MINISTERUL EDUCAIEI, CERCETRII, TINERETULUI I SPORTULUI

UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE TIINE

STUDIUL MORFOANATOMIC, FIZIOLOGIC I BIOCHIMIC AL SPECIEI SEDUM TELEPHIUM SSP. MAXIMUM VITROCULTIVAT

Conductor tiinific, Prof. dr. DORINA CACHI Doctorand, ARDELEAN MIRELA

ORADEA 2012

CUPRINS
PREFA 1. CONSIDERAII GENERALE 1.1. INTRODUCERE 1.2. CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE I APLICABILITATE PRACTIC 1.2.1. Definiie 1.2.2. Caracteristicile culturilor in vitro 1.3. DOMENIUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE, ASPECTE TEORETICE I PRACTICE 1.3.1. Generaliti 1.3.2. Istoricul cercetrilor din domeniul biotehnologiei vegetale 1.3.2.1. Naterea biotehnologiei vegetale pe plan internaional 1.3.2.2. Istoricul cercetrilor din domeniul biotehnologiei vegetale n Romnia 1.3.3. Procese morfofiziologice la nivelul explantelor cultivate in vitro 1.3.3.1. Alegerea explantului 1.3.3.1.1. Selectarea explantelor n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei mam 1.3.3.1.2. Selectarea explantelor n funcie vrsta explantului 1.3.3.1.3. Selectarea explantelor n funcie de amplasarea lor n corpul plantei-donor 1.3.3.1.4. Selectarea explantelor n funcie de mrimea i natura acestora 1.3.3.2. Reacia explantelor n vitrocultur 1.3.4. Morfogeneza in vitro 1.3.4.1. Organogeneza in vitro 1.3.4.2. Habituaia sau anergismul 1.3.4.3. Vitrificarea sau sticlozitatea 1.3.5. Aclimatizarea exvitroplantulelor la condiiile mediului septic 1.3.6. Valorificarea vitroculturilor vegetale n obinerea de produi secundari de metabolism 1.3.7. Organizarea unui laborator de biotehnologii vegetale 1.3.7.1. Organizarea spaiilor 1.3.7.2. Dotarea laboratorului de vitroculturi 1.3.7.3. Asepsizarea i metode de asepsizare 1.3.8. Cerinele nutritive ale esuturilor vegetale cultivate n condiii aseptice 1.3.8.1. Mediul de cultur - generaliti 1.3.8.1.1. Compoziia mediilor de cultur 1.3.8.1.2. Modul de preparare a mediilor de cultur 1.3.8.2. Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultur 1.3.8.3. pH-ul mediilor de cultur 1.3.9. Asepsizarea materialului vegetal donator de explante 1.3.9.1. Sterilizarea esuturilor 1.3.9.2. Pregtirea echipamentului necesar sterilizrii i lucrului la hota cu flux laminar de aer steril 1.3.9.3. Operaiunile ce se execut la hota cu flux laminar de aer steril 1.3.10. Principalii factorii fizici care influeneaz culturile de esuturi i celule vegetale 1.3.11. Infeciile i cauzele acestora 1.3.12. Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi n vitroculturile in vitro 2. CERCETRI PROPRII 2.1. SCOPUL CERCETRILOR EFECTUATE N CADRUL TEZEI DE DOCTORAT 2.2. MATERIALE I METODE UTILIZATE N PREZENTA TEZ DE DOCTORAT 2.2.1. Materialul vegetal utilizat n experimente- plante de Sedum telephium ssp. maximum 2.2.1.1. ncadrarea sistematic a speciei Sedum telephium ssp. maximum 2.2.1.2. Descrierea botanic a speciei Sedum telephium ssp. maximum Hoffm. iarb de urechi 2.2.1.3. Consideraii generale privind compoziia chimic a plantelor crescute n condii i naturale 2.2.1.3.1. Caracterizarea general a substanei uscate 2.2.1.3.2. Caracterizarea general a principalelelor elemente chimice prezente n plante 6 8 8 9 9 10 11 11 13 13 19 19 20 21 21 22 23 24 25 26 29 29 30 31 38 38 38 40 45 45 46 56 57 60 61 61 63 64 65 68 69 70 70 71 71 75 75 78 79 79

2.2.1.3.3. Caracterizarea general a principalilor compui organici prezen n plante 2.2.1.4. Produi chimici caracteristici plantelor din familia Crassulaceae 2.2.1.3.1. Acizi organici 2.2.1.3.2. Hidrai de carbon 2.2.1.3.3. Polifenoli 2.2.1.3.4. Alcaloizi 2.2.1.3.5. Cear 2.2.1.3.6. Ali compui organici prezeni n plantele din familia Crassulaceae 2.2.2. Spaiile de lucru i aparatura utilizat pentru efectuarea experimentelor. Prezentarea laboratorului de vitroculturi vegetale din cadrul Institutului de tiine ale Vieii, U.V.V.G Arad. 2.2.3. Vitroculturile vegetale tehnici utilizate 2.2.3.1.Compoziia mediului de cultur utilizat pentru operarea experimentelor efectuate cu explante de Sedum telephium ssp. maximum 2.2.3.2. Metoda de lucru utilizat de ctre noi n efectuarea experimentelor de vitrocultur la Sedum telephium ssp. maximum 2.2.3.2.1. Iniierea de vitroculturi de Sedum telephium ssp. maximum din apexuri recoltate de la tulpini tinere prelevate de la plante cultivate n natur 2.2.3.2.2. Germinarea n condiii aseptice a seminelor de Sedum telephium ssp. maximum pe mediul de cultur Murashige - Skoog (1962), agarizat, cu adaos de variai regulatori de cretere 2.2.3.2.3. Inocularea propagulilor de Sedum telephium ssp. maximum detaai din coloniile de frunzulie i de tulpinie (tufe) regenerate din embrionii zigotici ai seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962) suplimentat cu variai regulatori de cretere 2.2.3.2.4. Operarea de subculturi pe medii de cultur Murashige Skoog (1962), agarizate, cu adaos de variai regulatori de cretere, utiliznd minibutai caulinari, detaai din tulpiniele regenerate din propagulii vitrocultivai n experimentul precedent sau din minibutaii foliari, cu sau fr peiol, prelevai din culturile rezultate din propaguli 2.2.3.2.5. Operarea de subculturi pe medii de cultur aseptice solidificate cu granule sau sferule incolore sau colorate de poliacrilamid, utilizate ca nlocuitor de agaragar, folosind ca inoculi propaguli detaai din coloniile de tulpinie i de frunzulie regenerate din minibutaii caulinari sau foliari cu sau fr peiol, care au fost subcultivai tot pe medii de cultur Murashige Skoog (1962) cu adaos de variai regulatori de cretere 2.2.3.2 6. Regimul de vitrocultur i parametrii monitorizai 2.2.3.2.7. Prelucrarea matematic a datelor experimentale 2.2.3.3. Aclimatizarea exvitroplantulelor de Sedum telephium ssp.maximum la viaa n mediul septic 2.2.4. Tehnici de microscopie optic i electronic utilizate n cadrul lucrrilor efectuate n prezenta tez de doctorat 2.2.4.1. Tehnici utilizate n procedurile de microscopie optic 2.2.4.1.1. Obinerea preparatelor n vederea analizrii lor la microscopul optic 2.2.4.1.2. Obinerea preparatelor semifine n vederea cercetrii aspectelor ultrastructurale ce pot fi surprinse n celulele organelor vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum i a celor din cadrul natural 2.2.4.2. Tehnica de examinare la microscopul electronic cu transmisie (TEM) n vederea cercetrii ultrastructurii celulelor organelor vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum i a celor din cadrul natural 2.2.5. Dozarea principiilor active din frunzele de Sedum telephium ssp. maximum provenite din cadrul natural sau din vitrofrunzuliele de Sedum telephium ssp. maximum generate pe mediul de cultur MB-MS cu adaos de regulatori de cretere 2.2.5.1. Prelucrarea probelor luate n studiu 2.2.5.2. Protocolul de extracie i de evaluare a concentraiei fiecrui extract prin spectrometrie UV-VIS 2.3. REZULTATE I DISCUII

84 87 87 88 88 91 91 91 92

96 96 98 98 99

102

102

105

107 108 108 112 112 112 113

114

125

126 128

2.3.1. Tehnici fotografice concepute de noi pentru mbuntirea calitii imaginilor macroscopice 2.3.1.1. Adoptarea lupei de uz cosmetic, prevzut - pe partea ventral- cu dispozitiv circular de iluminare, pentru fotografierea fitoinoculilor 2.3.1.2. Lup prevzut cu un sistem original de iluminare cu LED -uri 2.3.1.3. mbuntirea calitii imaginii unui obiect fotografiat la stereolup, prin eliminarea umbrelor 2.3.2. Iniierea de vitroculturi de Sedum telephium ssp. maximum din apexuri prelevate de la tulpini tinere, recoltate de la plante cultivate n natur 2.3.2.1. Iniierea unei vitroculturi de Sedum telephium ssp. maximum din apexuri prelevate de la tulpini tinere crescute n cadru natural 2.3 2.1.1. Particulariti de metodic 2.3.2.1.2. Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor realizate din apexuri caulinare prelevate de la plante tinere provenite din mediu natural 2.3.2.1.3. Rezultate obinute n urma biometrizrilor efect uate la nivelul vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum iniiate din apexuri caulinare prelevate de la tulpini tinere crescute n cadru natural 2.3.2.2. Cercetri histoanatomice, comparative, efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum, culturi iniiate din apexuri caulinare fa de organele similare ale plantelor colectate din cadrul natural 2.3.2.2.1. Particulariti de metodic 2.3.2.2.2. Rezultate i discuii 2.3.3. Germinarea n condiii aseptice a seminelor de Sedum telephium ssp. maximum pe mediul de cultur Murashige-Skoog (1962), agarizat, cu adaos de variai regulatori de cretere 2.3.3.1. Particulariti de metodic 2.3.3.2. Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum iniiate din semine 2.3.3.3. Rezultate obinute n urma biometrizrilor efectuate la nivelul vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum iniiate din semine 2.3.4. Subcultura de propaguli de Sedum telephium ssp. maximum regenerai din embrionii zigotici ai seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige-Skoog (1962), agarizat, cu adaos de variai regulatori de cretere, pe medii aseptice similare ca i compoziie chimic cu a celor de pe care acetia au provenit 2.3.4.1. Particulariti de metodic 2.3.4.2. Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum realizate din subculturi de propaguli 2.3.4.3. Rezultate obinute n urma biometrizrilo r efectuate la nivelul vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum derivate din propaguli subcultivai 2.3.5. Operarea pe medii aseptice de subculturi utiliznd minibutai caulinari sau foliari, cu sau fr peiol, detaai din tulpiniele de Sedum telephium ssp. maximum regenerate din propagulii vitrocultivai 2.3.5.1. Utilizarea de medii de cultur agarizate 2.3.5.1.1. Particulariti de metodic 2.3.5.1.2. Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum realizate din minibutai 2.3.5.1.3. Rezultate i discuii 2.3.5.1.3.1. Biometrizrile efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum provenite din minibutai caulinari, apicali,cu 3 noduri, recoltai de la vitroplantule provenite din propaguli 2.3.5.1.3.2. Biometrizri efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum provenite din minibutai foliari, cu peiol, recoltai de la vitroplantule regenerate din propaguli 2.3.5.1.3.3. Biometrizri efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum provenite din minibutai foliari, lipsii de peiol, recoltai de la vitroplantule regenerate din propaguli 2.3.5.2. Formulri originale de solidificare a mediilor aseptice cu granule sau sferule, incolore sau colorate, de poliacrilamid, cu sau fr tre, pe care au fost inoculai i cultivai propaguli de Sedum telephium ssp. maximum 2.3.5.2.1. Particulariti de metodic 2.3.5.2.2. Aspecte morfologice observate la nivelul vitroculturilor realizate din propaguli de Sedum telephium ssp. maximum 2.3.6. Ivestigaii citologice efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum

129 129 131 135 138 138 138 140 142 147

147 148 152 152 153 155 161

161 162 169 175

175 175 176 180 180

185

189

194

194 196 199

2.3.6.1. Observaii de microscopie optic efectuate la nivelul apexului rdcinielor vitroplantulelor 2.3.6.1.1. Examinarea la microscopul optic a apexului radicular al vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum 2.3.6.1.1.1. Particulariti de metodic 2.3.6.1.1.2. Rezultate i discuii 2.3.6.2. Aspecte de microscopie optic i de ultrastructur surprinse la nivelul frunzelor plantelor de Sedum telephium ssp maximum recoltate din natur sau a vitroplantulelor 2.3.6.2.1. Aspecte de microscopie optic i de ultrastructur surprinse n celulele frunzelor plantelor de Sedum telephium ssp. maximum recoltate din natur 2.3.6.2.2. Examinarea la microscopul optic i la cel electron ic, cu transmisie, a preparatelor obinute din frunzuliele vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum cultivate in vitro pe mediu de baz Murashige -Skoog (1962), agarizat, cu adaos de benziladenin (BA) i acid indolilbutiric (AIB) cte 1,5 mg/l d in fiecare 2.3.6.2.3. Examinarea la microscopul optic i la cel electronic, cu transmisie, a preparatelor obinute din frunzuliele vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum cultivate pe mediu de baz Murashige-Skoog (1962),agarizat cu adaos de chinetin (KIN) i de acid alfa naftilacetic (ANA), cte 1,5 mg/l din fiecare 2.3.7. Aclimatizarea exvitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum provenite dintr-o vitrocultur realizat de pe medii MB-MS mbogite cu diferii regulatori de cretere 2.3.7.1. Particulariti de metodic 2.3.7.2. Rezultate i discuii 2.3.8. Dozarea unor compui biochimici i anorganici n fitoinoculii de Sedum telephium ssp. maximum 2.3.8.1. Particulariti de metodic 2.3.8.2. Rezultate experimentale 2.4. CONCLUZII GENERALE REALIZRI ORIGINALE I RECOMANDRI DE PERSPECTIV BIBLIOGRAFIE WEBOGRAFIE

199 199 200 200 205

207 224

241

259 259 260 268 268 271 284 288 290 313

PR E FA

Apariia biotehnologiei a produs o adevrat revoluie n procesul de proliferare a speciilor vegetale, prin mijloace moderne de lucru, ntr-un timp scurt putndu-se obine un numr nelimitat de exemplare, n raport cu posibilitile de nmulire a acestora prin intermediul tehnicilor tradiionale de propagare a plantelor de interes economic. Plantele obinute prin proceduri de biotehnologie vegetal, calitativ sunt net superioare celor obinute prin metode tradiionale de nmulire sexuat, ele permind n primul rnd realizarea de clone libere de viroze, dar i selectarea de genotipuri mai rezistente la diferii factori stresani existeni n condiiile naturale. Biotehnologia a permis, prin tehnicile ei specifice, rilor cu tradiie n ameliorarea i n cultivarea plantelor, s obin i s comercializeze cantiti imense de fructe, legume, flori sau de biomas vegetal, prin clonarea rapid a acestora, realizat prin vitropractici. Fitovitroculturile au revoluionat multe practici agricole, silvice, fitofarmaceutice, precum i cele de ameliorare i de genetic vegetal, dar i de morfologie i de fitofiziologie experimental. Astfel, pe lng elaborarea de proceduri valorificate n bioindustrii, au fost concepute tehnici de clonare i de micropropagare rapid a plantelor de interes economic, ori au fost gsite noi proceduri de valorificare n industrie a biomasei vegetale produse prin vitrocultur. Majoritatea studiilor efectuate n decursul secolului trecut, n domeniul vitroculturilor vegetale, au servit i servesc la elucidarea multor aspecte privind regenerarea, creterea, morfogeneza i organogeneza, embriogeneza somatic, autonomia morfofiziologic a unor structuri tisulare sau a unor tipuri celulare, n funcie de compoziia mediilor de cultur i a condiiilor ecofiziologice din recipientele de cultur i din camerele de cretere. Exist ns, nc, numeroase necunoscute cu privire la efectele unor factori implicai n morfogenez (la nivel celular i molecular), precum i referitor la transmiterea i exprimarea informaiei genetice dobndite din afara genomului propriu, prin mijlocirea tehnicilor de inginerie genetic. Pe de alt parte, dezvoltarea procedurilor de fitoterapie i extinderea unor astfel de tratamente n practicile medicale, moderne, au fcut ca o parte dintre bioindustriile actuale s se axeze pe obinerea de fitopreparate n bioreactoare, folosind ca ageni biologici suspensiile de celule vegetale, ceea ce a extins diversitatea procedurilor de biotehnologie vegetal. n consecin, gama speciilor vegetale utilizate n fitoterapie s-a amplificat zi de zi i valorificarea acestora prin intermediul tehnicilor de vitrocultur se afl ntr-o continu extindere. n acest context, atenia noastr s-a ndreptat nspre cercetarea posibilitilor de obinere a unor vitroculturi la o specie medicinal care este, nc, ntr-o mic msur valorificat din punct de vedere fitoterapeutic i anume a plantei Sedum telephium ssp. maximum, din literatura de specialitate lipsind referirile cu privire la vitrocultivarea acestei plante ce, actualmente, trezete din ce n ce mai mare interes n terapia cu plante. * * *

Aduc pe aceast cale mulumiri, n mod deosebit doamnei Prof. univ. dr. Dorina CachiCosma, pentru ntreg sprijinul acordat pe parcursul realizrii acestei teze de doctorat, precum i pentru efortul depus i rbdarea de care a dat dovad n formarea mea profesional. 7

Mulumirile mele se adreseaz i doamnei Conf. univ. dr. Turcu Violeta pentru ncrederea, susinerea, ndrumarea competent i permanent pe parcursul elaborrii i redactrii tezei de doctorat. Mulumiri speciale colegilor din cadrul Facultii de tiine ale Naturii, Inginerie i Informatic i colegilor de la Institutul de tiine ale Vieii al Universitii de Vest Vasile Goldi din Arad, care mi-au oferit sprijinul i prietenia lor pe ntreaga perioad de elaborare a tezei. De asemenea, mi exprim cu drag recunotina fa de familia mea, pentru suportul moral i nelegerea acordat n toi aceti ani de studiu. De aceea pot s spun c succesul meu este i succesul dumneavoastr!

INTRODUCERE
n studiul nostru, ne-am propus s contribuim nu numai la cunoaterea i caracterizarea morfologic, anatomic, fiziologic i biochimic a speciei Sedum telephium ssp. maximum, mai puin intrat n atenia cercettorilor notri din domeniul botanicii farmaceutice, dei aceasta este o plant des ntlnit n flora spontan a Romniei, care face parte dintr-o familie de plante - familia Crassulaceae - cu particulariti deosebite n ceea ce privete coninutul organelor ei vegetative n variai compui chimici, valoroi, ci i la identificarea unei modaliti de clonare rapid a acestei plante, prin folosirea tehnicilor de micropropagare a acesteia. ntr-un viitor apropiat datorit produilor secundari de metabolism pe care ea i sintetizeaz, aceast specie ar putea deveni de interes pentru procedurile biotehnologice pentru obinerea de substrate fitofarmaceutice. n ceea ce privete micropopagarea in vitro a acestei specii, ne-am propus ca prin schimbarea concentraiilor nutriionale i fitohormonale, respectiv a regulatorilor de cretere, din mediul n care se afl cultivate explantele de Sedum telephium ssp. maximum, precum i prin reglarea condiiilor de cultur, s reuim s elaborm o tehnologie de propagare rapid a acestei specii n regim de vitrocultur. ntruct, din punct de vedere histoanatomic aceast specie a fost foarte puin cercetat, aa cum rezult mai cu seam din tratatele de sintez efectuate n ceea ce privete anatomia dicotiledonatelor ori asupra angiospermelor, n general, n cadrul prezentei teze de doctorat ne-am propus s efectum i un studiu histologic i citologic la nivelul organelor vegetative (subterane i supraterane) crescute n cadrul natural sau n regim de vitrocultur i s investigm capacitatea vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum de a produce unele principii active, utile n industria farmaceutic, deoarece specia cu care am experimentat noi, respectiv Sedum telephium ssp. maximum, din acest punct de vedere nu apare citat n literatura de specialitate, care trateaz plantele medicinale. Lucrarea de fa intitulat Studiul morfoanatomic, fiziologic i biochimic al speciei Sedum telephium ssp. maximum vitrocultivat, este structurat pe 2 capitole, ce vizeaz consideraii generale privind vitroculturile vegetale i cercetrile proprii care cuprind scopul cercetrilor efectuate, materialul i metodele de lucru utilizate, rezultatele obinute i concluziile generale. Studiul se ncheie cu realizrile originale i recomandri de perspectiv. n teza de doctorat sunt prezentate 69 de figuri, din care doar 5 sunt preluate din literatura de specialitate sau sunt descrcate de pe site-uri, 38 fiind imagini macroscopice originale, 20 sunt grafice originale i 6 scheme originale. De asemenea, n tez sunt incluse 11 tabele, din care 5 sunt ntocmite pe baza cercetrilor i rezultatelor obinute. Teza de doctorat cuprinde 317 pagini tehnoredactate , din care 295 sunt pagini text, 21 pagini de bibliografie, nsumnd 269 titluri citate, un numr nsemnat din aceste lucrri (60 de titluri) fiind publicate dup anul 2000, precum i o pagin de webografie, nsumnd 22 site-uri, iar n final, sunt prezentate lucrrile tiinifice din cadrul tezei de doctorat care au tangen cu subiectul tezei de doctorat, din care o lucrare se afl sub tipar. Lucrarea se ncheie cu 3 anexe care fac parte din dosarele cu propuneri de lucrri depuse la OSIM Bucureti i nregistrate de aceast comisie pentru brevetare. Capitolul 1 cuprinde partea de Consideraii generale (total 61 de pagini) n care sunt detaliate aspecte referitoare la prezentarea domeniului de cercetare al biotehnologiei vegetale sub aspect teoretic i practic, un scurt istoric al cercetrilor din domeniul biotehnologiei vegetale pe plan naional i internaional, detalierea aspectelor legate de organizarea unui laborator de culturi de esuturi i celule vegetale, precum i date din literatura de specialitate cu privire la valorificarea vitroculturilor vegetale n scopul obinerii de produi secundari de metabolism. Capitolul 2 cu un numr total de pagini de 218 - este structurat pe urmtoarele pri componente : Scopul cercetrilor efectuate n care este prezentat principalul obiectiv al prezentei lucrri de doctorat, respectiv cultivarea in vitro, pe medii artificiale, cu o balan hormonal variat, 9

a explantelor provenite de la planta de Sedum telephium ssp. maximum, precum i efectuarea de studii citologice i biochimice la nivelul organelor plantulelor regenerate n vitrocultur, din variate categorii de fitoinoculi; Materiale i metode utilizate n care se regsete o schem general privind organizarea experimentelor de vitrocultur din cadrul tezei de doctorat, precum i 4 subcapitole care descriu din punct de vedere botanic i biochimic familia i genul din care face specia luat n studiu dar i caracterizarea botanic i ncadrarea sistematic a speciei studiate. Dup prezentarea spaiului, a aparaturii i a metodelor i modului de lucru, sunt interpretate i discutate rezultatele obinute n subcapitolul Rezultate i discuii din care se extrag concluziile generale ce sunt expuse n subcapitolul Concluzii generale.

2.2. MATERIALELE I METODELE DE LUCRU UTILIZATE N PREZENTA TEZ DE DOCTORAT

2.2.1. Materialul vegetal utilizat n experimente - plante de Sedum telephium ssp.

maximum
Pentru iniierea vitroculturilor de Sedum telephium ssp. maximum am folosit, mai nti, ca material vegetal, apexuri prelevate de la tulpini tinere, de cca. 1 cm, recoltate de la plante mame cultivate n condiii naturale. Aceast etap a reprezentat o tatonare a capacitii reactive a diferitelor tipuri de explante de Sedum telephium ssp. maximum recoltate de la plante crescute n cadru natural, pentru depistarea celui mai bun agent dezinfectant utilizabil n sterilizarea materialului vegetal de la care vor fi prelevate explante ce vor fi inoculate in vitro, pe mediu aseptic cu adaos de variai regulatori de cretere, analizndu-se care este cel mai eficient compus de acest tip n iniierea unei vitroculturi i urmrirea creterii vitroplantulelor. A doua serie de vitroculturi a constat din semine care au fost puse la germinat n condiii aseptice, pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962), agarizat, modificat de noi i suplimentat cu variai regulatori de cretere, din care au rezultat fitoinoculi n form de tufe (Tab. 4, experimentul 2) care, mai apoi, au fost separate n propaguli. O parte dintre aceti propaguli au fost supui unui proces de aclimatizare, n timp ce, ali propaguli au fost subcultivai pe acelai tip de mediu de cultur de pe care au provenit (MB - MS, agarizat, modificat de noi i suplimentat cu variai regulatori de cretere, de aceeai concentraie) n scopul examinrii reaciei lor la substanele de cretere existente n substratul de cultur (Tab. 4, experimentul 3). n continuarea acestor experimente, vitroplantulele regenerate din propagulii subcultivai, au fost analizate din punct de vedere: morfologic, citologic (cu ajutorul microscopiei optice i electronice de transmisie) i biochimic. Dup 60 de zile de la inoculare (Tab. 4, experimentul 4) aceste vitroplantule regenerate din propaguli au fost fragmentate n minibutai caulinari, apicali, cu cte trei noduri i n minibutai de tip foliar, cu sau fr peiol, ce au fost subcultivai pe acelai tip de mediu de cultur de pe care s-au regenerat vitroplantulele din care acetia au provenit, respectiv Murashige - Skoog (1962), agarizat, modificat de noi i suplimentat cu variai regulatori de cretere, de aceeai concentraie. Propagulii regenerai din aceti minibutai, dup 60 de zile de cultivare a lor n regim aseptic pe mediile menionate anterior, au fost transferai pe un mediu de cultur proaspt, Murashige Skoog (1962), modificat de noi, cu adaos de variai regulatori de cretere, dar n care am nlocuit agar - agarul (ca agent de solidificare), fie cu granule de poliacrilamid (Tab. 4, experimentul 5), fie cu poliacrilamid pulverulent n amestec cu tre. Trele, pe lng o afnare a mediului de cultur, datorat gruncioarelor de aleuron, aduc n substrat un supliment de inozit fosfat de Ca i Mg i de proteine. De asemenea, la nivelul acestora se gsesc aderente, pe faa interioar a lor, gruncioare de amidon, care mpreun cu apa, la autoclavare, genereaz un gel ce contribuie i el la consolidarea mediul de cultur, iar n funcie de densitatea trelor n mediu, acesta devine optim pentru a temporiza creterea fitoinoculilor, metod util n pstrarea vitroculturilor vegetale ntr-un regim de cretere lent.

10

2.2.2. Descriere botanic a speciei Sedum telephium ssp. maximum Numele genului Sedum provine din limba latin, de la cuvntul sedare, care nseamn a potoli; specia Sedum telephium ssp. maximum are frunze suculente, care sunt cunoscute din medicina tradiional romneasc c au capacitatea de a atenua durerile provocate de rni.

Fig. 1. Imagine de ansamblu privind specia Sedum telephium ssp. maximum ncadrat n genul Sedum (www.wikipedia.ro). Sedum telephium ssp.maximum este o plant ierboas, peren, ce prezint n pmnt un rizom napiform. Rdcinile sunt subiri, fusiforme sau tuberculiforme. Tulpinile sunt nalte de 20 50 (70) cm, erecte, simple sau ramificate n partea superioar, glabre, verzi nchis. Frunzele de Sedum telephium ssp. maximum sunt crnoase, la baza plantelor existnd un numr de frunze dispuse n rozet. Inflorescena este un corimb terminal dens. Fructele sunt formate din 5 folicule ngustate spre baz i terminate cu un vrf ascuit. Seminele lunguiee au 1 - 2 mm lungime i sunt cafenii. ntrebuinri: n medicina tradiional romneasc acestei plante i se atribuie efecte antiseptice i cicatrizante, deoarece frunzele conin: mucilagii, resine, principii amare, pectin, substane grase, sruri organice, leucoantociani totali, leucocianidine, flavonoide totale, kemferol i altele. Aceti compui sunt utilizai ca avnd efecte astringente, cicatrizante, emoliente i epitelizante, n toate cazurile de ulceraii cutanate.

11

2.2.3. Vitroculturile vegetale tehnici utilizate 2.2.3.1. Compoziia mediului de cultur utilizat pentru operarea experimentelor efectuate cu explante de Sedum telephium ssp. maximum Substratul de cultur utilizat n cadrul tuturor experimentelor a fost constituit din mediu de baz (MB) Murashige - Skoog (1962) (MS) agarizat, modificat de noi, care a constat din macroelemente, Fe EDTA i microelemente, amestec mineral conform cu reeta original, dar cu adaos sporit de vitamine: piridoxin HCl, tiamin HCl i acid nicotinic (cte 1 ml/l fiecare fa de reeta original unde se indic 0,5 mg/l ), compoziie la care s-a adugat m inozitol 100 mg/l, zaharoz 30 g/l i agar - agar 7 g/l (fa de 10 g/l n reeta original); la acest mediu de baz (MB) sau adugat regulatori de cretere (citochinine i auxine) separat sau n amestec, ct i alte substane (granule de poliacrilamid), dup caz, n funcie de tipul de experiment organizat. Prealabil asepsizrii mediului de cultur, pH-ul acestuia a fost reglat la valoarea de 5,7, cu acid clorhidric sau cu NaOH, n funcie de bazicitatea sau de aciditatea mediului final. Cte 15 ml de mediu au fost introdui n recipientele de cultur din sticl incolor, termorezistent, cu nlime de 10 cm i cu diametrul de 3 cm, cu excepia recipientelor n care au fost efectuate subculturi pe mediul Murashige - Skoog (1962) solidificat cu granule de poliacrilamid, vase care au avut nlimea de 8 cm i diametrul de 4 cm; pentru autoclavare, recipientele, n cazul tuturor experimentelor efectuate n prezenta lucrare, dup porionarea mediului de cultur, au fost obturate cu folie de aluminiu. Sterilizarea recipientelor cu medii de cultur s-a realizat prin autoclavare, la temperatura de 121C, timp de 23 de minute. 2.2.3.2. Metoda de lucru utilizat de ctre noi n efectuarea experimentelor de vitrocultur la Sedum telephium ssp. maximum Iniierea de vitroculturi de Sedum telephium ssp. maximum din apexuri, de 0,5 cm, recoltate de la tulpini neflorifere prelevate de la plante cultivate n natur. Germinarea seminelor de Sedum telephium ssp. maximum n condiii aseptice, pe mediul de cultur Murashige - Skoog (1962) cu adaos de variai regulatori de cretere. n cea de-a 21-a zi de vitrogerminaie, tufele de Sedum telephium ssp. maximum regenerate din embrionii zigotici, pe mediul de cultur suplimentat cu variai regulatori de cretere, au fost dezmembrate n propaguli ce au fost subcultivai pe un acelai tip de mediu de cultur. O parte dintre propaguli nu au mai intrat n regimul de vitrocultur, ci au fost transferai ex vitro i au fost aclimatizate la regimul de via n mediul septic. De la vitroculturile regenerate din propagulii subcultivai in vitro pe aceleai tipuri de medii de cultur de pe care ei au provenit, timp de 60 de zile, s-au prelevat minibutai caulinari, apicali, trinodali de circa 1 cm sau minibutai foliari cu sau fr peiol, ce au fost subcultivai tot pe aceleai tipuri de medii de cultur pe care s-au format. Operarea de subculturi de propaguli pe aceleai variante de medii de cultur aseptice, dar solidificate n loc de agar-agar cu sferule de poliacrilamid, incolore sau variat colorate, cu sau fr tre cu adaos de diferii regulatori de cretere, identici cu cei de pe variantele de medii de pe care acetia au provenit.

1. 2. 3.

4.

5.

12

2.3. REZULTATE I DISCUII

2.3.1. Tehnici fotografice concepute de noi pentru mbuntirea calitii imaginilor macroscopice Noi tehnici de fotografiere, adoptate sau modificate de noi, n scopul obinerii de imagini macroscopice ale fitoinoculilor, cu nalt nivel de rezoluie i relevan, concepute i inserate n prezenta tez de doctorat, au fost depuse ca inovaii, sub forma a unui dosar , care a fost nregistrat la OSIM Bucureti cu numrul din data 07.03.2012 cu numrul de nregistrare A/00148, acolo unde se afl n examinare la comisia de specialitate. n studiul nostru, ne-am hotrt ca n scopul sporirii calitii imaginilor fotografice s utilizm noi ci sau metode tehnice. Aadar am descris cteva procedee de fotografiere a fitoinoculilor, care ne-au permis s obinem fotografii de calitate superioar, posibil de publicat n reviste de specialitate, cu nalt cotare.

Fig. 2. Fitoinocul de Sedum telephium ssp. maximum transferat ex vitro i fotografiat la lupa din laborator (A) i acelai fitoinocul fotografiat la lupa cosmetic (B), unde: u-umbre

Fig. 3. Colonie de Sedum telephium ssp.maximum fotografiat la o lup de laborator (A) aspectul aceluiai fitoinocul fotografiat la o lupa dotat cu 6 LED-uri (B). 2.3.2. Iniierea de vitroculturi de Sedum telephium ssp. maximum din apexuri prelevate de la tulpini tinere, recoltate de la plante cultivate n natur La msurtorile efectuate n cea de a -30-a zi de la inocularea minibutailor apicali prelevai de la lstari de plante de Sedum telephium ssp. maximum din cadrul natural pe mediu de cultur potrivit variantei 1V3 (mediu de cultur MB-MS cu adaos de 1 mg/l BA n amestec cu 1 mg/l AIB), lungimea medie a ntregii plantule a atins un maxim de 5,03 cm valori depind lotul martor 1V0 13

(0,73 cm).n ceea ce privete formarea de frunzulie, cele mai multe s-au generat pe varianta 1V3 (mediu de baz MB- MS suplimentat cu 1 mg/l BA n amestec cu 1 mg/l AIB), numrul mediu de frunzulie a fost de 9,73 frunzulie/inocul marcnd 62,16%.

Fig. 32. Evoluia comparativ a vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum, la 30 de zile de la inocularea in vitro a apexurilor prelevate de la tulpini tinere recoltate de la plante cultivate n cadrul natural. Cele mai ridicate valori medii privind numrul ramificaiilor rdciniei principale, s-au constatat la minibutaii crescui pe varianta 1V3 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1 mg/l BA n amestec cu 1 mg/l AIB) unde am obinut 5,3 ramificaii/inocul. Rizogeneza s-a manifestat doar pe varianta de mediu 1V3 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1 mg/l BA n amestec cu 1 mg/l AIB) unde am obinut 5,4 rdcinie/inocul. 2.3.2.2. Cercetri histoanatomice, comparative, efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum, culturi iniiate din apexuri caulinare fa de organele similare ale plantelor colectate din cadrul natural n vederea cercetrii din punct de vedere histoanatomic s-au efectuat preparate permanente (colorate i fixate) din organe vegetative (rdcinie i tulpinie) de Sedum telephium ssp. maximum, recoltate de la vitroplantule cu dimensiunea de 6-8 cm, crescute timp de 60 de zile pe varianta de mediu 1V3 obinut anterior, respectiv pe mediul de cultur Murashige-Skoog (1962) mbogit cu 14

AIB plus BA 1 mg/l fiecare, singura variant care a prezentat i rizogenez. n acelai timp, au fost colectate organe vegetative subterane i supraterane (rdcini i tulpini aeriene) ale speciei Sedum telephium ssp. maximum, cultivat n natur i de aceeai vrst cu vitroplantulele. ntr-o seciune transversal prin rdcin att n cazul vitroplantulelor ct i n cazul plantelor crescute n cadrul natural, se observ o periderm format din mult suber cu celule cu perei tabulari din care au mai rmas 4-6 straturi de celule turtite, cu perei subiri. n cazul seciunii transversale printr-o tulpin tnr conturul seciunii este circular-oval, att la plantele de Sedum telephium ssp. maximum crescute n natur ct i la vitroplantule. Cilindrul central este un inel compact format, relativ gros, reprezentat de 6-7 fascicule libero-lemnoase de tip colateral-nchis, de diferite dimensiuni fa de cilindrul central al tulpinii vitroplantulelor care cuprinde 4-5 fascicule conductoare libero-lemnoase

Plana 1, Fig. 1-6: Seciune transversal efectuat prin rdcina de Sedum telephium ssp. maximum (Fig.1: plante din natur i Fig.2: plante cultivate in vitro); seciune transversal prin periderm i scoar (Fig. 3: plante din natur i Fig. 4: plante cultivate in vitro); seciune prin cilindrul central (Fig. 5: la plante din natur i Fig. 6: la plante cultivate in vitro) (dup Ardelean i colab., 2009). 15

Plana 2, Fig. 1-6: Seciune transversal efectuat prin tulpina de Sedum telephium ssp. maximum (Fig.1: plante din natur i Fig.2: plante cultivate in vitro); seciune prin epiderma tulpinii (Fig.3:plante din natur i Fig.4: plante cultivate in vitro); seciune prin cilindrul central al tulpinii (Fig.5: plante din natur i Fig.6: plante din in vitro) (dup Ardelean i colab., 2009). 2.3.3. Germinarea n condiii aseptice a seminelor de Sedum telephium ssp. maximum pe mediul de cultur Murashige - Skoog (1962), agarizat, cu adaos de variai regulatori de cretere n scopul gsirii unei metode ct mai eficient, care s permit exprimarea potenialului morfogenetic al explantelor de Sedum telephium ssp. maximum, n continuare, am nfinat a doua serie de vitroculturi pornind de data aceasta de la semine ajunse n faza de maturitate. 16

Fig. 35. Evoluia comparativ a plantulelor de Sedum telephium ssp. maximum de la inocularea in vitro a seminelor pe medii de cultur MB -MS (1962) cu diferii regulatori de cretere, crescute n form de tuf la 30 de zile pe variantele de mediu: 2V0 - varianta martor pe mediu MB-MS lipsit de regulatori de cretere; 2V1` - varianta experimental pe mediu MB -MS cu BA n concentraie de 1,5 mg/l ; 2V2`- varianta experimental pe mediu MB-MS cu AIB n concentraie de 1,5 mg/l; 2V3` - varianta experimental pe mediu MB-MS cu BA n concentraie de 1,5 mg/l i AIB n concentraie de 1,5 mg/l.; 2V4 - varianta experimental pe mediu MB-MS cu KIN n concentraie de 1,5 mg/l i ANA n concentraie de 1,5 mg/l.

La 30 de zile de la inocularea semnelor ,lungimea medie a plantulei a atins un maxim de 6,8 cm la inoculii crescui pe varianta de mediu suplimentat cu un adaos de 1,5 mg/l KIN i ANA (2V4 ) . n ceea ce privete formarea de frunzulie, cele mai multe s-au generat pe varianta 2V4 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA), numrul mediu de frunzulie a fost de 10 frunzulie/inocul. Limea medie a frunzuliei celei mai mari a fost de 0,85 cm cu un spor de 369,56% la varianta de mediu 2V4 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA). Rizogeneza s-a manifestat pe toate variantele testate, ns pe varianta de mediu 2V4` (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA) am obinut valoarea de 5,33 rdcinie/inocul . Valoarea lungimii rdcinielor la aceast variant fiind de 2,7 cm, marcnd un spor de 434,78% . Deci, din experimentul efectuat n cadrul acestui subcapitol se poate conclude faptul c cele mai ridicate valori privind rizogeneza, filogeneza i numrul ramificaiilor/ fitoinocul s-au obinut pe variantele cu amestec de regulatori de cretere, respectiv: 2V4 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA), urmat de varianta - aa cum era de ateptat- 2V3` (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1,5 mg/l AIB). 17

2.3.4. Subcultura de propaguli de Sedum telephium ssp. maximum regenerai din embrionii zigotici ai seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962), agarizat, cu adaos de variai regulatori de cretere, pe medii aseptice similare ca i compoziie chimic cu a celor de pe care acetia au provenit Spre deosebire de experimentele precedente, n care am realizat culturi primare de Sedum telephium ssp. maximum, pornind de la apexuri caulinare sau de la semine germinate n regim aseptic , acest experiment a presupus realizarea unei subculturi de Sedum telephium ssp. maximum utiliznd ca inoculi propaguli detaai din coloniile de frunzulie i de tulpinie ce au alctuit tufele ce s-au regenerat din embrionii seminelor de Sedum telephium ssp. maximum, germinate pe mediul de cultur, agarizat Murashige - Skoog (1962), modificat de noi n ceea ce privete aportul de vitamine, suplimentat cu variai regulatori de cretere, administrai singuri sau n amestec, respectiv BA (benziladenin) n concentraie de 1,5 mg/l sau AIB (acid indolilbutiric) n concentraie de 1,5 mg/l n plus, am utilizat i o variant care a constat dintr-un amestec de BA n concentraie de 1,5 mg/l i AIB n concentraie de 1,5 mg/l ori amestec de KIN (chinetin) n concentraie de 1,5 mg/l i ANA (acid naftilacetic) administrat n concentraie de 1,5 mg/l. La 30 de zile de la inocularea in vitro a propagulilor lungimea medie a plantulei a atins un maxim de 3,6 cm la inoculii crescui pe varianta de mediu suplimentat cu un adaos de 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA (3V4) valori depind lotul martor 3V0 (2cm). n ceea ce privete formarea de frunzulie, cele mai multe s-au generat pe varianta 3V3` (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1,5 mg/l AIB), numrul mediu de frunzulie a fost de 8 frunzulie/inocul . Cele mai ridicate valori medii privind numrul ramificaiilor, s-au constatat la minibutaii crescui pe varianta 3V4 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA) unde am obinut 5,33 ramificaii/inocul cu un spor de 319,16% (Fig. 44D; Fig. 45D), lungimea ramificaiilor atingnd o maxim valoare medie de 1,43 cm i un spor de 130% (Fig. 44E; Fig. 45E), iar din punct de vedere statistic diferena a fost distinct semnificativ n ambele cazuri (Tab.10 ). Rizogeneza s-a manifestat pe toate variantele testate, doar pe varianta de mediu 3V3` (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1,5 mg/l AIB) unde am obinut cte 6,33 rdcinie/inocul marcnd un spor de 237,07% (Fig. 44F; Fig. 45F), dar valoarea cea mai mare (2,4 cm) n ceea ce privete lungimea rdcinielor a fost atins la varianta 3V4 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA). marcnd un spor de 197,34% (Fig. 44G; Fig. 45G). Din observaiile efectuate n cadrul acestui experiment din prezentul subcapitol se poate concluziona c, cele mai ridicate valori privind rizogeneza, filogeneza i numrul ramificaiilor/ fitoinocul s-au obinut, la fel ca i n experimentul anterior, la variantele de mediu ce conineau cu amestec de regulatori de cretere, respectiv la varianta 3V4 (mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA) urmat de varianta 3V3`(mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1,5 mg/l AIB) .

18

Fig. 38. Evoluia comparativ a plantulelor de Sedum telephium ssp. maximum de la subcultura propagulilor pe medii de cultur MB-MS (1962) cu diferii regulatori de cretere, crescute n form de tuf la 30 de zile pe variantele de mediu: 3V0 - varianta martor pe mediu MB-MS lipsit de regulatori de cretere; 3V1` - varianta experimental pe mediu MB-MS cu BA n concentraie de 1,5 mg/l ; 3V2`- varianta experimental pe mediu MB-MS cu AIB nconcentraie de 1,5 mg/l; 3V3` - varianta experimental pe mediu MB-MS cu BA n concentraie de 1,5 mg/l i AIB n concentraie de 1,5 mg/l; 3V4 - varianta experimental pe mediu MB -MS cu KIN n concentraie de 1,5 mg/l i ANA n concentraie de 1,5 mg/l.

Dup 60 de zile, la vizualizarea cu ochiul liber a limburilor foliare i a apexurilor radiculare, ale fitoinoculilor crescui pe mediu MB-MS cu BA plus AIB, ca regulatori de cretere, precum i a celor vitrocultivai pe mediu MB-MS cu aport de KIN i ANA s-a observat un proces interesant, proces care a constat ntr-o colorare n rou a unora dintre celulele epidermale ale frunzulielor i tulpinielor dar i a apexurilor rdcinielor, fenomene care nu au mai fost constatate la alte tipuri de fitoinoculi i nici ntr-un caz la vrfurile radcinielor plantelor crescute n condiii naturale sau n germinatoare. Aceast colorare s-ar putea datora acumulrii n vacuolele unor astfel de celule a antocianilor, nivelul acestora fiind crescut la extractele preparate din frunzulie recoltate din vitrocultur, n special a celor provenite de pe mediu MB MS cu aport de KIN plus ANA cte 1,5 mg l, fiecare. 19

Fig. 42 A - E- Aspecte morfologice asupra frunzulielor vitroplantulelor (A i B) de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MB-MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1,5 mg/AIB ( 3V3`), generate din propaguli detaai din coloniile de frunzulie i de tulpinie (tufe) regenerate din embrionul zigotic al seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962) suplimentat cu variai regulatori de cretere, la 60 de zile de la inoculare in vitro la care se observ pigmentaia roie, unde: A- zona nodal; Bneofrunzulie; C- epiderma superioar a vitrofrunzuliei vzut la stereolup (nr-nervur); D- vrf limb foliar (ca- celule cu antociani); E-baza limbului foliar, examinate cu o stereolup.

Fig. 43 A D - Aspecte morfologice asupra rdcinielor vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MB - MS cu 1,5 mg/l KIN i 1,5 mg/l ANA ( 3V4), generate din propaguli detaai din coloniile de frunzulie i de tulpinie (tufe) regenerate din embrionul zigotic al seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige Skoog suplimentat cu variai regulatori de cretere, la 60 de zile de la inoculare in vitro ce prezint vrful rou, unde: f- frunzuli; r- rdcini; amsc- apex meristematic i celule caliptrale; pa- periori absorbani, examinate cu stereolupa.

20

2.3.5. Operarea pe medii aseptice de subculturi utiliznd minibutai caulinari sau foliari, cu sau fr peiol, detaai din tulpiniele de Sedum telephium ssp.maximum regenerate din propagulii vitrocultivai Experimentul de fa a urmrit studierea capacitii regenerative i de organogenez a fragmentelor de Sedum telephium ssp. maximum, utilizate ca inoculi n vitrocultur, care au fost prelevate din zone diferite ale vitroplantulelor provenite din propagulii detaai din coloniile de frunzulie i de tulpinie (tufe) regenerate din embrionul zigotic al seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige Skoog suplimentat cu variai regulatori de cretere, respectiv: BA (benziladenin), AIB (acid indolilbutiric), BA (benziladenin) cu AIB (acid indolilbutiric) i KIN (chinetin) cu ANA (acid naftilacetic). Inoculii au constat din minibutai caulinari de circa 1 cm lungime prezentnd zona apical i 3 noduri, precum i minibutai de limb foliar, cu sau fr peiol, cu lungimea de circa 1 cm detaai de la vitroplantule de Sedum telephium ssp. maximum crescute timp de 60 de zile n regim de vitrocultur. La 30 de zile au fost observate urmtoarele: regenerarea de tulpinie din explante de tip minibuta caulinar trinodal, prelevate de la nivelul plantulelor de Sedum telephium ssp. maximum, obinute prin tehnici de micropropagare, pe mediile de baz MS agarizat cu un adaos de auxin sau citochinin, au nregistrat valori maxime. n ceea ce privete formarea de frunzulie, mediul de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1 mg/l AIB a favorizat generarea acestora i creterea dimensiunii lor, respectiv formarea de mugurai. Adaosul de 1 mg/l KIN n amestec cu 1 mg/l ANA a favorizat apariia calusului la inoculii de tip minibutai de tip limb foliar fr peiol. Rizogeneza s-a manifestat pe toate variantele testate, doar dup 30 de zile de la nfiinarea culturii, cele mai multe generndu-se la nivelul minibutailor de tip caulinar trinodal pe varianta de mediu MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l BA n amestec cu 1 mg/l AIB.

Fig. 46. Regenerarea de vitroplantule de Sedum telephium ssp. maximum, pe mediu mineral de baz MB MS suplimentat cu KIN 1,5 mg/ln amestec cu 1 mg /l ANA (4V4), la 30 de zile (B i C) i la 60 de zile (D) de la inoculare in vitro, din minibutai caulinari apicali, cu cte 3 noduri.

21

Fig. 49. Evoluia minibutailor de tip limb foliar fr peiol Sedum telephium ssp.maximum, care au generat calus morfogen, la 7 zile (A), la 30 de zile (B), i la 60 de zile (C) de la inoculare in vitro.

Regenerarea de tulpinie din explante de tip minibutai din frunze, prelevate de la nivelul plantulelor de Sedum telephium ssp.maximum, obinute prin tehnici de micropropagare, att pe un mediu de baz MS agarizat cu un adaos de auxin sau citochinin, au nregistrat o oarecare ntrziere n ceea ce privete declanarea formrii frunzulielor i ramifcaiilor regenerai din acestea. Dar, odat iniiat pe un mediu de cultur unde era adugat un amestec de regulatori de cretere, acest proces de cretere, a continuat s dea rezultate satisfctoare. 2.3.5.2. Formulri originale de solidificare a mediilor aseptice cu granule sau sferule, incolore sau colorate, de poliacrilamid, cu sau fr tre, pe care au fost inoculai i cultivai propagulii de Sedum telephium ssp. maximum L. n urma experimentelor efectuate n prezenta tez de doctorat, am reuit s elaborm dou noi formulri de reete de medii de cultur, utilizabile n solidificarea substratului care dup autoclavare i rcire poate fi folosit pentru cultivarea in vitro a diferitelor tipuri de fitoinoculi, inclusiv a propagulilor de Sedum telephium ssp. maximum, reet care ca nlocuitor de agar-agar preconizeaz utilizarea poliacrilamidei, sub form de sferule sau granule, incolore sau colorate, la care n scopul realizrii de vitroculturi cu cretere lent (folosite n Bncile de gene vegetale, sau n coleciile de clone), ce permit mrirea intervalului de subcultur am conceput adugarea la astfel de medii a unei cantiti de tre (n concentraii variabile), cu ct concentraia acestora este mai mare, cu att se poate prelungii mai mult intervalul de subcultur. Totodat, am efectuat un alt experiment prin care am nlocuit agar-agarul cu poliacrilamid pulverulent n amestec cu tre. Trele pe lng o afnare a mediului de cultur, datorit gruncioarlor de aleuron aduc n substrat un supliment de inozit fosfat de Ca i Mg i de proteine (din cristaloidul acestora); totodat, trele au aderente pe faa interioar a lor gruncioare de amidon, care mpreun cu apa, la autoclavare, genereaz un gel ce consolideaz mediul de cultur. Aportul de tre n amestec cu poliacrilamid reduc preul de cost al mediului de cultur. Atunci cnd trele depesc concentraia de 15/20 g la litru de mediu din cauza sporirii vscozitii substratului, acesta devine optim pentru a temporiza creterea fitoinoculilor, metoda util n pstrarea vitroculturilor vegetale ntr-un regim de cretere lent.

22

Fig. 57 A D - Propaguli de Sedum telephium ssp.maximum crescui pe medii solidificate cu sferule fine de poliacrilamid: incolore dup 24 h de imbibare n ap (A) i colorate dup 24h de imbibare n ap (B); detaliu privind creterea fitoinoculului de Sedum telephium ssp.maximum crescui pe medii solidificate cu sferule fine de poliacrilamid incolore, dup 24 h de imbibare a lor n ap ( C), vitroculturi aflate n cea de a-30- zecea zi de la subcultivarea in vitro a propagulilor, pe astfel de medii.

Avantajele utilizrii unor astfel de medii de cultur rezid nu numai n faptul c, ele prezint un efect estetic ce deschide noi posibiliti de valorificare prin comercializare a unor astfel de fitoinoculi (n special a celor constnd din boboci), ci i pentru c astfel de medii sunt mult mai puin costisitoare dect cele gelificate cu agar-agar, ntruct dac comparm costul agar-agarului de tip Difco Bacto Agar, utilizat de regul n solidificarea mediilor de cultur, al crui pre per un litru de mediu este de 28 Roni, iar preul unor astfel de sferule de poliacrilamid uti lizate n experimentele noastre este de 1 Ron.

Fig. 59 A B - Propaguli de Sedum telephium ssp.maximum crescui pe mediu cu poliacrilamid pulverulent, incolor, n amestec cu tre, culturi fotografiate n cea de a- 7-a zi (A) i n a 30-zecea zi (B) de la operarea inoculrii.

23

2.3.6. Investigaii citologice efectuate la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum L. 2.3.6.1. Observaii de microscopie optic efectuate la nivelul apexului rdcinielor vitroplantulelor 2.3.6.1.1. Examinarea la microscopul optic a apexului radicular al vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum n urma examinrii la microscopul optic a apexurilor radiculare ale vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum sau a rdcinielor regenerate la nivelul calusului (Pl.4, Fig.1) am constatat faptul c, att celulele caliptrale, ct i meristemul (situat subapical) au fost colorate n rou (Pl.5-7) n special la fitoinoculii cultivai pe mediu MB-MS suplimentat cu amestec de KIN i ANA (1,5mg/l din fiecare).

Plana 7, Fig. 1 - 4: Aspecte histocitologice observate la microscopul optic pe preparate proaspete de Sedum telephium ssp. maximum executate din apex de rdcinie regenerate la nivelul vitroplantulelor generate din propagulii crescui pe mediu Murashige Skoog (1962) cu amestec de 1,5 mg/l KIN i 1,5 mg/l ANA (3V4 ), la 60 de zile de la inocularea acestora in vitro, unde: cc- celule caliptrale; m- meristem; z- zona de cretere prin ntindere a rdciniei (Fig. 1 - ob. 10x; Fig. 2 - ob. 10x; Fig. 3- ob. 20x; Fig. 4- ob. 20x).

24

2.3.6.2. Aspecte de microscopie optic i de de ultrastructur surprinse la nivelul frunzelor plantelor de Sedum telephium ssp maximum recoltate din natur sau a vitroplantulelor 2.3.6.2.1. Aspecte de microscopie optic i de ultrastructur surprinse n celulele frunzelor plantelor de Sedum telephium ssp. maximum recoltate din natur Examinrile de microscopie electronic, cu transmisie, ne-au permis identificarea n sucul vacuolar al unor celule ale mezofilului foliar al frunzelor tinere de Sedum telephium ssp. maximum, recoltate de la plante crescute n mediu natural, a unor formaiuni variate, unele dintre acestea ne mai fiind menionate n literatura de specialitate.

Plana 16, Fig. 1 - 4: Celule ale mezofilului foliar de Sedum telephium ssp. maximum recoltate din mediul natural, vzute la microscopul electronic, cu citoplasm pelicular, numeroase cloroplaste, nucleu i nucleol, iar n sucul vacuolar se disting cristale de oxalate de Ca i corpusculi osmiofili (unde: cit. -citoplsm; pc - perete celular; sp - spaiu intercelular; V - vacuol; cos - corpusculi osmiofili; cr. Ox - cristale de oxalat de Ca; M mitocondrie; N.- nucleu; n- nucleol; cl- cloroplast).

25

2.3.6.2.2. Examinarea la microscopul optic i la cel electronic, cu transmisie, a preparatelor obinute din frunzuliele vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum cultivate in vitro pe mediu de baz, Murashige -Skoog (1962), agarizat, cu adaos de benziladenin (BA) i acid indolilbutiric (AIB) cte 1,5 mg/l din fiecare Examinarea macroscopic a vitrofrunzulielor, deseori cu ajutorul lupei, ne-a permis vizualizarea pe ambele suprafee ale limburilor foliare a unor minuscule puncte de culoare roie, deschis, risipite ici i colo pe ambele epiderme, situaie pe care nu am ntlnit-o la frunzele de Sedum telephium ssp. maximum ale plantelor crescute n condiii naturale. Dar, n acest caz, la examinrile de microscopie optic i electronic, cu transmisie, n vacuolele unora dintre celulele (mai ales n cele ale epidermale), mai mari ca volum, s-a evideniat colorarea n rou a sucului vacuolar.

Plana 23, Fig. 1 - 6: Aspecte de microscopie optic ale suprafeei epidermei frunzelor de Sedum telephium ssp. maximum care a fost prelevat de la vitroplantule (Fig. 1 4, imagini ale epidermei superioare i Fig. 5 - 6 imagini ale epidermei inferioare, ambele cu stomate, celule anexe i cu celule bogate n antociani, observate la preparate proaspete (unde: ca celule cu antociani; cax celule anexe ale stomatelor; st stomate; Va vacuol cu antociani ) (Fig. 1- ob. 20x; Fig. 2 ob. 10x; Fig. 3- ob. 20x; Fig. 4 - ob. 40x; Fig. 5 ob. 10x; Fig. 6 - 20x.

26

Plana 29, Fig. 1 - 6: Seciuni transversale practicate prin limburi foliare ale unor vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp. maximum, prelevate de la plantule vitrocultivate pe mediu de baz agarizat Murashige - Skoog (1962), modificat de noi, i cu adaos de BA i AIB, cte 1,5 mg/l din fiecare(unde: cel. cu dep. os. depozite corpusculoase osmiofile; dep. os - celule cu depozite osmiofileelectrodense pe tonoplast; c.c.st.- camer substomatic; ep. sup. epiderma superioar; N nucleu; V vacuol; n nucleol; cit citoplasm; s. cut.- strat cuticular; pc perete celular; L lacun, sp- spaiu intercelular).

27

2.3.7. Aclimatizarea exvitroplantulelor de Sedum telephium ssp.maximum provenite dintr-o vitrocultur realizat de pe mediu de baz Murashige-Skoog (1962)mbogit cu diferii regulatori de cretere Plantulele care s-au pretat cel mai bine procesului de aclimatizare, au fost cele provenite de pe mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA, ntruct pe lng faptul c acestea n cea de a 30- zecea zi de la transferarea lor ex vitro i plantarea acestora n sol- au avut rezultate maxime aproape la toi perametrii de cretere, dar n special n ceea ce privete numrul de rdcinie regenerate la baza culturilor realizate n ghivece.

A
8 cm

5 cm

Fig. 63. Exvitroplantule de Sedum telephium ssp. maximum decopertate, fotografiate n cea de a-30zecea zi de aclimatizare. 2.3.8. Dozarea unor compui anorganici i organici n fitoinoculii de Sedum telephium ssp. maximum Materialul vegetal a fost reprezentat de frunze de Sedum telephium ssp. maximum din cadrul natural, dar i de vitrofrunzulie prelevate de la vitroplantule cu vrsta de 60 de zile, provenite din propaguli de Sedum telephium ssp. maximum, inoculai i crescui pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962) suplimentat cu variai regulatori de cretere, propaguli care au fost detaai din coloniile de frunzulie i de tulpinie (tufe) regenerate din embrionii zigotici ai seminelor germinate aseptic pe pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962) cu adaos de variai regulatori de cretere. Sub aspect chimic i biochimic, la materialul vegetal constnd din frunze, respectiv vitrofrunzulie, principalii parametrii urmrii nu s-au modificat semnificativ fa de variantele martor, ntruct cantitatea de proteine totale i de glucide totale, ct i de polifenoli totali i de acid ascorbic a fost semnificativ mai ridicat n determinrile fcute la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum , comparativ cu probele foliare recoltate de la plantele din natur.

28

Totui, n cazul antocianilor, la eantioanele ce au provenit de pe mediul de cultur MB MS cu adaos de KIN i ANA , cte 1,5 mg/l din fiecare, coninutul de antocian a fost sporit cu 60% comparativ cu valorile obinute la varianta martor din natur. De semnalat este faptul c, la probele raportate la martorul din vitrocultur coninutul de antocian a fost sporit cu 20 25 % la variantele cu amestec de auxin i citochinin, fa de datele nregistrate atunci cnd regulatorii de cretere au fost administrai separat, cele mai nsemnate sporiri ale coninutului de antociani de 25 % - marcndu-se la varianta de mediu de cultur MB MS cu adaos de KIN i ANA , cte 1,5 mg/l.

Fig. 69 A B - Cantitatea de polifenoli totali i antociani prezent n extractul de vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp.maximum, unde : A- valorile probelor (3V0-3V4) sunt reprezentate procentual fa de varianta martor VMN (extract frunzulie din cadrul natural) considerat ca lot de referin (100%) i B- valorile probelor (3V1-3V4) sunt reprezentate procentual fa de varianta martor 3 V0 (extract vitrofrunzulie) considerat ca lot de referin (100%) unde: VMN - frunzulie de Sedum telephium ssp. maximum colectate din cadrul natural; 3V0vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MB-MS(1962) fr adaos de regulatori de cretere; 3V1- vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MB-MS(1962) cu adaos de BA, 1,5 mg/l; 3V2- vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MB- MS(1962) cu adaos de AIB, 1,5 mg/l; 3V3- vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MBMS(1962) cu adaos BA i de AIB 1,5 mg/l; 3V4- vitrofrunzulie de Sedum telephium ssp. maximum crescute pe mediu MB-MS(1962) cu adaos de KIN i ANA , 1,5 mg/l.

29

2.4. CONCLUZII GENERALE

1. Rezultatele obinute n urma iniierii vitroculturii de Sedum telephium ssp.maximum din apexuri caulinare, prelevate de la tulpini tinere crescute n cadrul natural au scos n eviden faptul c, dup 30 de zile de la inocularea explantelor pe mediu MB MS, prezena n substratul de cultur a unui amestec realizat ntre BA i AIB, n concentraie de 1 mg/litru, a condus la obinerea celor mai bune rezultate n ceea ce privete rizogeneza i caulogeneza, n comparaie cu celelalte variante analizate, respectiv cte o rdcini/fitoinocul marcnd un spor de 100% n ceea ce privete talia medie a rdciniei, atingnd o valoare maxim de 2,23 cm, dar i un spor al numrului de ramificaii la aceast variant, de 5,3 ramificaii/inocul cu lungimea medie a acestora care a atins o valoare maxim de 1,2 cm. 2. n cadrul unui al 2- lea experiment, la 30 de zile dup inocularea seminelor de Sedum telephium ssp. maximum L., pe un acelai tip de mediu de cultur, dup germinare, embrionii au dat natere unor plantule, care pe toate variantele de mediu MB-MS (1962) au crescut sub form de tuf, tulpiniele regenerate la nivelul acestora atingnd o talie de circa 1 -2 cm . Cele mai bogate vitrotufe i cele mai numeroase rdcinie s-au format pe mediu care n substratul de cultur avea amestec de KIN i ANA, n concentraii de 1,5 mg/l. Aceste vitroculturi au servit - prin dezmembrarea lor - la dimensionarea de propaguli ( trifoliai) sau de minibutai caulinari sau foliari. 3. La 30 de zile dup subcultivarea propagulilor de Sedum telephium ssp. maximum L. separai din tufele de vitroplantule au frunzulie generate la nivelul fitoinoculilor utilizai n diferitele subculturi operate, in vitro pe mediu de cultur aseptic, au dat natere unor plantule care pe toate variantele de mediu MB-MS (1962) au atins talia medie de 1-3 cm, dar cele mai bune rezultate, n ceea ce privete nlime medie a ntregii plantule au fost obinute tot pe mediul de cultur suplimentat cu amestec de KIN cu ANA, care a atins valoarea maxim de 2,9 cm cu talia maxim a plantulei de marcnd un spor de 137,59% valori depind lotul martor cu talia maxim a plantulei de 1,33 cm; numrul de ramificaii ale tulpiniei a fost 5,33 ramificaii/inocul, marcnd un spor de 237,59% , valori care au depit cele ale lotului martor considerat 100 %. 4. La vizualizarea cu ochiul liber a limburilor foliare i a apexurilor radiculare, ale fitoinoculilor crescui pe mediu MB-MS cu BA plus AIB, ca regulatori de cretere, precum i a celor vitrocultivai pe mediu MB-MS cu aport de KIN i ANA s-a observat un proces interesant, proces care a constat ntr-o colorare n rou a unora dintre celulele epidermale ale frunzulielor i tulpinielor dar i a apexurilor rdcinielor, fenomene care nu au mai fost constatate la alte tipuri de fitoinoculi i nici ntr-un caz la vrfurile radcinielor plantelor crescute n condiii naturale sau n germinatoare. Aceast colorare s-ar putea datora acumulrii n vacuolele unor astfel de celule a antocianilor, nivelul acestora fiind crescut la extractele preparate din frunzulie recoltate din vitrocultur, n special a celor provenite de pe mediu MB MS cu aport de KIN plus ANA cte 1,5 mg l, fiecare. Dup 60 de zile de vitrocultur, la acelai tip de fitoinoculi crescui pe mediu MB-MS cu BA plus AIB, ca regulatori de cretere, precum i a celor vitrocultivai pe mediu MB -MS cu aport de KIN i ANA, prezena antocianilor n apexurile radiculare este o noutate pentru literatura de specialitate. Noi am evideniat prezena acestor antociani numai la nivelul fitoinoculilor de Sedum telephium ssp. maximum. 5. Minibutaii caulinari sau foliari, cu sau fr peiol, de Sedum telephium ssp. maximum, utilizai ca inoculi n vitrocultur, dimensionai din vitroplantule regenerate din embrionii zigotici ai seminelor germinate pe mediul de cultur Murashige Skoog (1962), suplimentat cu variai regulatori de cretere, la 60 de zile de la inocularea lor pe mediul de cultur MB-MS, cu variate combinaii de regulatori de cretere, tot pe mediile cu amestec de auxin i citochinin, au dat natere la o rizogenez i filogenez echilibrat n acest caz varianta de mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA fiind cea mai bun combinaie ca substrat de vitrocultur, ntruct numrul de rdcinie/ fitoinocul a fost de dou exemplare, iar numrul 30

mediu de frunzulie a fost de 4,33/ fitoinocul. La varianta de mediu MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA, utiliznd minibutai de tip foliar, lipsii de peiol, din limb s-a regenerat calus, la 30 de zile, dimensiunea medie a celui mai mare calus a nregistrat cele mai ridicate valori, ale taliei acestuia de 1,65 cm. n consecin, micropropagarea la Sedum telephium ssp.maximum L. poate fi realizat fie prin intermediul propagulilor, fie a minibutailor caulinari, cu cte 3 noduri , vitrocultivai pe mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA, din acetia n decurs de 30 de zile regenerndu-se plantule de 3- 4 cm ce au fost nrdcinate. Explantele de tip limb foliar genereaz mai ales calus. 6. Plantulele care s-au pretat cel mai bine procesului de aclimatizare, au fost cele provenite de pe mediu de baz MB MS suplimentat cu 1,5 mg/l KIN n amestec cu 1,5 mg/l ANA, ntruct pe lng faptul c acestea n cea de a 30- zecea zi de la transferarea lor ex vitro i plantarea acestora n sol- au avut rezultate maxime aproape la toi perametrii de cretere, dar n special n ceea ce privete numrul de rdcinie regenerate la baza culturilor realizate n ghivece. 7. Sub aspect chimic i biochimic, la materialul vegetal constnd din frunze, respectiv vitrofrunzulie, principalii parametrii urmrii nu s-au modificat semnificativ fa de variantele martor, ntruct cantitatea de proteine totale i de glucide totale, ct i de polifenoli totali i de acid ascorbic a fost semnificativ mai ridicat n determinrile fcute la nivelul vitroplantulelor de Sedum telephium ssp. maximum ., comparativ cu probele foliare recoltate de la plantele din natur. Totui, n cazul antocianilor, la eantioanele ce au provenit de pe mediul de cultur MB MS cu adaos de KIN i ANA , cte 1,5 mg/l din fiecare, coninutul de antocian a fost sporit cu 60% comparativ cu valorile obinute la varianta martor din natur. De semnalat este faptul c, la probele raportate la martorul din vitrocultur coninutul de antocian a fost sporit cu 20 25 % la variantele cu amestec de auxin i citochinin, fa de datele nregistrate atunci cnd regulatorii de cretere au fost administrai separat, cele mai nsemnate sporiri ale coninutului de antociani de 25 % - marcnduse la varianta de mediu de cultur MB MS cu adaos de KIN i ANA , cte 1,5 mg/l. 8. Un experiment interesant, care face obiectul a 2 dosare depuse ca soluii brevetabile de noi la OSIM Bucureti (aflate n curs de examinare, respectiv A/00925 i A/00092) se refer la obinerea de vitroculturi de Sedum telephium ssp. maximum , folosind propaguli vitrocultivai pe medii solidificate cu granule sau sferule de poliacrilamid incolor sau colorat (probabil cu colorani vitali de tipul violetului de genian, a portocaliului de acridin, a albastrului de metile n, etc., folosii n diluii mari) n loc de agar-agar, precum i pe mediu cu poliacrilamid n amestec cu tre. Totodat la astfel de recipiente cu fitoinoculi prin metoda conceput de noi, valoarea estetic a flacoanelor a reuit s creasc, ceea ce credem c permite o comercializare cu succes a unor astfel de vitroculturi. n plus, mediile gelificate cu poliacrilamid sunt mult mai puin costisitoare dect cele gelificate cu agar- agar, dac comparm costul agar-agarului, de tip Difco Bacto Agar, utilizat de regul n solidificarea mediilor de cultur, al crui pre per un litru de mediu ar fi, n prezent, de 28 Roni cu preul sferulelor de poliacrilamid, utilizate n experimentele noastre, care n momentul de fa ar fi doar 1 Ron. 9. Investigaiile citologice efectuate la microscopul optic la nivelul apexurilor radiculare ale plantulelor crescute pe medii MB-MS cu adaos de diferii regulatori de cretere, cte 1,5 mg/l din fiecare, au scos n eviden faptul c o colorare n rou zmeriu a vrfurilor radiculare sau a unora dintre celulele epidermale la plantele de Sedum telephium ssp. maximum L. este prezent la exemplarele aflate n regim de vitrocultur i mai ales la variantele n care n substrat a fost prezent o balan realizat ntre o citochinin i auxin, n special, a amestecului de KIN i ANA, n concentraie de 1,5 mg/ l . n rdcinie, colorarea sucului vacuolar a fost localizat att n celulele meristematice, ct i n cele ale caliptrei fenomen care nu a mai fost semnalat n literatura de specialitate . Tot un fenomen de difereniere a culorii celulelor s -a observat i la nivelul sucului vacuolar al unor celule aflate n profunzimea mezofilului foliar sau n endoderma rdcinielor, aspecte identificate la nivel de microscopie electronic.

31

Avnd n vedere faptul c, literatura de specialitate cu privire la morfologia i anatomia speciei Sedum telephium ssp. maximum L. i n general al plantelor din familia Crassulaceae este foarte srac, aa cum rezult din lista bibliografic, considerm c rezultatele obinute sunt deosebit de relevante i vor contribui la deschiderea posibilitatii iniierii de noi investigaii.

REALIZRI ORIGINALE I RECOMANDRI DE PERSPECTIV

Experimentele fcute n cadrul prezentei teze de doctorat au permis realizarea de vitroculturi de Sedum telephium ssp.maximum L. i stabilirea unor proceduri de micropropagare a acestei speciipornind fie de la explante caulinare, apicale, prelevate de la plante mame recoltate din natur, fie utiliznd explante similare detaate de la vitroplantule obinute prin germinarea n condiii aseptice a embrionilor seminelor, situaie n care randamentul n iniierea vitroculturilor a fost cel mai ridicat, infeciile la nivelul fitoinoculilor fiind minime, iar vitalitatea apexurilor meristematice fiind maxim. Mediul de cultur utilizat a fost Murashige - Skoog (1962) (cu mici modificri operate la nivelul vitaminelor), la acesta au fost adugai regulatori de cretere (BA, AIB, KIN i ANA), administrai separat sau n amestec n concentraie de 1,5 mg/l, fiecare. Odat ce vitrocultura de Sedum telephium ssp. maximum L. a fost realizat, multiplicarea acestei specii a fost posibil fie prin utilizarea de propaguli, fie de minibutai, caulinari sau foliari. n aceste cazuri mediul de cultur utilizat a fost tot baz Murashige - Skoog (1962), cu adaos de BA plus AIB, ori de KIN i ANA, administrai n amestec, n concentraie de 1,5 mg/l, fiecare. Aclimatizarea exvitroplantulelor - ce prezentau rizogenez- s-a realizat n sol, amplasat n ghivece, recipiente care au fost meninute n camera de cretere timp de 30 de zile. Procentul de supravieuire o exvitroplantulelor la regimul de via exvitro a fost de 100%. Deci, procedurile descrise i practicate de ctre noi s-au dovedit posibil de utilizat n producerea de material de plantat de Sedum telephium ssp.maximum L. sau eventual de biomas, care ar putea prezenta o mare valoare n procedurile fitofarmaceutice. Din punct de vedere tiinific, cercetrile noastre au permis evidenierea unui fenomen foarte interesant, care nu a mai fost (dup cunotinele noastre) semnalat n literatura de specialitate, acela al identificrii n vrful vitrordcinielor regenerate la nivelul variatelor tipuri de fitoinoculi (inclusiv cele formate din calus) a unei coloraii n rou-viiniu a meristemului acestora, precum i a celulelor caliptrale, mai ales n prezena n substratul de cultur Murashige - Skoog (1962) utilizat de ctre noi (cu anumite modificri efectuate de noi n reeta de baz), a unui amestec de ANA cu KIN, n concentraie de 1,5 mg/l. Pe de alt parte, i la nivelul epidermei frunzulielor i a tulpinielor s-a evideniat prezena aleatorie tot a unor celule colorate n rou-viiniu (sau zmeuriu), coloraie pe care noi o considerm c se datoreaz antocianilor. Cum se explic prezena n unele celule a acestor colorani este greu de explicat, la actualul nivel al cunotinelor. Cercetrile de microscopie optic, dar mai ales cele de microscopie electronic, cu transmisie, au permis evidenierea n sucul lor vacuolar a unor bogate acumulri de corpusculi electrodeni. Astfel de corpusculi au mai fost depistai i n sucul vacuolar a unor celule situate n profunzimea mezofilului foliar al vitrofrunzulielor i n endoderma rdcinielor. Aceste aspecte nu au putut fi identificate la nivelul frunzelor sau a rdcinilor plantelor din natur, ceea ce ne-a determinat s interpretm acest fenomen ca o reacie a lor la condiiile stresate suportate de vitroplantulele de Sedum telephium ssp.maximum L, aflate n regim aseptic, de vitrocultur, cu att mai mult susinem aceast ipotez cu ct prezena amestecului de KIN i ANA n substrat a intensificat coloraia sucului vacuolar al unor astfel de celule, n raport cu aceea observat n prezena n mediu a amestecului constnd n BA i AIB. De altfel, determinarea coninutului n antociani, n frunzuliele vitroculturilor de Sedum telephium ssp.maximum L. a fost 32

crescut cu 60 % ( pe varianta de mediu 3V4 MB MS cu adaos de KIN i ANA , cte 1,5 mg/l din fiecare), la nivelul materialului vegetal provenit din vitro, fa de parametrul respectiv identificat n frunzele provenite din natur. Aceste cercetri deschid noi direcii de cercetare, foarte interesante, cu att mai mult cu ct literatura de specialitate de ultim ora puncteaz faptul c, nc nu se cunoate cu exactitate rolul antocianilor n viaa plantelor, cu att mai puin n regim de vitrocultur. Subliniem, nu n ultimul rnd, c cercetrile efectuate n cadrul prezentei teze de doctorat ne-au permis elaborarea de noi proceduri de solidificare a mediului de cultur, procedee aflate n curs de examinare la OSIM Bucureti, (A/00925 i A/00092), precum i perfecionarea metodelor de fotografiere macroscopic a fitoinoculilor, fr umbre, metode care s-au constituit n alt dosar de invenie aflat n examinare tot la OSIM Bucureti (A/00148).

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Ahloowalia, B.S., 2002, Integration of technology from lab to land. In: Proceedings of a Technical Meeting organized by the Joint FAO/IAEA Division of Nuclear Techniques in Food and Agriculture and held in Vienna, p.87-89. 2. Ardelean M., Cachi-Cosma, D, Crciun, C., 2011, Vacuole formations identified in the cells of the foliar mesophyll of the young leaves of Sedum telephium ssp. maximum harvested from natural environment, Studia Universitatis Vasile Goldi, Seria tiinele Vieii, Vol. 21, issue 3, Jul.-Sep. p. 563-571. 3. Boxus, P., Jemmali, A., Pieron, S., 1995, Multiplication vegetative la micropropagation. In : Biotehnologies vegetales (Ed. Demarly) Y., Picard, E., Boxus, P.) CNED, Inst. De Rennes, Frana, p. 5-116. 4. Broadley, M.R, White, P.J., Hammond, J.P., Zelko, I., Lux, A., 2007, Zinc in plants, New Phytol. 2007;173 (4):677-702. 5. Cachi, C.D., Ardelean, A., 2009, Tratat de biotehnologie vegetal, vol. II, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, p.32-116. 6. Cachi, C.D., Crciun, C., 1981, Of procaine action on the vegetal cell, In: Mem. Sect. tiint., Ser. IV, Tom. IV, nr. 2, 169-177, Ed. Acad. RSR. 7. Cachi, C.D., Crciun, C., 1979, The evolution of vegetal tissue cultures under the action of procaine, Int. Symp. on Plant Tissue Culture, Bratislava, p. 61, 8. X. 8. Halmagyi, A., Deliu, C., 2008, Embriogeneza somatic, Ed. Todesco, Cluj-Napoca, p. 61-67. 9. Ishimaru Y, Suzuki M, Tsukamoto T, Suzuki K, Nakazono M, Kobayashi T, Wada Y, Watanabe S, Matsuhashi S, Takahashi M, Nakanishi H, Mori S, , 2006, Rice plants take up iron as an Fe3+-phytosiderophore and as Fe2+, Plant J. 2006 Feb;45(3):335-46. 10. Kim, H.T., 1996, Alkaloids of some Asian Sedum species. In: Phytochemistry Oxford, p. 1319-1324. 11. Murashige, T., Skoog, F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. In: Physiol. Plant. 15:473-497. 12. Toma, C., Rugin, R., 1998, Anatomia plantelor medicinale-atlas, Ed. Academiei Romne, Bucureti, p.67-317.

WEBOGRAFIE
1. http://en.wikipedia.org/wiki/Sedum 2. http://gardening.about.com/od/plantprofile1/p/Sedum.htm

33

LISTA CU LUCRRILE TIINIFICE PUBLICATE DIN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT 1. Ardelean, M., Stnescu I., Cachi C.D., 2009, Sedum telephium L. ssp. Maximum (L.) Krock. histo-anatomical aspect son the vegetative organs. In: Anal. St. ale Univ., Alex. I. Cuza Iai. t LV, fasc. 2., s II a. Biologie vegetal, p. 75-80. 2. Ardelean, M., Stnescu, I., Cachi, C.D., 2009, Comparative histo-anatomical analysis of the vegetative organs of Sedum telephium L. ssp maximum (L.) Krock. in vitro and from nature. In: Journal of Plant Developement, 16, p. 3-8. 3. Ardelean M., Cachi-Cosma, D, Crciun, C., 2011, Vacuole formations identified in the cells of the foliar mesophyll of the young leaves of Sedum telephium ssp. maximum harvested from natural environment. In: Studia Universitatis Vasile Goldi, Seria tiinele Vieii, Vol. 21, issue 3, Jul.-Sep. p. 563-571. LUCRARE TIINIFIC DIN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT, AFLAT SUB TIPAR 1. Ardelean M., Cachi-Cosma, D, Crciun, C., 2012, Morphogenesis in the culinary, apical and foliar minicuttings, of Sedum telephium ssp. maximum in vitro on Murashige Skoog (1962) medium culture. In: Studia Universitatis Vasile Goldi, Seria tiinele Vieii, Vol. 22, issue 3, May, p.907-715. DOSARE CU PROPUNERI DE LUCRRI DEPUSE LA OSIM BUCURETI PENTRU BREVETARE 1. Dosar OSIM, Bucureti A/00925, 20.09.2011: O nou modalitate de solidificare a mediilor de cultur aseptic utilizate n vitrocultur, prin nlocuirea agar-agarului cu gel de poliacrilamid n amestec cu tre. Autori: 1Cachi D., 2Ardelean M. 2. Dosar OSIM, Bucureti A/00092, 13.02.2012: Procedeu de gelificare i de colorare a mediiilor de cultur aseptice destinate creterii in vitro a fitoinoculilor, utiliznd granule sau sfere hidratate de poliacrilamid. Autori: 1Cachi D., 2Ardelean M., 3 Turcu V. 3. Dosar OSIM, Bucureti A/00148, 7.03.2012: Tehnici fotografice concepute pentru mbuntirea calitii imaginilor macroscopice. Autori: 1Cachi D., 2Ardelean M., 3 Turcu V.

34

35