Anda di halaman 1dari 18

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

PEMBUATAN MEDIA FERMENTASI DAN PENENTUAN HALOZONE (ZONA BENING)


I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Medium adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Medium terdiri dari medium padat, cair dan semi padat. Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang ukurannya kecil atau makhluk hidup bersel satu. Contoh : bakteri, jamur tingkat rendah, protozoa, dan virus. Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam keadaan anaerobik (tanpa oksigen). Fermentasi diperkirakan menjadi cara untuk menghasilkan energi pada organisme sebelum oksigen berada pada konsentrasi tinggi diatmosfer seperti sekarang ini. Fermentasi itu merupakan aktifitas dari sampel tersebut. Kemudian ditentukan zona bening (halozone) yang biasanya digunakan untuk melihat sejauh mana isolat yang kita gunakan bersifat anti mikroba atau untuk melihat aktifitas enzim. 1.2 Tujuan Tujuan dari percobaan pembuatan media fermentasi dan penentuan halozone (zona bening) adalah: 1. Melatih keterampilan pembuatan medium fermentasi cair. 2. Melatih keterampilan dalam menginokulasikan mikroorganisme ke medium. 3. Mengamati zona bening sebagai representative potensi suatu

mikroorganisme terhadap substrat.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

21

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

4. Melatih keterampilan untuk bekerja secara aseptik. 1.3 Aplikasi Percobaan pembuatan media fermentasi dan penentuan halozone (zona bening) dapat diaplikasikan untuk: 1. 2. Membuat medium fermentasi cair. Mengetahui bioaktivitas dari isolat yang diguanakan.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

22

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

II.

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri asam laktat termasuk mikroorganisme yang aman jika ditambahkan dalam pangan karena sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin, maka disebut food grade microorganism atau dikenal sebagai mikroorganisme yang

Generally Recognized As Safe (GRAS)

yaitu mikroorganisme yang tidak

beresiko terhadap kesehatan, bahkan beberapa jenis bakteri tersebut berguna bagi kesehatan. BAL bermanfaat untuk peningkatan kualitas dan keamanan pangan melalui penghambatan Secara alami terhadap ora berbahaya yang bersifat patogen. BAL dapat berfungsi sebagai pengawet makanan karena mampu memproduksi asam organik, menurunkan pH lingkungannya dan mengeksresikan senyawa yang mampu menghambat mikroorganisme patogen seperti H2O2, diasetil, CO2, asetaldehid, d-isomer asam amino dan bakteriosin. Bakteriosin merupakan senyawa protein yang dieksresikan oleh bakteri yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri lain terutama yang memiliki kekerabatan erat secara logenik. Senyawa ini mudah terdegradasi oleh enzim proteolitik dalam pencernaan manusia dan hewan. Bakteriosin banyak

Bakteriosin banyak diteliti karena berpotensi sebagai pengawet makanan alami dan dapat diaplikasikan di bidang farmasi. Beberapa jenis bakteriosin

mempunyai spektrum yang luas dan mempunyai aktivitas menghambat terhadap pertumbuhan beberapa patogen makanan seperti

Listeria

monocytogenes dan S. aureus.

Beberapa spesies dari genus Lactobacillus

dilaporkan menghasilkan bakteriosin seperti lactocin 27 oleh L. helveticus LP27

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

23

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

10; lactacin F oleh L. acidophilus 88 11; plantacin B oleh L. plantarum NCDO 1193 12; sakacin A oleh L.sake Lb 706 2; brevicin 37 oleh L brevis B37 13. Dari kelompok lain nisin dihasilkan oleh Lactococcus lactis14; colicins oleh E. coli[1]. Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam keadaan anaerobik (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk repirasi anaerobik, akan tetapi terdapat defenisi yang lebih jelas yang mendefinisikan fermentasi sebagai dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa akseptor elektron eksternal. Gula adalah bahan yang umum dalam fermentasi. Beberapa contoh hasil fermentasi adalah etanol, asam laktat, dan hidrogen. Akan tetapi beberapa komponen lain dapat juga dihasilkan dari fermentasi seperti asam butirat dan aseton. Ragi adalah bahan yang umum diguanakan dalam fermentasi untuk menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan minuman beralkohol lainnya. Respirasi anaerobik dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor elektron eksternal). Dapat dikatagorikan sebagai bentuk fermentasi. Tahapan fermentasi: a. Pemilihan mikroba Mikroba yang dipakai dalam industri akan sangat bermamfaat bila disimpan untuk penggunaan lebih lanjut tanpa mengurangi kemampuan tumbuh dan produksinya. Ada dua macam kultur yaitu primary culture dan working

culture.
b. Media fermentasi

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

24

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroorganisme dibutuhkan suatu substrat yang disebut dengan media. Media yang dipergunakan harus dalam keadaan steril artinya tidak menumbuhi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan (tidak terkontaminasi). Media dapat dibagi 2 : a. Media alami, contoh : kentang, wortel. b. Media buatan, contoh : berbentuk senyawa organik maupun anorganik. Klasifikasi media (bentuk, susunan, sifat media) pada fermentasi : a. Media padat (fermentasi media padat) Fermentasi media padat merupakan proses fermentasi yang berlangsung dalam substrat tidak terlarut, namun mengandung air yang cukup sekalipun tidak mengalir bebas. b. Fermentasi media cair Komponen tambahan yang diperlukan pada pakan generasi baru sering kali disintesa secara terpisah dan ditambahkan kemudian. Cara yang digunakan biasanya dengan cara fermentasi media cair yang dapat mensintesa asam asam amino, asam - asam organik, enzim - enzim dan beberapa vitamin[2]. Fermentasi cair dengan teknik tradisional tidak dilakukan pengadukan, berbeda dengan teknik fermentasi cair melibatkan fermentor yang dilengkapi dengan pengadukan agar medium tetap homogen, aerasi, pengatur suhu (pendinginan dan pemanasan) dan pengatur pH. Proses fermentasi medium cair dapat dikontrol lebih baik dan hasil lebih uniform dan dapat diprediksi, dan juga tidak dilakukan sterilisasi. Namun pemanasan, perebusan dan pengukusan mematikan banyak mikroba kompetitor.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

25

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

Salah satu jenis fermentasi media cair yang dapat dilakukan, yaitu fermentasi yang diagitasi dimana substratnya larut dalam air. Jenis fermentasi ini dikerjakan dalam salah satu labu atau gelas yang cocok atau yang lebih modern menggunakan fermentor dimana substratnya larut sempurna dalam air. Pengambilan subsrat oleh mikroba melalui fase larutan dalam air. Pada kultur labu yang dikocok, agitasi dilakukan dengan bantuan alat pengocok (shaker). Pada fermentor agitasi dilakukan dengan penggadukan yang dijalankan oleh motor dan dapat dibantu oleh aerasi (gelembung udara)[3]. Fungsi fermentasi : a. Menyelamatkan makanan dari semua masalah makanan. b. Penganekaragaman pangan. c. Memperpanjang massa penyimpanan. d. Meminimalkan kerugian. e. Menambah gizi makanan. Beda fermentasi dengan pembusukan : Fermentasi Menggunakan mikroba tertentu Bahan yang diuraikan karbohidrat Tidak menghasilkan bau busuk Dalam kondisi terkontrol Pembusukan : Semua mikroba Bahan yang diuraikan protein Menimbulkan bau busuk

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

26

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

Tidak dalam kondisi tertentu/terkontrol Syarat - syarat medium yang dipakai : a. Dalam medium harus terkandung suatu nutrient atau unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakkan

organisme/mikroorganisme. b. Medium harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroorganisme tertentu. c. Medium tidak mengandung zat penghambat. d. Dalam medium harus stabil, artinya mikroorganisme lainnya tidak diharapkan pertumbuhannya. Macam - macam fermentasi: a. Fermentasi asam cuka Fermentasi yang berlangsung dalam keadaan anaerob. Biasanya dilakukan oleh bakteri asam cuka dengan substrat etanol. Dalam proses fermentasi asam cuka, energi yang dihasilkan lima kali lebih besar dari pada energi yang dihasilkan fermentasi lainnya. b. Fermentasi asam laktat Proses glikolisisnya menghasilkan asam piruvat. c. Fermentasi alkohol Reaksi ini merupakan suatu pemborosan, sebagian besar dari energi yang terkandung didalam glukosa masih terdapat dalam etanol[4].

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

27

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

III. METODOLOGI PERCOBAAN 3.1 Alat dan Bahan Alat Erlenmeyer Gelas ukur Wadah larutan Mengambil larutan Wadah media Wadah untuk isolat BAL Penanda zona bening Memanaskan dan mengaduk larutan Untuk sterilisasi Mengambil larutan Mengambil paperdisc Mensterilkan larutan Bahan Sumber nitrogen Pemadat medium Pelarut Antibiotik Mikroba Bahan

Petridish
Tabung reaksi

Paperdisc Stirrer Hot Plate


Lampu Spiritus Pipet tetes Pinset

Autoclave
Bahan Daging

Bacto agar
Akuades BAL Isolat E. coli

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

28

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

3.2

Cara Kerja a. Pembuatan Medium Fermentasi Cair

1. 1,5 g daging dipotong kecil-kecil dimasukkan kedalam 150 mL akuades kemudian dipanaskan sampai mendidih. 2. Ekstrak daging disaring ke dalam erlenmeyer. 3. Larutan kemudian disterilkan dengan menggunakan autoclave sampai suhu 121 oC. 4. Biakan yang sudah ada ditambahkan dengan 1 mL akuades steril, lalu dikerik dengan jarum ose lalu dipindahkan ke dalam medium. 5. Suspensi isolat dituangkan ke dalam medium, lalu dihomogenkan. 6. Medium fermentasi tersebut diamati setelah 3 hari. b. Pengamatan Zona Bening 1. 2 g agar dan ekstrak daging ditambahkan ke dalam 50 mL akuades. 2. Dihomogenkan dengan stirrer. 3. Larutan kemudian disterilkan dengan menggunakan autoclave sampai suhu 121 oC. 4. Larutan dituangkan ke dalam petridish. 5. Dibiarkan mengeras. 6. Biakan E. coli yang sudah ada ditambahkan dengan 1 mL akuades steril, lalu dikerik dengan jarum ose lalu dipindahkan ke dalam medium padat. 7. Paperdisc dicelupkan ke dalam suspensi isolat BAL, lalu diletakkan pada permukaan medium. 8. Diinkubasi selama 3 hari. 9. Diamati zona bening.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

29

Praktikum Biokimia Semester Ganjil Tahun 2013/2014

3.3 Skema Kerja a. Pembuatan Medium Fermentasi Cair 1,5 g daging - Dipotong kecil-kecil - Dipanaskan sampai mendidih - Disaring ekstrak daging Biakan E. coli - Ditambah 1 mL akuades steril - Dikerik dengan jarum ose - Dipindahkan medium Suspensi isolat BAL - Dituangkan medium - Dihomogenkan ke dalam ke dalam

kedalam erlenmeyer Larutan medium - Disterilkan dengan autoclave sampai suhu 121 oC Larutan medium steril

Diamati medium fermentasi

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

30

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

Pengamatan Zona Bening 50 mL akuades - Ditambah 2 g agar - Ditambah ekstrak daging - Dihomogenkan dengan

Biakan E. coli - Ditambah 1 mL akuades steril - Dikerik dengan jarum ose - Dipindahkan medium ke dalam

stirrer
Larutan medium - Disterilkan dengan

Paperdisc
- Dicelupkan isolat BAL - Diletakkan dalam permukaan pada medium ke dalam

autoclave
sampai suhu 121 oC - Dituangkan ke

petridish
- Dibiarkan mengeras Larutan medium steril

diinkubasi selama 3 hari

Diamati zona bening

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

31

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil dan Pengamatan

1. Pada petridish tidak terbentuk zona bening yang tebentuk bercakbercak putih ( halozone amilotik) disekitar cakram yang menyebar diseluruh permukaan medium. 2. Pada petri dish tidak terbentuk zona bening. Pada cakram dipenuhi mikroba yang berwarana hitam berbentuk seperti jamur.

1. Pada fermentasi medium cair, didapatkan larutan keruh dan memiliki endapan. 2. Larutan berwarna kuning keruh, mungkin mikroba yang terbentuk kurang banyak.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

32

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

4.2 Pembahasan Dari pratikum ini yaitu Pembuatan Media Fermentasi Dan Penentuan Zona Bening yang betujuan untuk melatih ketrampilan membuat edium fermentrasi cair dan menginokulasikan mikroorgansime ke medium, serta mengamati zona bening sebagai representasi potensi suatu mikroorganisme terhadap substrat. Pada percobaan ini kita membuat dua medium yaitu cair dan padat, dimana perbedaan keduanya adalah pada persentase air yang tergkandung didalamnya. Medium cair disini kita menggunakan amilum sebagai sumber karbon, Perbedaan tujuan inokulasi pada medium cair dan padat adalah pada medium padat kita dapat menganalisa aktivitas mikroorganisme secara kualitatif, yaitu dengan melihat zona bening dan transparan disekitar daerah bakteri yang tumbuh menandakan bahwa media disekitarnya telah disintesis oleh mikroorganisme, dan pada media padat ini tidak mendapatkan zona bening tersebut. Media kami banyak terkontaminasi oleh bakteri dan jamur lain. Pada percobaan ini dilakukan beberapa variasi yatu dengan variasi waktu perendaman paperdish selama 60,50 dan 40 detik, kemudian juga dilakukan dengan menggunakan dua jenis bakteri yang berbeda yang bertujuan untuk membandingkan aktivitas bakteri tersebut. Sedangkan pada media cair terjadinya perubahan warna media dari kuning pekat menja dikuning pucat dan terdapat gelembung udara dan endapan. Ini menandakan bahwa amilum pada media cair telah dihidrolisis oleh amilase yang dikeluarkannya.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

33

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

V. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat diambil beberapa kesimpulan, antara lain : 1. Inokulasi pada media cair bertujuan untuk analisa aktivitas enzim secara kualitatif. 2. Inokulasi pada media padat bertujuan untuk analisa aktivitas enzim secara kualitatif. 3. Pada media padat diamati zona bening yang merupakan daerah transparan tapi kami tidak mendapatkannya.

5.2 Saran Untuk kelancaran praktikum selanjutnya dan agar didapatkan hasil yang lebih baik maka disarankan : 1. Pada proses pengerjaannya harus didalam keadaan steril. 2. Melakukan percobaan harus dengan memahami prosedur kerja dengan baik. 3. Teliti dan hati - hati dalam bekerja.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

34

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

VI. JAWABAN PERTANYAAN 1. A. Apa yang dimaksud dengan halozone (zona bening)?

Halozone (zona bening) adalah suatu metoda dalam penentuan tingkat


resistensi/area bening disekeliling cakram kertas sebagai indikasi ada atau tidaknya pertumbuhan mikroorganisme akibat ekstraksi zat antimikroba oleh kompetitornya. B. Jelaskan aplikasi penentuan zona bening! Contoh: uji antimikroba bakteri Streptococcus sp. dari 6 isolat BAL yang diisolasi dari fermentasi sirsak memperlihatkan antara 10-15 mm. 2. Jelaskan fermentasi secara biokimia dan mikrobiologi! Fermentasi secara biokimia adalah aktivitas mikroorganisme untuk memperoleh energi yang diperlukan untuk metabolisme dan zona bening berkisar

pertumbuhannya melalui pemecahan dan katabolisme terhadap senyawasenyawa anorganik secara aerobik. Fermentasi secara mikrobiologi adalah aplikasi metabolisme mikroba untuk mengubah bahan baku menjadi produk yang bernilai tinggi. 3. Jelaskan macam-macam fermentasi! a. Fermentasi alkohol Suatu reaksi pengubahan glukosa menjadi etanol dan CO2. Organisme yang berperan yaitu ragi. b. Fermentasi asam laktat Respirasi yang terjadi sel hewan atau manusia, ketika kebutuhan oksigen tidak tercukupi akibat bekerja terlalu berat. Fermentasi asam laktat

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

35

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

banyak dilakukan oleh fungi dan bakteri tertentu yang digunakan dalam industri susu untuk membuat keju dan yoghurt. c. Fermentasi asam laktat homofermentatif Bakteri asam laktat homofermentatif mengoksidasi glukosa menjadi 2 asam piruvat melalu jalur EMD. d. Fermentasi asam laktat heterofermentatif Bakteri asam laktat heterofermentatif selain menghasilkan asam laktat juga menghasilkan CO2, etanol (umumnya) dari asam asetat. e. Fermentasi propionat Propionat merupakan produk akhir fermentasi gula dan pati. f. Fermentasi butirat Fermentasi butirat dilakukan oleh Clostridium sp. yang merupakan bakteri penghasil spora heterogenesis sebagai sakarolitik dan proteolitik.

Clostridium sp. tergolong bakteri anaerob.


Macam-macam fermentasi berdasarkan media, adalah: a. Fermentasi pada media cair Fermentasi yang melibatkan media cair sebagai fasa kontinu. b. Fermentasi pada media padat Fermentasi yang berlangsung dalam substrat yang tidak larut, namun mengandung air yang cukup. 4. Sebutkan aplikasi/hasil fermentasi! a. Penerapan fermentasi dalam bidang pangan Contoh: fermentasi tempe, yoghurt, keju wine, dan nata de coco.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

36

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

b. Penerapan fermentasi dalam bidang pertanian Contoh: pembuatan jamur pangan c. Fermentasi dalam bidang industri Contoh: produksi enzim secara fermentasi 5. Jelaskan metoda-metoda penentuan zona bening! Penentuan zona bening dapat dilakukan dengan menggunakan paperdisc yang telah dicelupkan kedalam antimikroba. Aktivitas hambat dapat dilihat dari zona bening yang terbentuk disekitar paperdisc besarnya daya hambatnya dapat ditentukan dengan mengukur zona bening yang terbentuk. 6. Jelaskan keuntungan fermentasi cair! a. Dapat digunakan pada pakan generasi baru Hal ini dapat dilakukan karena, pada medium fermentasi cair komponen tambahan yang diperlukan pada pakan fermentasi baru seringkali disintesa secara terpisah dan ditambahkan kemudian. Contoh: sintesis asam-asam amino, asam-asam organik, enzim-enzim dan beberapa vitamin b. Dapat digunakan untuk menghasilkan pakan secara langsung Fermentasi media cair untuk memproduksi pakan secara langsung memungkinkan dilakukan jika proses fermentasi telah membentuk komponen yang didinginkan disamping biomassa yang dapat digunakan. c. Pemakaian medium lebih efisien Medium fermentasi cair ini biasanya dibuat dari semua bahan yang digunakan sehingga tidak ada ada yang terbuang.

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

37

Pratikum Biokimia Semester Ganjil Tahun Ajaran 2013/2014

DAFTAR PUSTAKA [1] Kusmiati, Amarila Malik. 2002. Aktivitas bakteriosin dari bakteri Leuconostoc

mesenteroides

Bioteknologi-LIPI.

pbac1

pada

berbagai

media.

Pusat

Penelitian

[2] Prof. Dr. D. Dwijo Seputro. 1985. Dasar - dasar mikrobiologi. Penerbit Jambatan

[3] Ratna Sri Hadioetomo. 1985. Mikrobiologi dasar dalam praktek. Jakarta: PT. Gramedia

[4] Hidayat, Nur. dkk. 2006. Mikrobiologi Industri. Yogyakarta : Andi

Pembuatan Media Fermentasi dan Penentuan Halozone (Zona Bening)

38