Tugas Terstruktur

High Performance Liquid Chromatography ( HPL

Dosen Pembimbing : Lisa Utami, S.Pd, M.Si Disusun Oleh : Nopendra Oswai Desi Desvera Khalida Fitri Widya Oktaviani Sofiani Arnas JURUSAN PENDIDIKAN KIMIA FAKULTAS TARBIYAH DAN KEGURUAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SULTAN SYARIF KASIM RIAU

2013

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

A. Pengertian
Kromatografi Cair Berperforma Tinggi atau High Performance Liquid Chromatography

HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan

tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan
merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

HPLC adalah alat untuk mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi kandungan antibiotik pada susu dan daging udang, terutama kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula untuk kegiatan perikanan lainnya. HPLC adalah metode pemisahannya didasarkan pada perbedaan keseimbangan distribusi komponen sampel antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir). Tekanan tinggi diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah absorpsi, partisi, pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al. spektrofotometrik (absorpsi sinar UV atau tampak, fluorometri, penggunaan senyawa pendar/fluoresen, senyawa elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi). B. Prinsip Dasar HPLC Penentuan Kualitatif, HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa. Sedangkan, prinsip kerja dari HPLC adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi

yang berulang kali dari komponen yang dipisahkan. Pada saat komponen tersebut dibawa oleh fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena adanya perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen tersebut antara kedua fasa. HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm
dengan ukuran partikel penunjang 50m sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan

yang tinggi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif. 1. 2. standar. Penentuan Kuantitatif, beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: a. b. c. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan

menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. d. e. Berdasarkan area kromatogram. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram.

Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. C. Komponen Instrumen HPLC

Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC adalah sebagai berikut:

1.

Fasa gerak, HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis. Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi: a. Fasa normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam b. Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam.

2. Fase normal HPLC, kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. 3. Fase balik HPLC, dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. 4. Pompa, fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:

a.

Pompa reciprocating : Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas.

b.

Pompa syring : memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

5. Injektor (injector), sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L). Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan : a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi. b. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. 6. Kolom (Column), kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok : a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

7. Detector, berbagai detector untuk HPLC telah tersedia, walaupun demikian detector harus memenuhi persyaratan berikut: (1) cukup sensitive; (2)stabilitas dan keterulangan tinggi;(3) respon linear terhadap solute; (4) waktu respon pendek sehinggatidak bergantung kecepatan alir ;(5)realibilitas tinggi dan mudah digunakan; (6) tidak merusak cuplikan. D. Cara Kerja HPLC 1. Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. 2. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. 3. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). 4. Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit. Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. 5. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan. Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. 6. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel.

E.

Kelebihan HPLC Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau

HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya : 1. dapat dilaksanakan pada suhu kamar. 2. cepat dan mudah melaksanakannya. 3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik.

4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya. 5. ideal untuk molekul besar dan ion. 6. mudah memperoleh cuplikan. 7. daya pisahnya baik. 8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis. 9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.

F.

Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas

campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya. HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak. Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative.