Anda di halaman 1dari 40

BAB I

PENDAHULUAN
1.1. Maksud dan Tujuan Praktikum
1.1.1. Maksud Praktikum
Percobaan ini dimaksudkan untuk melakukan pengujian aktivitas
antimikroba dengan mengukur daya hambat atau daya bunuh serta tata cara isolat
senyawa anti mikroba dari ekstrak bahan alam yaitu kulit Jeruk Purut dan daun
Pacar Kuku.
1.1.2. Tujuan Praktikum
a. Untuk melakukan serta mengetahui pengujian daya hambat atau bunuh
antimikroba dari ekstrak bahan alam yaitu kulit Jeruk Purut dan daun Pacar
Kuku.
b. Untuk mngetahui adanya senyawa yang berkhasiat sebagai antimikroba
dengan melakukan isolasi senyawa dari ekstrak ekstrak bahan alam yaitu
kulit Jeruk Purut dan daun Pacar Kuku.

1.2. Prinsip Praktikum
Isolasi antimikroba dari ekstrak bahan alam ini menggunakan 2 sampel
yakni daun pacar kuku dan kulit jeruk nipis yang diujikan terhadap bakteri
Eschericia coli dan Staphylococcus aureus (metode difusi agar dan bioautografi).
Metode difusi agar adalah metode pengujian daya hambat dari ekstrak
terhadap pertumbuhan bakteri. Suspensi bakteri diambil 0,02 mL dimasukkan
dalam cawan petri, kemudian dimasukkan medium NA (Nutrient Agar) dengan
metode tuang. Ekstrak dengan konsentrasi 5 %, 10 %, dan 15 % masing-masing
direndam paper disk dan ditempel pada cawan petri lalu diinukabasi selama 1 x
24 jam pada suhu 37
o
C dan diukur zona hambat atau bunuh yang terbentuk.
Uji bioautografi dilakukan dengan membagi lempeng menjadi 4 bagian.
Ekstrak ditotol pada plat KLT, dielusi lalu diamati nodanya. Kemudian diletakkan
plat KLT diatas medium selama 20-25 menit, diangkat plat KLT lalu diinkubasi
selama 1 x 24 jam pada suhu 37
o
C dan diukur zona hambat atau bunuh yang
terbentuk.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Teori Umum
Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan sangat komplek.
Beratus-beratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam
bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan dan kulit. Sebagai contoh,
sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme (Pelczar, 1986).
Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak
mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut,
atau zat cair lain, maka dilakukan serangkaian pengenceran (dilution series)
terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat atau padat,
misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Tehadap bakteri
yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air
tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam.Dan jika bakteri hendak diisolasi dari
udara, cukup dengan membuka cawan petri yang berisi media agar steril beberapa
saat. Di dalam laboratorium mikrobiologi, populasi bakteri ini dapat diisolasi
menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi,
sifatdan kemampuan biokimiawinya (Dwidjoseputro, 1998).
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba
tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni.
Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari
satu sel tunggal. Beberapa cara yang dilakukan untuk mengisolasi
mikrooraganisme antara cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour
plate), cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution plate) serta
micromanipulator (Pelczar, 2008).
Antimikroba adalah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba yang
merugikan manusia. Antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba,
terutama fungi, yang dapat menghambat atau dapat mikroba jenis lain. Obat yang
digunakan untuk membasmi mikroba, penyebab infeksi pada manusia, ditentukan
harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya obat tersebut
haruslah bersifat sangat toksik untuk mikroba , tetapi relatif tidak toksik untuk
hospes. Sifat toksisitas selektif absolut belum atau mungkin tidak akan diperoleh.
(Salni, 2001)
2.1.1. Mekanisme kerja
Berdasarkan mekanisme kerja, antimikroba dibagi menjadi 5 kelompok
a. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba
Yang termasuk dalam kelompok ini adalah Sulfonamid, Trimetoprim, Asam
P-Aminosalisilat (PAS) dan Sulfon. Dengan mekanisme kerja ini diperoleh efek
bakteriostatik.
b. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba
Obat yang termasuk dalam kelompok ini ialah Penisilin, Sefalosporin,
Basitrasin, Vankomisin, dan Sikloserin. Dinding sel bakteri, terdiri dari
polipeptidoglikan.
c. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba
Obat yang termasuk dalam kelompok ini ialah polimiksin, golongan polien,
serta berbagai antimikroba kemoterapeutik umpamanya antiseptik surface active
agents. Polimiksin sebagai senyawa amonium-kuartener dapat merusak membran
sel setelah bereaksi dengan fosfat pada fospolipidmembran sel mikroba.
d. Antimikroba yang dapat menghambat sintesis protein sel mikroba
Obat yang termasuk dalam kelompok ini ialah golongan aminooglikosid
makrolit, Linkomisin, Tetrasklin dan Kloramfenikol. Untuk kehidupannya, sel
mikroba perlu mensisntesis berbagai protein. Sintesis protein berlangsung di
ribosom dengan bantuan mRNA dan tRNA. Pada bakteri, ribosom terdiri atas 2
sub unit, yang berdasarkan konstanta sedimentasi dinyatakan sebagai ribosom
3OS dan 5OS. Untuk berfungsi pada sintesis protein, kedua komponen ini akan
bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom 7OS. Penghambatan sintesis
protein terjadi dengan berbagai cara.
e. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba
Obat yang termasuk dalam golongan ini adalah rifamfisin, dan golongan
kuinolon. Yang lainnya walaupun bersifat antimikroba, karena sifat
sitotoksisitasnya, pada umumnya hanya digunakan sebagai obat antikanker; tetapi
beberapa obat dalam kelompok terakhir ini dapat pula digunakan sebagai
antivirus. Yang akan dikemukakan di sini hanya kerja obat yang berguna sebagai
antimikroba, yaitu rifampisin dan golongan kuinolon.
(Djide. 2008)
2.2. Uraian Medium
Komposisi NA adalah sebagai berikut:
Pepton : 5 gram
Ekstrak daging : 3 gram
Agar : 15 gram
Aquades : 1 L
Media NA (Nutrient Agar) adalah medium umum untuk uji air dan produk
dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme
yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan
media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan
salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji
biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk
pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam
kultur murni (Conda, 2007).
2.3. Uraian Sampel
2.3.1. Klasifikasi Pacar Kuku
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Sub Divsi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Myrtale
Suku : Lythraceae
Marga : Lawsonia
Spesies : Lawsonia inermis L
Pacar kuku di Indonesia juga paling dikenal sebagai pemerah kuku tradisional
dengan cara menumbuk daun dengan kapur atau gambir untuk mewarnai merah
kuku. Tidak hanya itu, dalam bentuk kering, apabila daunnya ditumbuk dengan
air, maka dapat digunakan untuk mewarnai rambut. Daun pacar kuku
mengandung zat warna Lawson yang dapat diekstrak sebagai kristal berwarna
kungin jingga, digunakan untuk mewarnai wol dan sutera. Daun mengandung
tanin (± 4,5 %), digunakan untuk obat penghenti diare serbuk daun digunakan
untuk obat luka.
Batangnya perdu, tegak, cabang-cabangnya sering berujung runcing. Daun
berhadapan, berbentuk jorong atau jorong-lanset, panjang 1,5-5,0 cm. Perbungaan
berupa malai, tumbuh di ujung cabang dan di ketiak daun, panjang 4 - 20 cm;
bunga kuning muda, merah jambu, atau merah; sangat harum. Sementara buahnya
berupa buah kotak, berbentuk bulat, atau bulat pipih, dan memiliki garis tengah ±
0,5 cm. Daun Lawsonia inermis mengandung saponin, flavonoida dan tanin.
(Notodimejo, 1992)
2.3.2. Klasifikasi Jeruk Purut
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Rosidae
Ordo : Sapindales
Famili : Rutaceae
Genus : Citrus
Spesies : Citrus aurantifolia (Christm.)
Jeruk Purut termasuk salah satu jenis citrus jeruk. Jeruk purut termasuk jenis
tumbuhan perdu yang banyak memiliki dahan dan ranting. Tingginya sekitar 0,5-
3,5 m. Batang pohonnya berkayu ulet, berduri, dan keras. Sedang permukaan kulit
luarnya berwarna tua dan kusam. Daunnya majemuk, berbentuk elips dengan
pangkal membulat, ujung tumpul, dan tepi beringgit. Panjang daunyya mencapai
2,5-9 cm dan lebarnya 2-5 cm. Sedangkan tulang daunnya menyirip dengan
tangkai bersayap, hijau dan lebar 5-25 mm.
Bunganya berukuran majemuk/tunggal yang tumbuh di ketiak daun atau di
ujung batang dengan diameter 1,5-2,5 cm. kelopak bunga berbentuk seperti
mangkok berbagi 4-5 dengan diameter 0,4-0,7 cm berwama putih kekuningan dan
tangkai putik silindris putih kekuningan. Daun mahkota berjumlah 4-5, berbentuk
bulat telur atau lanset dengan panjang 0,7-1,25 cm dan lebar 0,25-0,5 cm
berwarna putih Tanaman jeruk nipis pada umur 2 1/2 tahun sudah mulai berbuah.
Buahnya berbentuk bulat sebesar bola pingpong dengan diameter 3,5-5 cm
berwarna (kulit luar) hijau atau kekuning-kuningan. Tanaman jeruk nipis
mempunyai akar tunggang. Buah jeruk nipis yang sudah tua rasanya asam.
Tanaman jeruk umumnya menyukai tempat-tempat yang dapat memperoleh sinar
matahari langsung.
(Sastrapradja, 1997)
2.4. Uraian Bakteri
2.4.1. Escherichia coli
Escherichia coli adalah bakteri Gram negatif berbentuk batang yang tidak
membentuk spora yang merupakan flora normal di usus. Meskipun demikian,
beberapa jenis Escherichia coli dapat bersifat patogen, yaitu serotipe-serotipe
yang masuk dalam golongan Escherichia coli Enteropatogenik, Escherichia coli
Enteroinvasif, Escherichia coli Enterotoksigenik dan Escherichia coli
Enterohemoragik. .
Klasifikasi Ilmiah Escherichia coli
Divisi : Bacteria
kelas : Proteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Eschericha
Spesies : Escherichia coli
Morfologi Escherichia coli
Escherichia coli umumnya merupakan bakteri patogen yang banyak
ditemukan pada saluran pencernaan manusia sebagai flora normal. Morfologi
bakteri ini adalah kuman berbentuk batang pendek (coccobasil), gram negatif,
ukuran 0,4 – 0,7 µm x 1-3 µm, sebagian besar gerak positif dan beberapa strain
mempunyai kapsul (Pelczar, 2008).
2.4.2. Staphylococcus aureus
Klasifikasi:
Kingdom : Protista
Divisio : Protopyta
Kelas : Schzomycetes
Ordo : Eubacteriales
Familia : Enterbacteriaceae
Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Staphylococcus (dalam bahasa Yunani staphyle berarti sekelompok anggur
dan coccos yang berarti granula) adalah genus dari bakteri gram positif, tidak
bergerak, tidak berspora dan mampu membentuk kapsul. Di mikroskop mereka
tampak berbentuk bulat serta bergerombol seperti sekelompok anggur.
Genus staphylococcus mencakup 31 spesies. Kebanyakan tidak berbahaya
dan tinggal di atas kulit dan selaput lendir manusia dan organisme lainnya.
Mereka juga menjadi mikroba tanah. Genus ini dapat ditemui di seluruh dunia.
(Pelczar, 2008)
2.5. Uraian Eluen
2.5.1. Etil Asetat
Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH
3
CH
2
OC(O)CH
3
.
Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam asetat. Senyawa ini berwujud
cairan tak berwarna, memiliki aroma khas
Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap),
tidak beracun, dan tidak higroskopis. Etil asetat merupakan penerima ikatan
hidrogen yang lemah, dan bukan suatu donor ikatan hidrogen karena tidak adanya
proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif
seperti flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat melarutkan air hingga 3%, dan
larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar. Kelarutannya meningkat
pada suhu yang lebih tinggi. Namun demikian, senyawa ini tidak stabil dalam air
yang mengandung basa atau asam.


2.5.2. N-Heksana
Heksana adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus kimia
C6H14. Awalan heks- merujuk pada enam atom karbon yang terdapat pada
heksana dan akhiran –ana berasal dari alkana, yang merujuk pada ikatan tunggal
yang menghubungkan atom-atom karbon tersebut. N-heksana merupakan jenis
pelarut organik. Awalan heks- merujuk pada enam karbon atom yang terdapat
pada heksana dan akhiran -ana berasal dari alkana, yang merujuk pada ikatan
tunggal yang menghubungkan atom-atom karbon tersebut. Seluruh isomer
heksana amat tidak reaktif, dan sering digunakan sebagai pelarut organik yang
inert.
2.5.3. Metanol
Metanol, juga dikenal sebagai metil alkohol, wood alcohol atau spiritus,
adalah senyawa kimia dengan rumus kimia CH
3
OH. Ia merupakan bentuk alkohol
paling sederhana. Pada "keadaan atmosfer" ia berbentuk cairan yang ringan,
mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau yang
khas (berbau lebih ringan daripada etanol). metanol digunakan sebagai bahan
pendingin anti beku, pelarut, bahan bakar dan sebagai bahan additif bagi etanol
industri.
Metanol diproduksi secara alami oleh metabolisme anaerobik oleh bakteri.
Hasil proses tersebut adalah uap metanol (dalam jumlah kecil) di udara. Setelah
beberapa hari, uap metanol tersebut akan teroksidasi oleh oksigen dengan bantuan
sinar matahari menjadi karbon dioksida dan air.
2.5.4. Kloroform
Kloroform adalah nama umum untuk triklorometana (CHCl
3
). Kloroform
dikenal karena sering digunakan sebagai bahan pembius, meskipun kebanyakan
digunakan sebagai pelarut nonpolar di laboratorium atau industri. Wujudnya pada
suhu ruang berupa cairan, namun mudah menguap.
(DEPKES RI, 1979)


BAB III
METODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan
3.1.1. Alat
a. Autoklaf
b. Botol pengencer
c. Botol vial
d. Cawan petri
e. Chamber
f. Cutter
g. Hot plate
h. Inkubator
i. Labu erlenmayer 250 mL
j. Labu ukur 10 mL
k. Mikrometer sekrup
l. Oven
m. Pembakar spirtus
n. Penutup kaca
o. Pinset
p. Pipa kapiler
q. Pipet tetes
r. Pipet volume 10 mL
s. Propipet
t. Rak tabung reaksi
u. Spoid 1 mL
v. Spoid 10 mL
w. Tabung reaksi
x. Timbangan analitik
3.1.2. Bahan
a. Aquades
b. Ekstrak daun Pacar Kuku
c. Ekstrak kulit Jeruk Purut
d. Medium Nutrien Agar (NA)
e. NaCl 0,9%
f. Paper disc
g. Pelarut etil asetat
h. Pelarut kloroform
i. Pelarut metanol
j. Pelarut n-heksan
k. Plat KLT
l. Tween 80
3.1.3. Biakan bakteri
a. Bakteri Eschericia coli
b. Bakteri Staphylococcus aureus

3.2. Prosedur Kerja
3.2.1. Pembuatan medium
a. Ditimbang ekstrak daging 0,75 g, pepton 1,25 g, dan agar 3,75 g.
b. Dilarutkan dengan aquades dalam labu erlenmeyer.
c. Dipanaskan di atas hot plate lalu diaduk hingga larut.
d. Didinginkan dan disterilkan dalam autoklaf.
3.2.2. Penanaman bakteri
a. Dibuat media agar miring pada 2 tabung reaksi.
b. Diambil biakan murni bakteri dengan metode gores.
c. Ditutup dengan kapas lalu diinkubasi 24 jam pada suhu 37
o
C.
3.2.3. Pembuatan suspensi mikroba
a. Disiapkan medium NA miring dalam tabung reaksi
b. Diinokulasikan bakteri uji dalam media miring
c. Diinkubasi selama 1×24 jam dengan suhu 37 °C
d. Dimasukkan 9 mL NaCl 0,9 % ke dalam tabung reaksi berisi biakan bakteri
uji dan dihomogenkan (suspensi bakteri perbandingan 1:10)
e. Diambil 5 mL cairan dari tabung tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi steril II yang telah berisi 5 mL NaCl 0,9 % kemudian dihomogenkan
(suspensi bakteri perbandingan 1:20).
f. Diambil 5 mL cairan dari tabung reaksi II dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi steril III yang telah berisi 5 mL NaCl 0,9 % kemudian dihomogenkan
(suspensi bakteri perbandingan 1:40).
3.2.4. Pembuatan larutan stok
a. Ditimbang 2 gram ekstrak daun Pacar Kuku dan ekstrak kulit Jeruk Purut.
b. Dilarutkan dengan aquades hingga larut apabila tidak larut, tambahkan
Tween 80 tetes demi tetes hingga ekstrak larut.
c. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL.
d. Ditambahkan aquades hingga 10 mL dan dihomogenkan.
3.2.5. Pembuatan larutan seri konsentrasi ekstrak
a. Dibuat seri kosentrasi 5 % dengan diambil 2,5 mL larutan stok ekstrak dan
dilarutkan dengan 10 mL aquades di dalam botol vial serta dihomogenkan
b. Dibuat seri kosentrasi 10 % dengan diambil 5 mL larutan stok ekstrak dan
dilarutkan dengan 10 mL aquades di dalam botol vial serta dihomogenkan
c. Dibuat seri kosentrasi 15 % dengan diambil 7,5 mL larutan stok ekstrak dan
dilarutkan dengan 10 mL aquades di dalam botol vial serta dihomogenkan
3.2.6. Pembuatan Eluen
a. Dibuat perbandingan eluen etil asetat : n-heksan (6:4), kloroform : metanol
(10:1) dan kloroform : metanol (20:1) sebanyak 10 mL.
b. Dicampurkan 6 mL etil asetat dan 4 mL n-heksan untuk membuat eluen etil
asetat : n-heksan (6:4).
c. Dicampurkan 9,09 mL kloroform dan 0,91 mL metanol untuk membuat
eluen kloroform : metanol (10:1).
d. Dicampurkan 9,52 mL kloroform dan 0,48 mL metanol untuk membuat
eluen kloroform : metanol (20:1).
3.2.7. Uji Daya Hambat
a. Dimasukkan 0,02 mL suspensi bakteri ke dalam cawan petri.
b. Ditambahkan 10 mL medium NA dan dihomogenkan.
c. Dimasukkan paper disc yang telah direndam di larutan seri konsntrasi 5 %,
10 % dan 15 % ke atas medium yang setengah memadat.
d. Diinkubasi di inkubator selama 1×24 jam pada suhu 37° C.
e. Diamati dan diukur zona hambat atau zona bunuh yang terbentuk.
3.2.8. Uji Bioautografi
a. Disiapkan plat KLT dengan ukuran 2×8 cm dan digaris menggunakan pensil
pada tepi atas 0,5 cm serta tepi bawah 1 cm.
b. Diaktifkan plat KLT di dalam oven selama 30 menit.
c. Ditotol larutan stok ekstrak daun pacar kuku dan ekstrak kulit jeruk purut di
tepi bawah plat KLT menggunakan pipa kapiler.
d. Dielusidasi plat KLT di dalam chamber yang telah berisi eluen dengan
perbandingan tertentu dan dikeringkan.
e. Dimasukkan 0,02 mL suspensi bakteri ke dalam cawan petri.
f. Ditambahkan 10 mL medium NA ,dihomogenkan dan dibiarkan memadat.
g. Diletakkan plat KLT yang telah dielusidasi ke atas medium selama 30-45
menit kemudian diangkat plat KLT tersebut.
h. Diinkubasi di inkubator selama 1×24 jam pada suhu 37° C.
i. Diamati zona bening yang terbentuk pada bekas bagian penempelan plat
KLT.
















BAB IV
HASIL PENGAMATAN

4.1. Tabel Hasil Pengamatan
4.1.1. Tabel Pengamatan Metode Difusi
Sam-
pel
Bakteri
Konsentra-
si (%)
Replikasi (mm) Jum-
lah
Rata-
rata R
1
R
2
R
3
Kulit
Jeruk
Purut
Staphylococcus
aureus
5 % 2,31 2,24 3,12 7,67 2,56
10 % 3,25 3,62 3,05 9,92 3,31
15 % 3,90 4,90 3,70 12,5 4,17
Escherichia
coli
5 % 3,33 2,93 3,48 9,47 3,25
10 % 4,66 4,10 5,35 14,11 4,70
15 % 6,97 8,34 6,24 21,55 7,18
Total 24,42 26,1 24,9 75,49 25,17
Daun
Pacar
Kuku
Staphylococcus
aureus
5 % 2,60 3,14 2,22 7,56 2,65
10 % 3,60 3,95 3,92 11,47 3,82
15 % 4,33 4,25 4,43 13,01 4,34
Escherichia
coli
5 % 0,69 0,92 0,45 2,06 0,69
10 % 1,97 1,44 0,87 4,28 1,43
15 % 4,78 3,53 4,54 12,85 4,28
Total 17,97 17,2 16,4 51,36 17,21
4.1.2. Tabel Pengamatan Uji Bioautografi
a. Tabel ANAVA Kulit Jeruk Purut
Sumber
keseragaman
db Jk Kt
F
hitung
F tabel
Keterangan
5% 1 %
Perlakuan 5 40,69 8,14 F hitung > f
tabel 1% dan
5% sangat
signifikan
Galat 12 4,69 0,39 20,87 3,11 5,06
Total
17 45,38
b. Tabel ANAVA Daun Pacar Kuku
Sumber
keseragaman
db Jk Kt
F
hitung
F tabel
Keterangan
5% 1 %
Perlakuan 5 35,86 3,17 F hitung > f
table 1% dan
5% sangat
signifikan
Galat 12 2,12 0,177 40,51 3,11 5,06
Total 17 37,58






c. Tabel uji T Escherichia coli
Pasangan subyek (k)
K.JP
(E)
P.K
B
(k-e)
b
(B-MB)
b
2
K.JP P.K
5 % 5 % 2,65 2,56 0,09 -0,17 -0,028
10% 10% 3,82 3,31 0,51 0,25 0,062
15% 15% 4,34 4,17 0,17 -0,09 -0,008
10,81 10,04 0,77 -0,01 0,026
d. Tabel uji T Staphylococcus aureus
Pasangan subyek (k)
K.JP
(E)
P.K
B
(k-e)
b
(B-MB)
b
2
K.JP P.K
5 % 5 % 3,25 0,69 2,56 -0,35 -0,123
10% 10% 4,70 1,49 3,27 0,36 0,129
15% 15% 7,18 4,28 2,9 -0,01 -0,0001
Total 15,13 6,4 8,73 0 0,0059

4.2. Perhitungan
4.2.1. Perhitungan medium NA
a. Pepton =
5 gram
1000 ml

x
250 ml

x = 1,25
b. Agar =
15 gram
1000 ml

x
250 ml

x = 3,75
c. Ekstrak daging =
3 gram
1000 ml

x
250 ml

x = 0,75
4.2.2. Perhitungan pengenceran
Larutan stok 20% = 2 gram / 10 ml
a. Larutan ekstrak konsentrasi 5%
M
1
. V
1 =
M
2 .
V
2
20% . V
1=
5% . 10 ml
V
1 =
2,5 ml
b. Larutan ekstrak konsentrasi 10%
M
1
. V
1 =
M
2 .
V
2
20% . V
1=
10% . 10 ml
V
1 =
5 mL
c. Larutan ekstrak konsentrasi 15%
M
1
. V
1 =
M
2 .
V
2
20% . V
1=
15% . 10 ml
V
1 =
7,5 ml
4.2.3. Perhitungan eluen
a. Etil asetat : n- heksan (6:4) dalam 15 ml
Etil asetat =

x 10 mL = 6 mL
N- heksan =

x 10 mL = 4 mL
b. Kloroform : metanol (10:1)
Kloroform =

x 10 mL = 9,09 mL
Metanol =

x 10 mL = 0,91 mL
c. Kloroform : metanol (1:20)
Kloroform =

x 10 mL = 9,52 mL
Metanol =

x 10 mL = 0,48 mL
4.2.4. Perhitungan statistik
a. Ekstrak kulit jeruk purut
1) Faktor koreksi
Fk ÷
TIJ
2
r.t

75,49
2

÷ 316,59
2) Jk perlakuan ÷
TA
2
r
-
÷
7,67
2
9,92
2
¹ 12,5
2
¹ 9,74
2
¹ 14,11
2
¹ 21,55
2
3
- 316,59
= 35,28 - 316,59 = 40,69
3) Jk total = T (YIJ
2
) – Ik


= 361,97 – = 45,38
4) Jk galat = jk total – jk perlakuan
= 45,38- 40,69
= 4,69
5) Derajat bebas
db total = (r.t) – 1 = (3.6) – 1 = 17
db perlakuan = t -1 = 6-1 = 5
db galat = db total – db perlakuan = 17-5= 12
6) Kuadran tengah
kt perlakuan ÷
jk perlakuan
db perlakuan
÷
40,69
5
÷ 8,14
kt galat ÷
jk galat
db galat
÷
4,69
12
÷ 0,39
7) F hitung
F hitung ÷
jk perlakuan
db perlakuan
÷
8,14
0,39
÷ 20,87
8) Koefisien keseragaman
y ÷
75,49
3,6
÷ 4,19
kk = √KTG x 100°
y
= √0,39 x 100%
4,19
= 14,9 %
Karena nilai kk = 14,9 % maka digunakan uji BNJD (Beda Nyata Jujur
Duncan)
9) Rumus BNJD
KTG = 0,39, db= 12, r= 3
P
0,05
(p,12) = 2,179 dan P
0,01
(p,12) = 0,51



10) Rumus nilai standar deviasi
Sd = √2 . KTG ÷ √2.0,39 ÷ 0,51
s 3
Syi = √ KTG ÷ sd = √ 0,39÷ 0,36
R √ 3
11) Nilai BNJD
a) Untuk jarak nyata 2
BNJD 0,05 (P, 12) = 3,08 x 0,36 = 1,10
BNJD 0,01 (P, 12) = 4,32 x 0,36 = 1,55
b) Untuk jarak nyata 3
BNJD 0,05 (P, 12) = 3,77 x 0,36 = 1,35
BNJD 0,01 (P, 12) = 5,04 x 0,36 = 1,81
c) Untuk jarak nyata 4
BNJD 0,05 (P, 12) = 4,20 x 0,36 = 1,51
BNJD 0,01 (P, 12) = 5,50 x 0,36 = 1,98
12) Tabel BNJD Kulit Jeruk Purut
Mikroba uji
Konsentrasi
%
Rerata
Beda Real Jarak P
2 3 4
Staphylococcus
aureus
5 % 2,56 -
10% 3,31 0,75


15% 4,17
1,61***

0,86


BNJD 0,05 (P, 12)
BNJD 0,01 (P, 12)
1,10
1,55
1,35
1,81
1,51
1,98
Kesimpulan : Konsentrasi ekstrak kulit Jeruk Purut yang memiliki aktivitas
antimikroba yang paling tinggi adalah konsentrasi 15 %.
Keterangan :
*** : Sangat signifikan
** : Signifikan
* : Non signifikan



Mikroba uji
Konsentrasi
%
Rerata
Beda Real Jarak P
2 3 4
Escherichia
coli
5 % 3,25
10% 4,70 2,41
**

15% 7,18 0,04
*
-2,37
*

BNJD 0,05 (P, 12)
BNJD 0,01 (P, 12)
1,10
1,55
1,35
1,81
1,51
1,98
Kesimpulan : Konsentrasi ekstrak kulit Jeruk Purut yang memiliki aktivitas
antimikroba yang paling tinggi adalah konsentrasi 10 %.
Keterangan :
*** : Sangat signifikan
** : Signifikan
* : Non signifikan
e. Ekstrak daun pacar kuku
1) Faktor koreksi
Fk ÷
TIJ
2
r.t
÷
51,63
2
3,6
÷ 148,09
2) Jk perlakuan ÷
TA
2
r
- Ik

÷
7,96
2
11,47
2
¹ 13,01
2
¹ 2,06
2
¹ 4,28
2
¹ 12,85
2
3
- 148,09
= 35,86
3) Jk total = – Ik

) – 148,09
= 186,07 –148,09 = 37,98
4) Jk galat = jk total – jk perlakuan
= 37,98 – 35,86 = 2,12

5) Derajat bebas
db total = (r.t) – 1 = (3.6) – 1 = 17
db perlakuan = t -1 = 6-1 = 5
db galat = db total – db perlakuan = 17-5= 12
6) Kuadran tengah
Kt perlakuan ÷
jk perlakuan
db perlakuan
÷
35,86
5
÷ 7,712
Kt galat ÷
jk galat
db galat
÷
2,12
12
÷ 0,177
7) F hitung
F hitung ÷
kt perlakuan
db perlakuan
÷
7,172
0,177
÷ 40,519
8) Koefisien keseragaman
÷
51,63
3,6


÷
√0,177
2,87
x 100°
= 14,66 %
Karena nilai kk = 14,66 % maka digunakan uji BNJD (Beda Nyata Jujur
Duncan)
9) Rumus BNJD
KTG = 0,39, db= 12, r= 3
P
0,05
(p,12) = 2,179 dan P
0,01
(p,12) = 0,51
10) Rumus nilai standar deviasi
Sd÷
√2.KTG
s
÷
√2.0,177
3
÷ 0,344
Syi÷
√KTG
R
÷
sd
√2
÷
√0,177
3
÷ 0,24
11) Nilai BNJD
a. Untuk jarak nyata 2
BNJD 0,05 (P, 12) = 3,08 x 0,24 = 0,73
BNJD 0,01 (P, 12) = 4,32 x 0,24 = 1,03

b. Untuk jarak nyata 3
BNJD 0,05 (P, 12) = 3,77 x 0,24 = 0,90
BNJD 0,01 (P, 12) = 5,04 x 0,24 = 1,21
c. Untuk jarak nyata 4
BNJD 0,05 (P, 12) = 4,20 x 0,24 = 1,01
BNJD 0,01 (P, 12) = 5,50 x 0,24 = 1,32
12) Tabel BNJD Daun Pacar Kuku
Mikroba uji
Konsentrasi
%
Rerata
Beda Real Jarak D
2 3 4
Staphylococcus
aureus
15 % 2,7 1,69
**
0,152
5% 3,24 -


10% 5,4 1,17
**

BNJD 0,05 (P,12)
BNJD 0,01 (P,12)
0,73
1,03
0,90
1,21
1,01
1,32
Kesimpulan : Konsentrasi ekstrak daun Pacar Kuku yang memiliki aktivitas
antimikroba yang paling tinggi adalah konsentrasi 15 %.
Keterangan :
*** : Sangat signifikan
** : Signifikan
* : Non signifikan
Mikroba uji
Konsentr
asi %
Rerata
Beda Real Jarak D
2 3 4
Escherichia
coli
15 % 3,5 3,59** 2,85
5% 4,07 -


10% 6,3 0,74
**

BNJD 0,05 (P,12)
BNJD 0,01 (P,12)
0,73
1,03
0,90
1,21
1,01
1,32
Kesimpulan : Konsentrasi ekstrak daun Pacar Kuku yang memiliki aktivitas
antimikroba yang paling tinggi adalah konsentrasi 15 %.
Keterangan :
*** : Sangat signifikan
** : Signifikan
* : Non signifikan


4.3. Perhitungan uji T
4.3.1. Bakteri Escherichia coli
a. Nilai MB
MB ÷
_B
N
÷
8,73
3
÷2,91
b. Nilai t (t-hitung)
t ÷
Mk- Me

_b
2
N (N-1)


÷
15,13
3
-
6,4
3

0,0059
(3-1)

= 93,87
c. Derajat bebas
dt = N-1 = 3-1 = 2
t tabel 0,05 = 4,303
t tabel 0,01 = 9,425
t hitung lebih kecil dari t tabel 0,05 dan t tabel 0,01 jadi tidak signifikan atau
non signifikan

4.3.2. Bakteri Staphylococcus aureus
a. Nilai MB
MB ÷
_B
N
÷
0,77
3
÷ 0,26
b. Nilai t (t-hitung)

Mk- Me

_b
2
N (N-1)

÷
10,81
3
-
10,04
3

0,026
(3-1)

= 3,79
c. Derajat bebas
dt = N-1 = 3-1 = 2
t tabel 0,05 = 4,303
t tabel 0,01 = 9,425
t hitung lebih kecil dari t tabel 0,05 dan t tabel 0,01 jadi tidak signifikan atau
non signifikan
kesimpulan : tidak ada perbedaan aktivitas antimikroba diantara kedua
ekstrak yaitu ekstrak daun Pacar Kuku dan kulit Jeruk Purut.

4.4. Grafik
4.4.1.Grafik ekstrak kulit Jeruk Purut

4.4.2 Grafik ekstrak daun Pacar Kuku




0
5
10
15
Eschericia coli
Staphylococcus
aureus
0
5
10
15
Eschericia coli
Staphylococcus
aureus
4.5. Gambar pengamatan
4.5.1. Gambar Pengamatan Ekstrak Jeruk purut dan Ekstrak Pacar Kuku
a. Bakteri Eschericia coli
























k
Keterangan:
a. Cawan Petri
b. Medium NA
c. Zona Bening
d. Paper disk
e. Ekstrak Pacar Kuku 5%
f. Ekstrak Pacar Kuku 10%
g. Ekstrak Pacar Kuku 15%
h. Ekstrak kulit Jeruk Purut 5 %
i. Ekstrak kulit Jeruk Purut 10 %
j. Ekstrak kulit Jeruk Purut 15 %
k. Kontrol aquades

a
c
h
i
b
j
f
k
g
Keterangan:
a. Cawan Petri
b. Medium NA
c. Zona Bening
d. Paper disk
e. Ekstrak Pacar Kuku 5%
f. Ekstrak Pacar Kuku 10%
g. Ekstrak Pacar Kuku 15%
h. Ekstrak kulit Jeruk Purut 5 %
i. Ekstrak kulit Jeruk Purut 10 %
j. Ekstrak kulit Jeruk Purut 15 %
k. Kontrol aquades

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
a
c
h
i
b
j
d
e
f
g
Sampel : Ekstrak kulit Jeruk Purut dan
ekstrak Pacar Kuku I
Bakteri : Eschericia coli
k
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
a
c
h
i
b
j
d
e
f
g
Sampel : Ekstrak kulit Jeruk Purut dan
ekstrak Pacar Kuku I
Bakteri : Eschericia coli
k












b. Bakteri Staphylococcus aureus













Keterangan:
a. Cawan Petri
b. Medium NA
c. Zona Bening
d. Paper disk
e. Ekstrak Pacar Kuku 5%
f. Ekstrak Pacar Kuku 10%
g. Ekstrak Pacar Kuku 15%
h. Ekstrak kulit Jeruk Purut 5 %
i. Ekstrak kulit Jeruk Purut 10 %
j. Ekstrak kulit Jeruk Purut 15 %
k. Kontrol aquades

Keterangan:
a. Cawan Petri
b. Medium NA
c. Zona Bening
d. Paper disk
e. Ekstrak Pacar Kuku 5%
f. Ekstrak Pacar Kuku 10%
g. Ekstrak Pacar Kuku 15%
h. Ekstrak kulit Jeruk Purut 5 %
i. Ekstrak kulit Jeruk Purut 10 %
j. Ekstrak kulit Jeruk Purut 15 %
k. Kontrol aquades

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
a
c
h
i
b
j
d
e
f
g
Sampel : Ekstrak kulit Jeruk Purut dan
ekstrak Pacar Kuku II
Bakteri : Eschericia coli
k
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
a
c
h
i
b
j
d
e
f
g
Sampel : Ekstrak kulit Jeruk Purut dan
ekstrak Pacar Kuku I
Bakteri : Staphylococcus aureus
k

























Keterangan:
a. Cawan Petri
b. Medium NA
c. Zona Bening
d. Paper disk
e. Ekstrak Pacar Kuku 5%
f. Ekstrak Pacar Kuku 10%
g. Ekstrak Pacar Kuku 15%
h. Ekstrak kulit jeruk purut 5 %
i. Ekstrak kulit jeruk purut 10 %
j. Ekstrak kulit jeruk purut 15 %
k. Kontrol aquades

Keterangan:
a. Cawan Petri
b. Medium NA
c. Zona Bening
d. Paper disk
e. Ekstrak Pacar Kuku 5%
f. Ekstrak Pacar Kuku 10%
g. Ekstrak Pacar Kuku 15%
h. Ekstrak kulit jeruk purut 5 %
i. Ekstrak kulit jeruk purut 10 %
j. Ekstrak kulit jeruk purut 15 %
k. Kontrol aquades

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
a
c
h
i
b
j
d
e
f
g
Sampel : Ekstrak kulit Jeruk Purut dan
ekstrak Pacar Kuku II
Bakteri : Staphylococcus aureus
k
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
a
c
h
i
b
j
d
e
f
g
Sampel : Ekstrak kulit Jeruk Purut dan
ekstrak Pacar Kuku III
Bakteri : Staphylococcus aureus
k
Keterangan:
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Bakteri
d. KLT Daun Pacar Kuku
e. KLT Kulit Jeruk Purut


Keterangan:
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Bakteri
d. KLT Daun Pacar Kuku
e. KLT Kulit Jeruk Purut


4.5.2. Gambar Pengamatan Isolasi Ekstrak Jeruk Purut dan Pacar Kuku
a. Kloroform : metanol (10 : 1)











b. Kloroform : metanol (20 : 1)












LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Eschericia coli
Sampel Uji : Daun pacar kuku dan kulit
jeruk purut
a b
c
d
e
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Eschericia coli
Sampel Uji : Daun Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut
a b
c
d
e
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Eschericia coli
Sampel Uji : Daun Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut
a b
c
d
e
Keterangan:
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Bakteri
d. KLT Daun Pacar Kuku
e. KLT Kulit Jeruk Purut

Keterangan:
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Bakteri
d. KLT Daun Pacar Kuku
e. KLT Kulit Jeruk Purut

c. Etil asetat : N-heksana (6 : 4)











d. Kloroform : metanol (10 : 1)












LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Eschericia coli
Sampel Uji : Daun pacar kuku dan kulit
jeruk purut
a b
c
d
e
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Staphylococcus aureus
Sampel Uji : Daun pacar kuku dan kulit
jeruk purut
a b
c
d
e
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Eschericia coli
Sampel Uji : Daun Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut
a b
c
d
e
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Staphylococcus aureus
Sampel Uji : Daun Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut
a b
c
d
e
Keterangan:
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Bakteri
d. KLT Daun Pacar Kuku
e. KLT Kulit Jeruk Purut

Keterangan:
a. Cawan petri
b. Medium NA
c. Bakteri
d. KLT Daun Pacar Kuku
e. KLT Kulit Jeruk Purut

e. Kloroform : metanol (20 : 1)











f. Etil asetat : N-heksana (6 : 4)














LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Staphylococcus aureus
Sampel Uji : Daun Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut
a b
c
d
e
LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
Medium : Nutrient Agar (NA)
Bakteri : Staphylococcus aureus
Sampel Uji : Daun Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut
a b
c
d
e
BAB V
PEMBAHASAN

Isolasi adalah suatu usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang
bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni.
Tumbuhan mengandung ribuan senyawa sebagai metabolit primer dan metabolit
sekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami mengisolasi senyawa
metabolit sekunder, karena dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia.
Kandungan senyawa dari tumbuhan untuk isolasi dapat diarahkan pada
suatu senyawa yang lebih dominan dan salah satu usaha isolasi senyawa tertentu
maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik yang akan digunakan pada
isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar
dan sebaliknya senyawaa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar.
Antimikroba adalah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba yang
merugikan manusia. Antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba,
terutama fungi, yang dapat menghambat atau dapat mikroba jenis lain. Obat yang
digunakan untuk membasmi mikroba, penyebab infeksi pada manusia, ditentukan
harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya obat tersebut
haruslah bersifat sangat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk
hospes. Sifat toksisitas selektif absolut belum atau mungkin tidak akan diperoleh.
Antibiotika merupakan segolongan senyawa, baik alami maupun sintetik
yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di
dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Usaha mencari
antibiotika sebagai antimikroba tidak hanya dari mikroba tapi juga dari tumbuhan
berupa metabolit sekunder. Adapun senyawa-senyawa antimikroba yang berasal
dari tumbuhan tersebut antara lain seperti senyawa fenolik, terpenoid, alkaloid
lektin dan polipeptida, serta poliasetilen. Tumbuhan yang memiliki aktivitas
antimikroba diantaranya adalah Pacar Kuku dan Kulit Jeruk Purut. Hal ini juga
merupakan usaha dalam rangka meningkatkan potensi tumbuhan ini sebagai obat
fitofarmaka dari herbal Indonesia. Banyak metode isolasi yang dapat digunakan
seperti kromatografi yaitu kromatografi lapis tipis (KLT) bioautografi, karena
akan mengisolasi senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antimikroba. Selain
isolasi, percobaan kali ini juga dilakukan uji daya hambat sampel Pacar Kuku dan
Kulit Jeruk Purut masih dalam bentuk ekstrak kasar, yaitu masih terdapat berbagai
jenis senyawa yang memiliki perbedaan sifat kimia dan fisika dari senyawa
senyawa tersebut dalam menghambat pertumbuhan mikroba. Jika terdapat zona
bening pada medium biakan, kemungkinan sampel memiliki aktivitas mikrostatik
(menghambat pertumbuhan mikroba). Sedangkan bakteri yang digunakan pada
percobaan ini adalah Escherichia coli yang merupakan bakteri gram negatif dan
Staphilococcus aureus bakteri gram positif.
Tahapan-tahapan yang dilakukan untuk memperoleh ekstrak adalah
pembuatan simplisia dan proses ekstraksi. Ekstrak adalah sediaan kental, kering
atau cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia nabati atau hewani menurut
cara yang cocok, tanpa pengaruh cahaya matahari langsung. Simplisia merupakan
bahan alami yang dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan
apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan.
Adapun simplisia yang digunakan untuk memperoleh sampel ekstrak adalah
simplisia nabati yang berupa tanaman utuh, bagian tanaman atau eksudat tanaman.
Proses pembuatan simplisia meliputi pengumpulan bahan baku, sortasi basah,
pencucian sampel, perajangan, pengeringan tanpa cahaya matahari langsung,
sortasi kering, dan penyimpanan dalam wadah yang terlindung cahaya matahari
langsung. Simplisia yang telah diperoleh kemudian diekstraksi menggunakan
pelarut dan metode tertentu, tergantung dari sifat kandungan kimia, sifat simplisia
dan senyawa yang akan ditarik. Ekstraksi adalah proses penyaringan zat-zat
berkhasiat yang terdapat dalam bahan alam baik dari tumbuhan, hewan dan biota
laut dengan pelarut tertentu. Adapun metode ekstraksi yang digunakan pada
percobaan ini adalah maserasi. Prinsip penyarian senyawa dilakukan dengan cara
merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari yang sesuai selama tiga hari
pada temperatur kamar terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke
dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan
konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang
konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan
konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama
proses maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari.
Pertama dilakukan pengenceran larutan ekstrak kulit jeruk purut dan ekstrak
pacar kuku dari larutan stok 20 % pengenceran dibuat 10 mL dengan
menggunakan pelarut aquades, hingga didapat konsentrasi 5 %, 10 %, dan 15 %.
Pengenceran ini berfungsi menurunkan konsentrasi dari larutan stok agar tidak
menimbulkan konsentrasi toksik sehingga hasil yang didapat bukan pengaruh dari
dosis.
Uji pertama yang dilakukan adalah pengujian daya hambat ekstrak Pacar
Kuku dan Kulit Jeruk Purut dalam menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia
coli dan Staphilococcus aureus. Medium NA dan suspensi bakteri dicampurkan
ke dalam cawan petri, lalu dihomogenkan kemudian didiamkan hingga memadat.
Penginokulasian bakteri tidak dilakukan langsung kedalam cawan petri agar
pengohomogenan lebih baik dan mudah. Medium yang telah memadat
ditempelkan paper disk yang sebelumnya direndam dalam ekstrak uji dengan
konsentrasi yang berbeda-beda. Proses perendaman ini dilakukan selama 15 menit
agar diharapkan paper disk menyerap dengan maksimal larutan ekstrak yang
digunakan. Konsentrasi ekstrak yang digunakan meliputi 5 %, 10 % dan 15 %.
Dimana konsentrasi 5 % mewakili konsentrasi rendah, konsentrasi 10 % mewakili
konsentrasi sedang dan 15 % merupakan konsentrasi tinggi. Dengan adanya
perbedaan konsentrasi ini maka akan diketahui konsentrasi efektif ekstrak tersebut
yang sangat memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Digunakan paper disk karena
penggunaannya yang mudah dan daya kapilaritasnya yang cukup baik sehingga
memudahkan ekstrak untuk berdifusi pada medium biakan dan dapat menyerap
larutan sampel uji dalam jumlah tertentu sesuai diameter dan ketebalan paper disk
yang digunakan, sehingga dapat diatur dan seragam jumlah larutan yang terserap
antara paper disk yang satu dengan yang lainnya. Lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C
yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan tumbuhnya bakteri selama 24
jam. Kemudiaan dilakukan pengamatan zona bening terhadap zona bening yang
terbentuk. Dari data-data yang diperoleh dilakukan analisis menggunakan
perhitungan statistika yaitu anova satu arah untuk mengetahui pengaruh
konsentrasi ekstrak terhadap hambatan pertumbuhan bakteri uji, yang kemudian
dilanjutkan dengan perhitungan lanjutan berupa uji BNT (Beda Nyata Terkecil)
adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui nilai acuan dalam menentukan
apakah rata-rata dua perlakuan berbeda secara statistik atau tidak. BNJD (Beda
Nyata Jujur Duncan), Uji BNJ (Beda Nyata Jujur) yang didasarkan pada nilai KK
(Koefisien Keseragaman) untuk mengetahui konsentrasi yang berpengaruh sangat
signifikan terhadap pertumbuhan bakteri uji. Pada percobaan kali ini yang
digunakan adalah uji BNJD (Beda Nyata Jujur Duncan) dikarenakan koefisien
keseragaman diatas 10 %, tujuan pengujian ini adalah untuk mengetahui
konsentrasi yang berpengaruh sangat signifikan terhadap pertumbuhan bakteri.
Zona hambat adalah zona hambatan akan terlihat sebagai daerah jernih di
sekitar cakram kertas yang mengandung zat antibakteri sedangkan zona bunuh
adalah tidak terdapatnya mikroorganisme di daerah tersebut dikarenakan
mikroorganisme telah mengalami kematian. Diameter zona hambatan
pertumbuhan bakteri menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap zat antibakteri,
dikatakan bahwa semakin lebar diameter zona hambatan yang terbentuk bakteri
tersebut semakin sensitif. Zona bening yang terbentuk diukur diameternya, untuk
bakteri Escherichia coli ekstrak Kulit Jeruk Purut pada konsentrasi 5 % zona
bening yang diperoleh adalah 3,25 mm untuk konsentrasi 10 % zona bening yang
diperoleh adalah 4,7 mm, konsentrasi 15 % zona bening yang diperoleh adalah
7,18 mm. Untuk bakteri Escherichia coli ekstrak Pacar Kuku pada konsentrasi 5
% zona bening yang diperoleh adalah 0,69 mm untuk konsentrasi 10 % zona
bening yang diperoleh adalah 1,43 mm, konsentrasi 15 % zona bening yang
diperoleh adalah 4,28 mm. Untuk bakteri Staphylococcus aureus ekstrak Kulit
Jeruk Purut pada konsentrasi 5 % zona bening yang diperoleh adalah 2,56 mm
untuk konsentrasi 10 % zona bening yang diperoleh adalah 3,31 mm, konsentrasi
15 % zona bening yang diperoleh adalah 74,17 mm Untuk bakteri Staphylococcus
aureus ekstrak pacar kuku pada konsentrasi 5 % zona bening yang diperoleh
adalah 2,56 mm untuk konsentrasi 10 % zona bening yang diperoleh adalah 3,82
mm, konsentrasi 15 % zona bening yang diperoleh adalah 4,34 mm.
Namun pada perhitungan statistika uji-T yaitu prosedur pengujian
parametrik rata-rata dua kelompok data, baik untuk kelompok data terkait maupun
dua kelompok bebas dan untuk jumlah data yang sedikit maka perlu dilakukan uji
normalitas untuk memenuhi syarat dari sebaran datanya. Dilakukan uji-T untuk
membandingkan potensi antibakteri ekstrak Kulit Jeruk Purut dan ekstrak Daun
Pacar Kuku nampak tidak ada perbedaan yang signifikan (non signifikan) pada
bakteri Eschericia coli maupun bakteri Staphylococcus aureus. Sehingga dari
data-data ini dapat disimpulkan bahwa kedua sampel ini memiliki potensi sebagai
antibakteri baik terhadap bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif,
ekstral uji tidak nampak perbedaan yang sangat berbeda sebagai antibakteri atau
dapat dikatakan memiliki kemampuan potensi yang sama.
Sedangkan nilai F hitung yang digunakan untuk perbandingan F tabel 1 %
yakni 3,11 dan F tabel 5 % yakni 5,06. Diperoleh nilai F hitung untuk ekstrak
Kulit Jeruk Purut adalah sebesar 20,87 Sedangkan nilai F hitung untuk ekstrak
Pacar Kuku didapatkan hasil sebesar 40,519 (lebih dari nilai F tabel 1% dan 5%).
Dari hal tersebut dapat dilihat bahwa hasil yang didapatkan adalah tidak nampak
perbedaan yang sangat berbeda sebagai antibakteri atau dapat dikatakan memiliki
kemampuan potensi yang sama antara Kulit Jeruk Purut dan Pacar Kuku. Hal ini
dikarenakan pada sampel uji terdapat tanin yang berkhasiat sebagai antibakteri.
Hal ini diperkuat dengan adanya penelitian sebelumnya yang menyebutkan bahwa
adanya senyawa tanin yang terdapat pada ekstrak pacar kuku dapat berkhasiat
sebagai antimikroba. Jika F hitung lebih besar daripada F tabel maka terdapat
perbedaan konsentrasi yang mempengaruhi potensi antimikroba ekstrak sehingga
dilakukan uji lanjutan sedangkan jika F hitung lebih kecil dari pada F tabel maka
perbedaan konsentrasi tidak mempengaruhi potensi antimikroba ekstrak sehingga
dilakukan tidak perlu dilakukan uji lanjutan.
Pengujian selanjutnya adalah bioautografi adalah metode uji yang
didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT dengan
metode kontak, berdifusinya senyawa yang telah dipisahkan dengan kromatografi
lapis tipis ditempatkan diatas permukaan medium padat yang telah diinokulasikan
bakteri uji. Uji ini untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT
(Kromatografi Lapis Tipis) yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi dan
antivirus sehingga mendekatkan metode separasi dengan uji biologis. Senyawa
antimikroba yang telah berdifusi dari lempeng kromatogram ke dalam media agar
akan menghambat pettumbuhan bakteri setelah di inkubasi pada waktu dan suhu
yang tepat sampai noda yang menghambat pertumbuhan mikroba uji tampak pada
permukaan membentuk zona yang bening. Pertama-tama disiapkan plat KLT yang
telah diaktivasi, yaitu dioven agar diuapkan air yang terkandung pada plat karena
jika masih banyak mengandung air dapat mengganggu dan mempengaruhi hasil
dari elusidasi. Setelah itu dijenuhkan eluen dengan tujuan agar tekanan yang ada
di dalam chamber sama sehingga saat eludasi kedua pelarut yang digunakan
berbeda-beda sifat kimianya dapat mengeludasi dengan baik.
Eluen yang digunakan adalah etil asetat dengan n-heksan perbandingan 6 :
4, kloroform dan metanol 10 : 1 dan kloroform metanol 20 : 1. karena masing-
masing eluen memiliki tingkat kepolaran yang berbeda-beda yaitu etil asetat dan
n-heksan (6:4) bersifat polar, eluen kloroform dan metanol (10:1) bersifat kurang
polar dan eluen kloroform dan metanol (20:1) bersifat sangat kurang polar.
Dengan adanya variasi eluen tersebut maka diharapkan akan diperoleh hasil yang
maksimal, karena sifat kepolaran eluen sangat menentukan proses pemisahan
senyawa-senyawa pada ekstrak. Sedangkan fungsi penjenuhan eluen di dalam
chamber adalah untuk mempercepat proses elusi atau pemisahan pada plat KLT
ketika dimasukkan ke dalam chamber. Prinsip pemisahan KLT ini yakni
pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang
ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen). Komponen kimia
bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap
komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia tersebut dapat
bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal
inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Kemudian ditotolkan ekstrak uji
pada plat yang telah diberi garis batas bawah karena karbon merupakan bahan
yang akan bereaksi sehingga tidak mengganggu hasil dari elusidasi. Setelah eluen
yang ada di dalam chamber telah jenuh dimasukkan plat KLT yang telah ditotoli
masing-masing ekstrak uji dengan posisi tegak lurus dan ditempatkan pada daerah
yang datar agar hasil yang didapatkan maksimal.
Selanjutnya dimasukkan campuran Escherichia coli dan Staphylococcus
aureus kedalam cawan petri dan didiamkan sampai memadat lalu ditempelkan
plat KLT yang diatas medium yang telah memadat agar ekstrak dapat
berpenetrasi kedalam medium dan suspensi bakteri sehingga memperlama waktu
kontak antara plat KLT dengan medium sehingga senyawa yang terpisah dapat
berdifusi dengan baik kemudiaan plat diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C
yang merupakan suhu optimal pertumbuhan mikroba uji.
Hasil yang diperoleh adalah negatif untuk semua cawan bakteri uji sehingga
dapat artikan bahwa ekstrak uji tidak memiliki potensi sebagai antimikroba karena
tidak terdapatnya zona bening pada daerah medium uji. Tetapi pada saat
pengujian daya hambat ektrak uji memberikan hasil yang positif ini mungkin
dikarenakan beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil pada saat dilakukan
KLT bioautografi, diantaranya proses elusidasi dimana eluen tidak mampu
memisahkan senyawa kompleks menjadi senyawa yang lebih sederhana (senyawa
tunggal) dengan sempurna. Selain itu dapat juga dikarenakan ekstrak uji yang
digunakan tidak mengandung senyawa bioaktif yang terpisah, mikroba uji yang
digunakan terlalu pekat, serta pada uji ini digunakan sampel berupa ekstrak.
Seharusnya yang lebih baik digunakan adalah fraksi-fraksi karena telah
mengandung senyawa-senyawa yang terpisah berdasarkan kepolaran senyawa
tersebut.








BAB VI
PENUTUP

6.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan
bahwa :
1. Adanya aktivitas antimikroba pada uji daya hambat pada ekstrak pacar kuku
dan kulit jeruk purut
2. Pada uji lanjutan konsentrasi optimal tidak didapatkan karena pada saat
pengujian didapatkan hasilnya negatif pada kedua ekstrak uji.
3. Pada uji bioautografi tidak didapatkan senyawa yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroba karena hasil yang didapatkan adalah negatif.
4. Ekstrak yang sangat berpotensi sebagai antimikroba adalah kulit jeruk purut
dengan F hitung sebesar 40, 519 sedangkan F hitung untuk ekstrak pacar
kuku adalah 20, 87.

6.2. Saran
Praktikan disarankan agar lebih memahami materi yang dipraktikumkan
agar meminimalisir kesalahan terjadi pada saat praktikum dan selalu menjadi
kebersihan didlam laboratorium agar meminimumkan terjadinya kontaminasi.

5 % 10 % 15 %
55555555%%%%5555%%%
BAGAN KERJA
Isolasi metode difusi

Larutan Stok Sampel





















Direndam paper disk
± 10 menit
Ditempel dalam cawan petri
Medium NA
10mL, 0,02mL
suspensi bakteri
E = ekstrak I
M = ekstrak II
K = kontrol

Diinkubasi 24 jam, suhu 37
o
C

Diamati zona hambat dan dibandingkan

E1 M1
M2
K
E3 M3
E2
Metode Bioautografi

























Ditotol eluen

Dieludasi lempeng KLT

E M
10 mL medium NA +
0,01 mL suspensi bakteri
Diinkubasi 24 jam, suhu
37
o
C
Diamati hasil yang ditunjukkan
Ditempel plat KLT ± 30-
45 menit
Etil asetat : N-heksan (6:4)
Kloroform : Metanol (20:1)
Metanol : Kloroform (1:10)
1 cm
0,5 cm