Anda di halaman 1dari 9

EXCLUSION CHROMATOGRAPHY Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Kimia Pemisahan Dosen : Dr.

Sumar Hendayana, M.Sc.

Disusun Oleh : Irma Rahmawati, S.Pd.

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA 2013

EXCLUSION CHROMATOGRAPHY A. Prinsip Dasar Kromatografi Eksklusi Exclusion Chromatography (EC) yang bisa disebut juga Size Exclusion Chromatography (SEC), Gel Permeation Chromatography (GPC), atau Gel Filtration Chromatography (GFC), merupakan metode kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda. Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe dan Colin R. Ruthven. Teknik ini unik karena proses pemisahannya didasarkan pada ukuran molekul dari sampel. Molekul besar pada sampel akan dipisahkan dengan molekul yang kecil dalam sampel. Pada teknik ini, pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalam jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Akibatnya, molekul yang lebih besar terelusi dari kolom molekul cepat dan lebih kecil kemudian, yang secara efektif macam molekul berdasarkan ukuran. Ini adalah prinsip pemisahan kromatografi eksklusi ukuran1.

Gambar A.1 Ilustrasi prinsip dasar kromatografi eksklusi2

Fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat berpori (porus), sehingga solut dapat melewati porus tersebut (lewat diantara partikel), atau berdifusi melalui fase
1 2

Size Exclusion Chromatography. 2011. http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/55/55intro.html http://en.wikipedia.org/wiki/Size-exclusion_chromatography

diam. Sedangkan fase gerak pada kromatografi ini tidak berpengaruh, sehingga pelarut yang berlainan yang mempunyai daya mensolvasi yang sama menghasilkan hasil yang sama. Sedikit banyak fase gerak pada kromatografi ekslusi ini serupa dengan gas pada kromatografi gas dalam hal fungsinya yang hanya sebagai medium netral yang memungkinkan molekul solut memasuki fase diam3. 1. Pemilihan Kolom Pemilihan ukuran pori kemasan pada umumnya bergantung pada molekul solut yang akan dipisahkan. Sering sampel ukurannya sangat beragam (berat molekul berbeda-beda) dan dengan satu ukuran pori saja tidak memadai untuk memisahkan semua jenis molekul. Beberapa mungkin dieksklusi seluruhnya dari pori (K=0) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum mati (V0), sedangkan yang lain berpermeasi ke semua pori (K=1) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum permeasi total (V0 + Vp). Sedangkan molekul yang lainnya lagi berpermeasi ke pori secara selektif, bergantung pada ukuran relative dan terelusi dengan volum retensi (VR) yang dinyatakan oleh persamaan4 ; VR = V0 + KVp Oleh karena itu, prinsip kromatografi eksklusi lainnya adalah terjadinya pemisahan molekul polimer sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam kolom.

Gambar A.2 Kolom Kromatografi Eksklusi Ukuran

Setiap kemasan ekslusi-ruang yang berbeda ukuran porinya mempunyai kurva kalibrasi sendiri. Batas eksklusi dan rentang kerja berat molekul pada gambar dibawah ini tidak didefinisikan secara tajam karena distribusi pori kemasan kolom tidak sempit. Distribusi pori pada kemasan menentukan kemiringan kurva kalibrasi. Jika distribusi pori besar, kurva
3 4

Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB. Idem no 3

mempunyai kemiringan yang tajam. Jadi, rentang kerja berat molekul besar, tetapi akan menghasilkan daya pisah rendah pada senyawa-senyawanya yang ukuran molekulnya hampir sama. Jika distribusinya sempit, kurva lebih mendatar, jadi rentang kerja berat molekul akan lebih kecil, tetapi daya pisah molekul yang ukurannya hampir sama akan meningkat 5.

Gambar A3 (a) Kurva kalibrasi dan (b) kromatogramnya untuk kromatografi eksklusi6

Kemasan untuk kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi 3 golongan : a. Gel Setengah Kaku Bahan ini biasanya berupa gel yang dipakai dalam pelarut organic, seperti aseton, tetrahidrofluran, dan sebagainya. Contoh dari golongan ini adalah gel TSK dan gel Styragel yang digunakan untuk memisahkan cuplikan polimer rumit, seperti karet dan plastic. Kekurangan utama kemasan partikel besar ini (dp = 35-75 mikrometer) adalah alih massanya yang rendah. Untuk memperoleh kemasan yang memadai, harus dipakai laju alir yang rendah, akan tetapi hal ini mengakibatkan waktu analisis yang panjang. Kemasan eksklusi partikel (dp = 10 mikrometer) telah dikembangkan, sehingga bisa mendorong alih massa yang cepat dan memungkinkan pemakaian laju alir yang tinggi, sehingga waktu analisis yang lebih pendek. Partikel kecil dengan pori berukuran kecil meghasilkan daya pisah tinggi, I ni berarti bahwa berat mokelul yang lebih rendah (1000-100) dapat dipisahkan.7
5 6

Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB Lloyd R. Snyder, Joseph J. Kirkland. 2010. Introduction To Modern Liquid Chromatography, third Edition. Canada : John Wiley & Sons, Inc. 7 Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB

b. Gel Kemasan Kaku Kemasan ini hampir selalu dibuat dari kaca atau silica. Keuntungan dari kemasan ini adalah kekuatannya menghilangkan pembatasan laju aliran karena dapat dipakai pada tekanan tinggi. Pelarut yang digunakan adalah air dan pelarut organic. Kekurangannya adalah adanya pengaruh absorban yang sering menyulitkan. Namun, harus diperhatikan bahwa larutan basa dengan pH > 7,5 harus dihindari, karena dapat melarutkan kaca dan silica. 8 c. Gel Lunak Bahan kemasan ini contohnya adalah dekstran sambung silang dan sephadex. Kemasan gel lunak menggembung dalam pelarut air, gel ini berguna untuk memisahkan senyawa yang larut dalam air, yang rentang berat molekulnya 102 2,5.107. Fungsi utama dari gel lunak adalah untuk memisahkan polimer yang larut dalam air. Gel ini banyak dipakai dalam pencirian atau pengkarakterisasian protein dan enzim. Kekurangan bahan ini dapat diuraikan oleh bakteri yang dapat menyebabkan hilangnya kinerja kolom, gel lunak tidak dapat menahan tekanan > 150 psi dan sangat rapuh.9 2. Pemilihan Fase Gerak Fasa gerak dipilih untuk meminimalisir interaksi solute dengan permukaan penyangga, memiliki kemurnian yang tinggi, tidak bereaksi dengan fase diam, tercampurkan dengan komponen system, pelarutnya baik untuk cuplikan, dapat membasahi permukaan kemasan dan viskositasnya rendah.

8 9

Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB Idem No 8

B. Mekanisme Kromatografi Eksklusi Buffer dipompa melewati kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat campuran molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada ujung atas kolom, molekulmolekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan melalui volume pelarut yang lebih besar daripada yang tersedia untuk molekul besar. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat masuk ke dalam pori dan karenanya memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang lebih panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki pori. Seluruh molekul yang lebih besar ukurannya dibandingkan ukuran pori, tidak tertahan dan akan dielusi bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memiliki waktu tinggal rata-rata dalam partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran molekulnya. Karena itu, molekul besar bergerak lebih cepat melewati kolom, dan dengan inilah campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya. Berikut gambar ilustrasi proses pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran ;

Gambar B.1 Ilustrasi Proses Pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Eksklusi 5

C. Kekurangan dan Kelebihan Kromatografi Eksklusi Kromatografi eksklusi memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya: 1. Pita-pita sempit. 2. Waktu pemisahan pendek, mudah diramalkan. 3. Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik. 4. Tidak terjadi kehilangan cuplikan selama reaksi pemisahan. 5. Hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasi kolom. 6. Frekuensi tajam dan sensitivitas baik. 7. Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase stasioner. 8. Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa menganggu proses filtrasi Kromatografi eksklusi juga memiliki kelemahan, yaitu : 1. Kapasitas terbatas 2. Tidak dapat digunakan untuk cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama. 3. Prinsip pemisahan tidak seperti kromatografi lain. Kekurangan yang paling menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti hanya ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogramtotal, karena kromatogram cukup pendek semua senyawa terelusi sebelum total. Pada kromatografi eksklusi jarang terlihat lebih dari enam pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi eksklusi biasanya tidak dapat memisahkan secara sempurna suatu cuplikan kompleks, tanpa pemisahan lebih lanjut dengan metode lain. Kekurangan kedua adalah tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai ukuran hampir sama. Perbedaan pada kromatografi eksklusi adalah prinsip pemisahan yang berbeda dengan yang digunakan metode kromatografi lain. Konsep faktor pemisahan , dan factor kapasitas k tidak bisa digunakan. Susunan fasa gerak juga relative tidak penting pada kromatografi eksklusi. Pengelompokkan berbagai penggunaan kromatografi eksklusi biasanya dibagi dalam dua teknik yaitu teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasi gel (pelarut organik).

D. Aplikasi Kromatografi Eksklusi Aplikasi analitik kromatografi eksklusi meliputi estimasi berat molekul, pemantauan atau karakterisasi pelipatan dan agregasi protein, dan menentukan interaksi reseptor-ligan. Kecepatan dan kondisi elusi yang lembut membuat kromatografi eksklusi merupakan metode yang nyaman untuk proses cepat isolasi biopolimer, dengan perolehan kembali massa yang tinggi dan aktivitas biologis. Kromatografi eksklusi dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini. Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untuk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap makro molekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar. Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang tak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat diketahui dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi. Kromatografi eksklusi dapat digunakan untuk analisis campuran molekul dengan berat molekul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam dengan H2O sebagai eluen. Pemisahan molekul- molekul dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro.
o Column: 5 m silica 25 cm x 4.9 mm o Mobile phase: tetrahydrofuran + 1% H2O o Flow rate: 1 cm3min-1 o Detector: UV absorption, 254 nm o Sample: 1 l Epikote 1001 dalam tetrahydrofuran (Epikote 1001 adalah resin epoxy sintetis dengan massa molekul relatif rata-rata 900)

Gambar C.1 Kromatogram Ekslusi dari Resin Epoxy 7

Gambar. C.2 dibawah ini menunjukkan penentuan residu pestisida dalam sampel lemak ayam, dan merupakan contoh bagaimana eksklusi dapat digunakan untuk membersihkan sampel kompleks. Pertama, sampel bebas pestisida lemak dijalankan pada keadaan kosong, kemudian yang kosong ini dibubuhi dengan pestisida untuk menentukan volume retensi mereka. Ketika sampel disuntikkan, eluen yang mengandung pestisida dikumpulkan. Pelarut diuapkan, residu dilarutkan dalam asetonitril dan pestisida kemudian dipisahkan pada kolom fase terbalik

Gambar C.2 (i) sampel Lemak, kosong dan dibubuhi dengan pestisida (ii) sampel mengandung pestisida Lemak (Kolom: 100 A -styragel (stirena-divinil resin benzena microparticulate), 122 cm x 7,8 mm, Fase gerak: trichloromethane, Laju alir 2 cm3 min-I, Sampel: 100 l lemak ayam dalam trichloromethane). (iii) pemisahan fasa reverse residu pestisida (Kolom: 10 m C-18, 30 cm x 4 mmFase gerak: CH3CN/H2O 60:40, laju alir 2 cm3 min-I, Detector: UV penyerapan, 254 nm. Peaks: 1 simazine 2 atrazin 3 propazine).10

10

Sandy, Lindsay. 1987. High Performance Liquid Chromatography Analytical Chemistry by Open Learning. London : John Willey and Sons Inc. Hal 130-132