesis.. 9leh karena itu, sebelum proses elektroforesis, perlu dibuat agar terlebih dahulu. Pembuatan media agar terdiri dari beberpa bahan, antara lain gel agarosa sebanyak -. OL,

-"

ditambah dengan 45C (4ris 5orate C/48) P G dan ethidium bromid (Ct5r) sebanyak ",# OL. 5ahan-bahan tersebut kemudian dicampur dalam cetakan agar dan dimasukkan kedalam micro$ave sampai mengeras (H 1. menit). 8gar yang sudah mengeras kemudian dibuat sumur untuk meletakkan sampel /78 yang akan dilakukan pada alat elektroforesis. 4ahap selan utnya adalah elektroforesis gel agarosa. Clektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur la u perpindahan atau pergerakan partikelpartikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip ker a dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion),dalam hal tersebut /78, yang bergerak menu u kutub positif (anode), sedangkan partikelpartikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menu u kutub negatif (anode). /78 merupakan molekul yang bersifat asam, sehingga akan bergerak dari kutub negatif (katoda) ke kutub positif (anoda). Pergerakan /78 di dalam gel tergantung pada beratBukuran molekul /78, bentuk konformasi /78, konsentrasi agarosa, tegangan listrik yang digunakan dan kekuatan bufer elektroforesis dan enis bufer yang digunakan untuk elektroforesis Clektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari /78. Pada proses elektroforesis, uga ter adi proses 3isualisasi /78. %ara paling mudah untuk mem3isualisasi /78 dalam elektroforesis gel adalah dengan pengecatan menggunakan ethidium bromid (Ct5r). Ct5r akan mengikat /78 dengan cara menginsersi dan akan menghasilkan warna orangeBmerah fluoresen ketika diiluminasi dengan cahaya FK. Ct5r dapat dituangkan dalam gel ketika proses pembuatan dan running bufer, atau sebaliknya, gel direndam

-*

dalam larutan Ct5r (.,# gBml) setelah elektroforesis selama 1. menit. Aarna di3isualisasikan dengan iradiasi FK (misalnya menggunakan gel documentation) dan difoto. Proses elektroforesis dilakukan selama 1. menit. pada sumur sumur agar yang telah dibuat, dimasukkan marker (digunakan sebagai standar pembacaan pada hasil 3isual) sebanyak ",# OL dan = OL /78. 1etelah melalui proses elektroforesis, agar hasil elektroforesis dapat di3isualisasi, hasil dapat dilihat dengan alat gel documentation. (elalui alat ini, dapat dilihat sampel mana sa a yang positif mengandung bakteri Leptospira dimana hasil tersebut dapat dilihat pada posisi garis yang se a ar dengan standar atau target yang ditentukan yaitu "=#. Pada pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus yang dilakukan di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara yang telah dilakukan, digunakan specimen beruoa sampel gin al tikus yang diperoleh hasil trapping yang dilakukan di daerah 1leman. Pemilihan organ gin al pada pemeriksaan bakteri Leptospira yang dilakukan di 5alat Litbang P"5" 5an arnegara adalah karena kebiasaan hidup dari bakteri Leptospira yang sering hidup pada organ gin al tersebut. 1ampel-sampel tikus yang diperiksa diberi kode untuk memudahkan saat memasukkan hasil P%6 kedalam sumur-sumur agar sehingga dalam

melatakkannya tidak terbalik. 2ode dan hasil pemeriksaan terhadap sampel gin al tikus yang dilakukan, dapat dilihat pada tabel dibawah ini>

4abel #.1 &asil Pemeriksaan bakteri Leptospira pada Ein al 4ikus

--

N$ 1 " * # , ' = : 1. 11 1" 1* 11#

K$*e am#el 1, ,# ,1 *. ,# ". ## #= "# "= ", = " #"8 #:

Has"l Pemer"ksaan ? -

1ampel-sampel tersebut dimasukkan kedalam sumur-sumur yang telah dibuat pada agarosa secara berurutan. 5erdasarkan pemeriksaan menggunakan gel documentation terhadap sampel-sampel gin al tikus diatas, diperoleh hasil 3isualisasi sebagai berikut>

marker *.. ".. 1..

1ampel no. 1-11ampel positif (no. :)

-#

Eambar #." &asil Pembacaan /el ,ocumentation pada 1ampel Ein al 4ikus yang /iperiksa

5erdasarkan pembacaan dengan menggunakan gel documentation, menun ukkan bahwa sampel gin al tikus nomor : dengan kode "# positif mengandung bakteri Leptospira. &al tersebut dapat terlihat dari garis yang se a ar dengan target pada marker yaitu "=# (diatas ".. dan dibawah *..). Penetapan standar "=# didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh !onseca ("..,). P%6 merupakan metode yang dapat digunakan untuk amplifikasi /78 baik pada hewan maupun manusia. metode pemeriksaan pada manusia dan hewan adalah sama yang membedakan adalah dari enis sampel yang digunakan (sel atau aringan). 5egitu pula terhadap enis penyakit yang akan diperiksa dengan P%6, metode pemeriksaan yang dilakukan sama yang membedakan adalah sampel dan primer yang digunakan.

C. Kele("han *an Kekurangan Met$*e PCR Pemeriksaan P%6 sangat tergantung pada keahlian dan pengalaman operator. 1pesifitas hasil pemeriksaan dipengaruhi oleh adanya kemungkinan

-,

kontaminasi spesimen saat pemrosesan di laboratorium, ika primer yang digunakan tidak spesifik atau ika kondisi P%6 tidak optimal memungkinkan produk amplifikasi yang tidak spesifik. 1umber kontaminasi yang paling sering adalah dari spesimen lain atau dari prosedur amplifikasi sebelumnya. &asil negatif palsu uga dapat ter adi ika ada bahan-bahan dalam spesimen yang menghambat ekstraksi atau amplifikasi asam nukleat.

4abel #." 2elebihan dan 2ekurangan P%6

Kele("han 1ensiti3itas tinggi 1pesifitas tinggi Kekurangan Potensial ter adi hasil positif palsu akibat kontaminasi Potensi ter adi hasil negatif palsu akibat adanya inhibitor P%6 yang positif belum ter3alidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi aktif atau laten) karena dapat mendeteksi organisme yang telah mati 4eknik prosedur yang kompleks, perlu beberapa tahapan Peralatan dan reagen mahal

6eprodusibilitas baik 2emampuan untuk mendeteksi mikroorganisme penginfeksi yang tidak dapat diidentifikasi dengan metode kon3ensional 1angat cepat, dapat memberikan hasil pada hari yang sama /apat mendeteksi dan membedakan 3arian mikroorganisme (strain)

/engan semakin luasnya penggunaan P%6 sebagai metode penun ang diagnosis sangat perlu adanya standarisasi metode baik pada tahap pra-analitik maupun tahap analitik. 1tandarisasi tahap pre-analitik antara lain meliputi antara lain>

-'

1. Pemilihan bahan pemeriksaan klinik sesuai dengan enis penyakit dan enis (stage) beratnya penyakit. ". %ara penyimpanan dan pengiriman ke laboratorium terutama sangat tergantung target asam nukleat yang dideteksi, misalnya bila target adalah /78 maka bahan disimpan pada suhu kamar atau dingin, tetapi bila 678 bahan harus dibekukan. *. 1pesimen darah perlu penanganan khusus untuk deteksi patogen tertentu, misalnya penambahan C/48. -. Pemilihan metode ekstraksi /78 atau 678 yang tepat sehingga didapatkan target asam nukleat yang bebas dari matriks protein dan inhibitor.

1ementara itu, standarisasi pada tahap analitik dapat dilakukan dengan cara> 1. Pemilihan primer sehingga didapatkan sensitifitas dan spesifisitas hasil yang tinggi. ". 6eagen yang digunakan *. Pemilihan mesin thermocycler yang uga men adi penentu kondisi amplifikasi yang diperlukan.

-=

BAB ,I PENUTUP A. Kes"m#ulan 5erdasarkan pembahasan diatas, dapat diambil kesimpulan> 1. 2omponen-komponen yang diperlukan dalam pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus dengan metode P%6 di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara adalah /78 tempale, enzim, primer dan d74P, konsebtrasi (g"? dan air. ". Pada prinsipnya, pemeriksaan bakteri Leptospira pada gin al tikus dengan metode P%6 di 5alai Litbang P"5" 5an arnegara meliputi * proses yaitu denaturasi (pemisahan), annealing (penempelan dan e'tension

(perpan angan). 1etelah itu, uga harus melalui proses elektroforesis dengan gel agarosa sebelum dapat dilihat hasilnya pada gel documentation.

-:

*. /alam aplikasi metode P%6 selain terdapat berbagai kelebihan seperti sensiti3itas dan spesifitas yang tinggi dan dapat memperoleh hasil dalam waktu yang cepat uga memiliki beberapa kekurangan seperti adanya hasil pemeriksaan yang positif palsu atau negatif palsu.

B.

aran 1. /alam pemeriksaan bakteri Leptospira dengan metode P%6, harus dilaksanakan dengan teliti dan detail agar hasil yang diperoleh dapat optimal. 9leh karena itu, para operator harus dapat beker a sesuai dengan 1tandar 9perasional Prosedur (19P) yang ditentukan. ". Proses pencampuran komponen-komponen P%6 harus benar-benar tepat sehingga hasil yang diperoleh dapat 3alid. 1elain itu, uga diperlukan keahlian yang khusus untuk dapat melakukan pemeriksaan dengan metode P%6 tersebut. 9leh karena itu, perlu adanya pelatihan kepada para operator sebelum melalukan proses P%6. *. /alam pemeriksaan berbagai penyakit menggunakan P%6 harus dilakukan secara detail dan teliti oleh seorang operator yang handal sehingga hasil yang diperoleh dapat dipertanggung awabkan. Pelatihan terhadap operator uga perlu ditingkatkan untuk mencegah ter adinya human error dalam melaksanakan peker aan.