PRAKTIKUM PCR, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS-PAGE (SDS PolyAcrilamide Gel Elektroforesis)

Tujuan: i) Menerti dan memahami teknik PCR ii) Mengerti prinsip dasar elektroforesis iii) Melatih teknik elektroforesis agarose dengan sampel-sampel DNA yang diperoleh dari buah dan dari aringan manusia! i") Menggunakan teknik #D#-PA$% untuk memisahkan protein-protein darah! *Kegiatan praktikum ini diadaptasi dari bahan: &agian &iokimia '()*, +,,,! Pemisahan protein dengan elektroforesis gel poliakrilamid-#D#! Biokimia Eksperimen aboratorium -akarta. /idya Medika, pp01-22 Morda34, -!C! 5 %llington R!/! 1662! Polya3rylamide gel ele3trophoresis 7PA$%) of blood proteins! "ested Studies #or aboratory "eaching 18.$%&'' Pendahuluan: Protein-protein atau asam nukleat dapat dipisahkan satu dari yang lain atas dasar pebedaan muatan listrik! Pada hari ini, Anda akan diperlihatkan hasil elektroforesis DNA dengan teknik elektroforesis agarose dan memisahkan protein-protein yang sudah diisolasi dari darah dengan #D#-PA$%! %lektroforesis agarose dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat 7atau fragmennya) yang bermuatan negatif sesuai dengan arus listrik! Pada sistem elektroforesis tersebut, agarose merupakan bahan media yang berfungsi sebagai alas9 medium pemisah yang diletakkan antara anode dan 3atode alat elektroforesis! Medium pemisah tidak bergerak 7fasa stationer)! Molekul yang ingin dipisahkan diletakkan pada medium pemisah dan diba:a sesuai dengan muatan listrik oleh karena medium pemisah direndam dengan larutan ionik! Molekul yang besar bergerak lebih lambat dari pada molekul lebih ke3il! $el agarose disiapkan dengan ethidium bromide yang mengikat dengan DNA 7intercalater) dan diperlihatkan :arna oren kalau disinarkan dengan 3ahaya );! Protein-protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul! #D#-PA$% 7sodium dodecyl sulfate ( polyacrilamide gel electrophoresis) adalah teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium! #empel protein denaturasi 7dipanaskan) dan di3ampur dengan #D# 7yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu bermuatan negatif dan protein yang lebih besar menpunyai muatan negatif yang lebih besar!! (ompleks protein-detergen itu akan diba:a oleh medan listrik ke arah kutub positif 7anoda)! $el akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas gerakan sampel protein! (onsentrasi akrilamide menentukan ukuran pori-pori gel dan ukuran pori-pori gel menentukan arak yang ditempuh oleh kompleks protein-#D#! -adi berapa faktor harus ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan protein-protein melalui teknik #D#-PA$% 7antara lain. kadar #D#, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gelnya, kemurnian sampel protein dan umlah sampel yang diletakkan pada gel< "oltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan selama medan listrik dihidupkan)! Ala dan !ahan "an# d$!u uh%an &ada &e'()!aan PCR 1! 'or:ard Primer . konsentrasi +, pmol +! Re"erse Primer . konsentrasi +, pmol 0! $1=0>; . konsentrasi akhir adalah ,,1 mM untuk setiap nukleotida 7A ?,$,C) 2! 1, @ &uffer 71, @ (onsentrasi) dengan konsentrasi MgCl+ 1,8 mM 8! A4uabidest steril 1! ?a4 Polimerase . ,,1+8 A =! #ample DNA B! Mineral oil 7untuk menghindari penguapan 6! ?herma Cy3ler PCR 1,! ); reader

PCR, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS PAGE

Ca'a %e'ja PCR Disiapkan larutan untuk beberapa orang sekaligus atau disebut dengan larutan M$* S)lu $)n 7untuk memudahkan pekr aan dan memperoleh ketepatan "olume) - Perhatikan penyimpanan larutan-larutan diatas, ada yang harus pada temperature -+,oC 0)APC) $1=0>; DE**C) =D? $DF %AGD #C)GE GD)E/DF H1I Rleh karena itu pada saat beker a harus diletakan yang berisi es - #elalu gunakan tabung dan tips yang telah disterilisasi C)n )h +en"$a&%an M$* S)lu $)n : 1! +! 0! 2! 8! 1! 'or:ard Primer Re"erse Primer $1=0>; 1, @ &uffer ?a4 Polimerase A4uabidest 7+0-1,0=8) -umlah , -a+&le ,,+8 A ,,+8 A ,,8, A ,,+8 A ,,1+8 A +1,1+8 A +0 A ,. -a+&le 0 A 0 A 1 A 0 A 1,8 A +86,8 A +=1 A -

#iapkan 1+ tabung PCR 7steril), dipipetkan sebanyak +0 A Mi@ #olution masukan ke masing-masing tabung PCR ?ambahkan + A larutan DNA sampel, "orte@ -angan lupa mengikutsetakan 3ontrol negati"e dalam setiap men alankan PCR 73ontrol negati"e J tabung PCR hanya berisikan Mi@ #olution, tanpa penambahan larutan DNA sampel) ?ambakan lagi sebanyak 8, A Mineral Gil ?abung ditutup rapat dan susun di dalam rak9blok alat ?hermal Cy3ler Atur program untuk men alankan PCR

Ca'a %e'ja ele% ')/)'-$- a#a')-e Ala dan !ahan "an# d$#una%an = sampel protein darah dari minggu yg lalu sampel DNA sel epitelial Protein standard #D#-PA$% per:arna DNA 73rystal "iolet dalam +,D gliserol) sarung tangan 1 N CCl tempat buang 3airan biologis pipet otomatik :ater bath biru bromfenol mikrosentifus pipet tetes akuades alat elektroforesis agarose tabung mikrosentrifus 71,8ml) alat elektroforesis pipet Mohr po:er supply %rlenmeyer flask beaker pC meter Camilton syringe etanol absolute, dingin "orteks gel poliakrilamide K #D# 1,D -merkaptoetanol isobutanol kertas grafik semi-log ?ris D?? #D# agar +D Na+CPG 2 gliserol %D?A asam borik larutan pe:arna larutan pen3u3i spidol penggaris 7mm) tisu agarose :ater bath

PCR, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS PAGE

Larutan-larutan yang perlu disiapkan: 1! ,0 T1E - setiap kelompok siapkan 1,,,mA 7resep diba:ah ini utk 1,,,ml) 1,!B g ?ris, 8!8 g asam borik a3id, ,!=2 g %D?A dimasukkan ke dalam beaker 1,,, ml! ?ambahkan 6,,mA akuades dan aduk dengan magneti3 stirrer sampai larut! ?ambahkan akuades sampai "olume larutan sama dengan 1 A! #impan di dalam botol bersih pada temperatur ruangan 7bisa disimpan selama beberapa bulan)! +! 2345 A#a')-e - setiap kelompok siapkan agarose se3ukupnya untuk anggotanya 7perlu 2,ml93asting tray) K resep di ba:ah ini utk 1+8ml! 667a $-ha $ den#an e h$d$u+ !')+$de 8 &a%a$lah -a'un# an#an666 1 g agarose dimasukkan ke dalam beaker9flask +8, ml yang bersih! ?ambahkan 1+8 ml larutan 1E ?&% buffer solution!! ?utup flask9beaker dengan foil aluminium untuk mengurangi penguapan dan sisakan 3elah sedikit! Aduk se3ara gerakan flask! Dipanaskan sampai mendidih dan larutan ernih! Dinginkan ;DP#DA aL $DF /DP%D(NDF 9 GD)E/DF ethidium bromide93asting tray! 0! La'u an Da&a' Sa+&el 78,mM ?ris-CCl pC 1,B< 1,D7"9") gliserol< 1D 7b9") #D#< ,,,1D 7b9") biru bromfenol)! 2! La'u an Da&a' Ele% ')da 7+8,mM ?ris-CCl pC 1,B< 1,BM glisin< 1D 7b9") #D#)! 8! La'u an Pe9a'na 7,,18D Coomassie &rilliant &lue R-+8,< +8,mA metanol< 8,mA asam asetat< akuades sampai 8,,mA) 1! La'u an Pen(u($ 78,mA metanol< =8mA asam asetat< akuades sampai 1,,,mA) 1a#$an A 8 ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE 1! #etiap mhs menyiapkan 3asting tray masing-masing 0D;DF- ;D/E McombN ;A;A) #D$D #C)/CF-D(DF MtrayN #GD/ 'C/DNDF $DF ;D/E ;A;A) GD-A #D$D EMEF-FOD +! ?uangkan P 2,ml ,,BD agarose ke 3asting tray Anda! Ca'a %e'ja ala ele% ')/)'e-$-: 1! &ila gel sudah beku, lepaskan 3omb se3ara hati-hati! +! Aetakkan gel di dalam elektroforesis tank yang sudah berisi larutan 1E ?&%! Perhatikan 3ara meletakkannya! %lektroforesis tank dapat disii dengan 0 3asting gel! 0! ?ambahkan larutan 1E ?&% se3ukupnya sampai gel-gel terbenam seluruhnya! 2! )ntuk me:arnai DNA buah, tambahkan G #C)QD)FD H1I ')O;/DG RARGC/ $DGDP D gliserol) pada DNA yang disimpan dari minggu yang lalu di tabung mikrosentrifus 8! SEFDNDF PAN)R#A#C/ EF/EN PCF-(A;D# 9 sampel DNA buah dan se3ara hati-hati PD;ENNDF NC $DGDP M)ell*9sumur tertentu! Pada saat memasukkannya, pastikan u ung dari tip sudah sedikit masuk pada lubang :ell gel elektroforesis! Catat posisi dan urutan sampel grup Anda pada halaman hasil praktikum ini! 1! )ntuk me:arnai DNA manusia, 3DP#E) G H1I dari sel epitelial $CF-DF G #C)QD)FD H1I $A D/D; #D)D*AGP $DF GDF-;EF- PD;ENDF ;CPEDFOD G NC ;EPE) -CG (emudian, dengan parafilm baru lagi, 3DP#E) G H1I dari sel darah $CF-DF G #C)QD)FD H1I $A D/D; #D)D*AGP $DF GDF-;EF- PD;ENDF ;CPEDFOD G NC ;EPE) -CG Catat posisi dan urutan sampel grup Anda pada halaman hasil praktikum ini! =! Nyalakan mesin elektroforesis selama 0, menit dengan tegangan 6,;! #ampel-sampelnya akan mulai bergerak ke katode, 7DNA bermuatan negatif) B! Matikan mesin elektroforesis se3ara sempurna! 6! Dengan sangat hati-hati keluarkan gel dan letakan pada tray yang disediakan! $ambarkan pada halaman hasil praktikum ini hasil yang diperoleh! Pindahkan 1,! NC DGD/ MB6 )CD$C)N ;E#DOD (D;AGFOD GC%A( MCGD; GD-A )R/R (D;AGFOD

PCR, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS PAGE

SDS PAGE Persiapan Gel 1! &ersihkan plat ka3a dengan akuades dan etanol 7=,D) +! #usun lempeng ka3a serta spacer! Celah antara lempeng dengan spacer ditutup dengan agar +D se3ukupnya! 0! )ntuk menyiapkan gel poliakrilimide-#D# 1,D, ikutilah tabel yang di ba:ah! #iapkan gel pemisah dulu! SSSSPakai sarung tangan dan hati-hati dengan bahan yang berisi akrilamideSSSS SSSS-anganlah menambah ammonium persulfat serta ?%M%D sebelum Anda siap menuangkan 3ampuran akrilamide ke dalam plat ka3a yang sudah disiapkan oleh karena bahan tersebut berfungsi sebagaik katalyst polimerisasi akrilamideSSSS !ahan akrilamide 0,D9bisakrilamide ,,BD 1,8M ?ris-CCl pCJB,1 1,8M ?ris-CCl pCJ1,B akuades #D# 1,D amonium persulfat 1,D ?%M%D #el &e+$-ah perlu ~20ml/gel ( a!un# 'ea%-$ ,) 1, mA 1,B mA --1,,+mA 0,,9 +,,9 +,9 #el &enu+&u% perlu ~5ml/gel ( a!un# 'ea%-$ .) 0,,8 mA --+,,mA 2,18mA 9 9 9

2! ?uang 3ampuran gel pemisah ke dalam ruang antara lempeng ka3a, #isakan kira-kira +,8 3m dari tepi atas lempeng ka3a untuk gel penumpuk! ?eteskan isobutanol untuk menyingkirkan udara pada bagian atas gel dan agar batas antar gel dapat terbentuk dengan baik! &iarkan gel pemisah berpolimerisasi selama kurang lebih 0, menit! #iapkan gel penumpuk! 8! #etelah gel pemisah berpolimerisasi, tuangkan 3ampuran gel penumpuk di atasnya! #isipkan sisir plastik 7pembentuk sumur sampel)! &iarkan hingga gel penumpuk berpolimerisasi! 1! #etelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepas sisir dari bagian atas dan klem serta spacer bagian ba:ah! =! Aetakkan lempeng ka3a yang berisi gel se3ara "ertikal pada alat ele3troforesis dan kemudian klem! *si tempat dapar dengan dapar elektroda! #ingkir gelembung udara pada bagian ba:ah gel! Bagian B: Persiapan sampel-sampel pr tein !sampel-sampel pr tein akan disiapkan petugas la"# 1) Pakailah sarung tangan dan teknik keselamatan di laboratorium yang benar! +) ?entukan :aterbath pada temperatur 1,, C! 0) #iapkan = tabung mikro3entrifus dan tandai dengan M#GD;PDN MMN, M#N, M$#N, M$ N, P M% N, # M% N! P (eluarkan = sampel protein darah kalian 7yaitu plasma, M, #, $#, $ P, % #, % P ) dari kulkas! 2) 66Ke'ja%an lan#%ah $n$ d$ /u+eh))d66! ?ambah 28, TA buffer sampel dan 9 merkaptoetanol ke setiap tabung mikrosentrifus yang sudah ditandai! ?ransfer 8, TA sampel protein plasma, M, #, $#, $ P, % #, % P ke tabung mikrosentrifus masing-masing! 8) ?utup dan "orteks pelan-pelan supaya endapannya di3ampur rata dengan buffer! 1) Masukan semua tabung mikrosentrifus ke dalam :aterbath yang mendidih! &iarkan 8 menit! =) ?entukan bah:a tabung mikrosentrifus berkeseimbangan dan masukkan ke dalam alat mikrosentrifus! Putar selama 0 menit pada ke3epatan 12!,,, rpm!

PCR, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS PAGE

Bagian $: L ading and running t%e gel 1! Masukkan 9 sampel protein 7yaitu plasma, M, +#, $ +, $#, % +, ) ke dalam sumur masingP %# P masing dengan pipet otomatik atau dengan Camilton syringe! Pada sumur yang terakhir masukkan 9 #)R/CAF #C/DF$D! Catat nomor sumur dan isinya! +! Cubungkan alat elektroforesis dengan po)er supply! -alankan elektroforesis selama 2 am atau lebih 7"oltage yang ditentukan pada alat elektroforesis tergantung :aktu yang ada untuk men alankannya)! Bagian D: Pe&arnaan Gel 1! #etelah :atku untuk men alalan pemisahan protein selesai, matikan po)er supply dan lepaskan semua kabel dari alat elektroforesis! +! Pakai sarang tangan! &uka klem! Angkat spacer pada kedua sisi lempeng ka3a, kemudian pisahkan satu lempeng ka3a dari gel! Potong gel pada batas antara gel penumpuk dan gel pemisah! ?andai salah satu u ung gel 73atat petanda yang Anda buat supaya ingat)! 0! Dengan hati-hati angkat gel dan rendam dalam larutan pe:arna selama 0,-1, menit! 2! Pindahkan ke tempat larutan pen3u3i! $anti larutan pen3u3i beberapa kali hingga :arna latar belakang memudar dan pita-pita protein elas terlihat! 8! &andingkan mobilitas semua protein sampel dengan protein petanda untuk menentukan berat molekulnya! )ntuk menentukan berat molekul protein sampel, ukur arak pita-pita protein sampel serta pita-pita protein petanda dari batas atas gel pemisah! Masukkan hasil pada tabel di halaman hasil pratktikum ini!

Lap ran 's lasi D(A dan Elektr ) resis Agar se atau 's lasi Pr tein serta SDS-PAGE: &uat laporan praktikum, dan isi tu uannya, dengan kata-kata sendiri! &uat + grafik 7semi-log) dari data yang disediakan 7satu utk elektroforesis protein dan satu utk elektroforesis fragmen asam nukleat) ?erangkan hasil yang Anda dapat serta kesimpulannya! &erikanlah saran atas praktikum ini dan usulan supaya untuk praktikum selan utnya lebih baik lagi! *a&a%"la% pertanyaan "erikut untuk lap ran 's lasi D(A/elektr ) resis agar se: ,3 Apakah ada perbedaan antara hasil yang diperoleh dari setiap ma3am buahU Antara hasil DNA buah dan DNA manusiaU #ebutkan dua atau tiga alasan untuk perbedaan tsb! .3 &andingkan 3ara ker a untuk mengisolisasi DNA dari buah dan DNA dari sel epitelial! #ebutkan langkah-langkah yang sama dan langkah-langkah yang berbeda! :3 Apakah yang ter adi antara DNA dan etanol yang menyebabkan asam nukleat naik dari eluant buahU +ang k%usus untuk lap ran 's lasi Pr tein/ SDS-PAGE ,3 'oto hasil gel dan masukkan foto tersebut dalam laporan Anda! &erikan beberapa komentar atas apa yang terlihat pada foto gel! .3 &uat kur"a standar protein petanda pada kertas grafik semilog dengan sumbu @ 7linear) adalah arak 7mm atau 3m) pita-pita protein petanda dari batas atas gel pemisah dan sumbu y 7semi-log) adalah berat molekul protein-protein petanda! :3 Dengan menggunakan kur"a standar protein petanda, tentukan berat molekul pada pita-pita yang dilihat pada protein sampel plasma, M, +#, $#+, $ P, % #+, dan % !

PCR, ELEKTROFORESIS AGAROSE DAN SDS PAGE