HASIL PENELITIAN

Ekstrak Bawang Putih (Allium sativum) Menurunkan Jumlah Leukosit pada Mencit Model Sepsis akibat Paparan Staphylococcus aureus
Danar Dwi Anandika
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta, Indonesia

ABSTRAK Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak bawang putih (Allium sativum) dapat menurunkan jumlah leukosit pada mencit sepsis akibat paparan Staphylococcus aureus. Penelitian eksperimental laboratorium dengan post test design control group only; dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu, Yogyakarta. Subjek penelitian 27 ekor mencit Balb/C jantan dengan berat 40-45 gram, berumur 8-10 minggu. Kelompok perlakuan diberi inokulum Staphylococcus aureus 0,1 mL/i.p./mencit untuk menginduksi sepsis. Salah satu kelompok perlakuan diberi ekstrak bawang putih 4 mg/0,2 mL. Hasil penelitian ini adalah rerata jumlah leukosit pada kelompok kontrol relatif normal berturut-turut 6955 /L, 6928 /L, 7056 /L. Sedangkan pada kelompok sepsis tanpa ekstrak bawang putih berturut turut 4720 /L, 6589 /L, 5188 /L. Pada kelompok sepsis + ekstrak bawang putih berturut-turut 6038 /L, 6933 /L, 7183 /L. Hasil analisis parametrik uji T (<0,05) menunjukkan ada perbedaan signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok sepsis tanpa ekstrak bawang putih (P=0,008). Tidak ada perbedaan signifikan antara kelompok kontrol dengan kelompok sepsis + ekstrak bawang putih (P=0,65). Ada perbedaan signifikan antara kelompok sepsis tanpa ekstrak bawang putih dengan kelompok sepsis + ekstrak bawang putih (P=0,02). Ekstrak bawang putih 4 mg/0,2 ml mampu menurunkan jumlah leukosit dan menjaganya dalam kisaran stabil pada mencit yang telah diinduksi sepsis dengan injeksi inokulum Staphylococcus aureus. Kata Kunci: Allium sativum, Sepsis, Staphylococcus aureus

PENDAHULUAN Staphylococcus aureus adalah mikroba patogen yang mampu menyebabkan berbagai penyakit pada manusia. Secara in vitro Staphylococcus aureus dapat menyerang dan bertahan hidup di dalam sel epitel termasuk sel endotel, sehingga sulit dikenali oleh sistem pertahanan tubuh. Staphylococcus aureus juga mampu membentuk koloni kecil yang berbeda/small-colony variants (SCVs) yang menyebabkan infeksi Staphylococcus sulit disembuhkan dan sering berulang.1 Staphylococcus berperan penting dalam infeksi nosokomial dan penyakit infeksi lain. Staphylococcus aureus menghasilkan bermacammacam enzim seperti protease, elastase, lipase yang digunakan untuk menginvasi dan merusak jaringan tubuh manusia bahkan untuk berpindah ke lokasi lain. Staphylococcus aureus juga dapat menyebabkan syok septik karena interaksi Staphylococcus aureus dengan mediator-mediator inflamasi. Beberapa strain Staphylococcus aureus menghasilkan superantigen seperti racun makanan dan toxic shock syndrome. Superantigen tersebut dapat menyebabkan sepsis akibat aktifnya sitokin seperti selektin, integrin, PECAM, ICAM, dsb.
CDK 183/Vol.38 no.2/Maret - April 2011

Secara normal, jumlah leukosit pasien sepsis meningkat (leukositosis) sebagai respons pertahanan tubuh terhadap infeksi. Namun peningkatan leukosit yang berlebihan dan berlarut-larut dapat merusak tubuh. Pelepasan sitokin berlebihan yang berasal dari monosit serta reactive oxygen species (ROS) yang berasal dari neutrofil ke dalam sirkulasi dapat memicu terjadinya sepsis.3 Manfaat bawang putih telah diakui lebih dari 5000 tahun. Orang orang Babilonia, Mesir, Viking, Cina, Yunani, Romawi menggunakan bawang putih untuk mengobati berbagai penyakit seperti gangguan pencernaan, flatulensi, cacingan, infeksi pernapasan, penyakit kulit, luka, gejala penuaan dan penyakit lain. Pada Perang Dunia II bawang putih digunakan untuk mencegah infeksi luka prajurit.4 Bawang putih memiliki berbagai efek terapeutik pada sistem kardiovaskular, antibiotik, antikanker, antioksidan, immunomodulator, anti-inflamasi, efek hipoglikemik. Bawang putih dapat menghambat pertumbuhan Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Citrella, Citrobacter, Clostridium, Enterobacter, Escherichia, Proteus,

Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus dan Vibrio ; menunjukkan efek antibiotik berspektrum luas melawan bakteri gram positif dan gram negatif. Bawang putih juga efektif melawan organisme yang sudah resisten terhadap antibiotik. Kombinasi bawang putih dan antibiotik menunjukkan sinergisme parsial maupun total. Sampai saat ini belum dilaporkan resistensi mikroba terhadap bawang putih; oleh karena itu bawang putih memiliki potensi untuk terapi suportif infeksi mikroba.5 Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak bawang putih (Allium sativum) dapat menurunkan jumlah leukosit pada mencit yang sepsis akibat paparan Staphylococcus aureus; diharapkan dapat memberi informasi efek bawang putih terhadap peningkatan leukosit pada sepsis serta dapat menjadi bahan pertimbangan pemanfaatan bawang putih (Allium sativum) sebagai terapi ajuvan. METODE PENELITIAN Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorium dengan post test design with control group only yang dilaksanakan di Laboratorium

97

HASIL PENELITIAN
Penelitian dan Pengujian Terpadu, Jln. Agro Malang Kampus UGM, Yogyakarta. Subjek penelitian 27 ekor mencit Balb/C jantan dengan berat badan 40-45 gram, dan berumur 8-10 minggu. Dua pertiga subjek penelitian diberi inokulum Staphylococcus aureus untuk menginduksi sepsis. Pengambilan sampel dilakukan secara acak. Variabel bebasnya adalah ekstrak bawang putih sedangkan variabel terikatnya adalah jumlah leukosit. Variabel luar yang dapat dikendalikan yaitu genetik, berat badan, makanan, umur, sedangkan yang tidak dapat dikendalikan yaitu variasi kepekaan mencit terhadap suatu zat. Ekstrak bawang putih didapatkan dari Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO) Tawangmangu dengan teknik maserasi dengan rendemen 13% menggunakan pelarut etanol 70%. Dosis ekstrak bawang putih 4mg.6 Staphylococcus koagulase positif didapatkan dari Laboratorium Klinik Mikrobiologi Rumah Sakit Dr. Moewardi Surakarta. Sampel diambil dari 4 kasus : I, usia 3,5 tahun, wanita, didiagnosis tonsilofaringitis; kuman diambil dengan apusan tenggorok. FA, usia 1 tahun 5 bulan, laki-laki, didiagnosis otitis media supuratif akut (OMA); kuman diambil dari sekret telinga. R, 41 tahun, laki-laki, didiagnosis infeksi post pyeloplasty; pengambilan kuman dari pus. S, 45 tahun, wanita, didiagnosis abses femur; pengambilan kuman dari pus. Pemeriksaan koloni dengan mannitol salt agar (MSA) untuk menemukan Staphylococcus aureus. Dari kasus pasien tonsilofaringitis dipilih yang pertumbuhannya paling baik pada blood agar plate setelah diinkubasi pada suhu 37,5C selama satu hari. Diambil satu sengkelit kuman dan dimasukkan ke tabung reaksi berisi 5 mL NaCl, didapatkan suspensi bakteri yang homogen. Dosis Staphylococcus aureus untuk menginduksi sepsis adalah 1x109 CFU/ mencit.7; diperoleh dengan cara membandingkan kepekatan suspensi koloni dengan kepekatan McFarland 0,5. Leukosit dihitung menggunakan alat hemositometer dengan pengenceran 1:20. Larutan pengencer harus bisa melisiskan sel darah merah; digunakan asam asetat 0,5% atau larutan Turk yang dibuat dari 1 mL asam asetat glasial, 1 mL larutan gentian violet dalam air, dan 100 mL air suling. Untuk memperoleh pengenceran 1:20, darah dihisap ke dalam pipet pengencer sel darah putih sampai batas 0,5 lalu diisi dengan larutan pengencer sampai tanda 11. Kurang lebih 3-4 tetes larutan dibuang, lalu satu tetes diteteskan pada kamar hitung dan dibiarkan menetap selama 3 menit.8 Sediaan kemudian diperiksa dengan mikroskop perbesaran 100x. Pada kamar hitung improved Neubauer, leukosit dihitung pada empat kotak besar di tiap sudut tiap sisi kamar hitung. Sel yang menempel di garis pemisah sebelah kiri dan di garis atas kotak persegi ikut dihitung, sel yang menempel di kedua sisi kotak lain tidak ikut dihitung. Dalamnya kamar hitung 0,1 mm, sehingga dengan pengenceran 1:20 perhitungan akhir sesudah menghitung 4 kotak besar adalah sebagai berikut : Jumlah leukosit per mm3 darah = jumlah leukosit yang dihitung x 50.8
Rumus :

Penghitungan leukosit dilakukan manual di laboratorium Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Hewan UGM. Alat dan bahan penelitian adalah kandang hewan percobaan, timbangan hewan, syringe injeksi, sonde, pipet ukur, labu takar, hemositometer improved Neubauer, ose, mencit Balb/ C, ekstrak bawang putih, manitol salt agar (MSA), NaCl fisiologis, makanan hewan uji, dan koloni Staphylococcus aureus. Analisis menggunakan statistik parametrik interferensi dengan analisis univariat dan jenis data varian rasional. Analisis univariat dengan uji tberpasangan. Data penelitian ini adalah jumlah leukosit di kelompok kontrol (K), kelompok perlakuan 1 (K1), dan kelompok perlakuan 2 (K2). Pada masing-masing kelompok dilakukan 3 kali pemeriksaan leukosit. Hasil yang diharapkan adalah adanya perbedaan signifikan deviasi jumlah leukosit antar kelompok selama 3 kali pengambilan leukosit.

N x 20 mm3 4 x 1 x 1 x 0,1
N = jumlah leukosit yang dihitung tiap lapang pandang

HASIL Tabel 1. Hasil Hitung Leukosit pada 24, 36, 48 jam Induksi Sepsis
Jumlah Leukosit pada 24 jam (/L) 5 Agustus 2009 9350 9700 8400 5150 1650 8100 9400 6200 4650 4600 3700 5350 3850 5100 5150 6750 3100 4800 10500 4700 4800 4900 7800 5950 4500 6250 4950 Jumlah Leukosit pada 36 jam (/L) 6 Agustus 2009 7850 9900 6250 2200 6750 7150 8600 7150 6500 5750 6100 9700 6300 6900 7500 7000 6450 3600 8050 7400 6700 6050 6900 4300 7300 8400 7300 Jumlah Leukosit pada 48 jam (/L) 7 Agustus 2009 8350 7600 8150 4100 9100 4900 9800 8900 2600 5600 3900 8800 5300 4750 6100 3750 3300 9400 10100 7250 5100 8500 7400 3200 6300 7400

Kelompok

K1

K2

Sumber S mber : Data Primer, Primer 2009

Keterangan : K : Kelompok kontrol negatif K1 : Kelompok perlakuan 1 (pemberian 0,1 mL inokulum Staphylococcus aureus) K2 : Kelompok perlakuan 2 (pemberian 0,1 mL inokulum Staphylococcus aureus + ekstrak bawang putih)

98

CDK 183/Vol.38 no.2/Maret - April 2011

HASIL PENELITIAN
Ada perbedaan bermakna antara K dengan K1 (p < 0.05). Tidak ada perbedaan bermakna antara K dengan K2 (p > 0.05). Ada perbedaan bermakna antara K1 dengan K2 (p < 0.05). PEMBAHASAN Bawang putih mengandung allicin yang dipercaya berperan penting sebagai antimikroba. Allicin merupakan molekul tidak stabil, sehingga tidak ditemukan di dalam darah maupun urin meskipun dikonsumsi dalam jumlah banyak. Selama dekade terakhir, para ahli menganggap allicin-lah yang memiliki peran antimikroba pada bawang putih.5,9,10,11 Turunan allicin yang memiliki efek antimikroba adalah diallyl disulfides (DADS) dan ajoene. Meski ada kandungan lain pada bawang putih yang lebih stabil di dalam tubuh seperti S-allyl cystein (SAC), namun penelitian belum menunjukkan efek antimikroba. Ekstrak bawang putih diharapkan mampu menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus sehingga leukosit yang teraktivasi bisa terkendali dan tidak terakumulasi; dengan demikian kerusakan sel maupun organ bisa dihindari. Makin tinggi kadar ekstrak, makin tinggi daya hambat tumbuh Staphylococcus aureus. Secara in-vitro ekstrak bawang putih terbukti mampu menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus.5,9,13,14 Hitung leukosit pada kelompok K2, yaitu kelompok perlakuan inokulum Staphylococcus aureus disertai pemberian ekstrak bawang putih menunjukkan hasil positif yaitu tidak berbeda signifikan terhadap kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukkan ekstrak bawang putih 4 mg/0,2 mL mampu menghambat perkembangan Staphylococcus aureus. Implikasi teoritis penelitian ini sejalan dengan penelitian Shokrzadeh dan Ebadi, bahwa ekstrak bawang putih dengan kadar 4 mg memiliki daya hambat 8 mm pada disk antimikroba, dan daya hambat minimum ekstrak bawang putih terhadap Staphylococcus aureus adalah 6,2 mg per mL.12 Ekstrak bawang putih dengan kadar 4 mg mampu meningkatkan indeks fagositosis tubuh.6 Dosis optimum maupun dosis toksik ekstrak bawang putih sebagai agen antimikroba masih perlu diteliti lebih lanjut, serta untuk uji reliabilitas penelitian sebelumnya.

Tabel 2. Rata-Rata Jumlah Leukosit Tiap Kelompok Pasca-Induksi Sepsis Kelompok K K1 K2

Sumber : Data Primer, 2009

Hari I pasca-perlakuan 6955 4720 6038

Hari II pasca-perlakuan 6928 6589 6933

Hari III pasca-perlakuan 7056 5188 7183

8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

6955 6038 4720 Jumlah Leukosit

Kelompok K

Kelompok K1

Kelompok K2

Grafik 1. Jumlah Leukosit antar Kelompok Hari I Pasca-Perlakuan

8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

6928

6589

6933

Jumlah Leukosit

Kelompok K

Kelompok K1

Kelompok K2

Grafik 2. Jumlah Leukosit antar Kelompok pada Hari II Pasca-Perlakuan 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

7056 5188

7183

Jumlah Leukosit

Kelompok K

Kelompok K1

Kelompok K2

Grafik 3. Jumlah Leukosit antar Kelompok pada Hari III Pasca-Perlakuan Tabel 3. Hasil Analisis Uji T antar Kelompok Kelompok yang dibandingkan K dengan K1 K dengan K2 K1 dengan K2
Sumber : Data Primer, 2009

= 0.05 0.008 0.65 0.02

Pvalue S NS S
Keterangan : S = Signifikan NS = Non-signifikan

CDK 183/Vol.38 no.2/Maret - April 2011

99

HASIL PENELITIAN
Kelompok perlakuan K1 inokulum Staphylococcus aureus tanpa pemberian ekstrak bawang putih, memiliki perbedaan jumlah leukosit yang signifikan dibandingkan dengan dua kelompok lain; disebabkan karena pertumbuhan Staphylococcus aureus dan penyebaran eksotoksin bakteri tersebut tanpa pengaruh imunomodulator atau supresor antigen. Bahkan pada kelompok ini satu mencit mati akibat sepsis. Pada hari pertama jumlah leukosit di kelompok perlakuan inokulum Staphylococcus aureus lebih rendah dibandingkan dengan di kelompok kontrol mengingat pada sepsis dini terjadi leukopenia: sebagai mekanisme pertahanan tubuh seluler, leukosit terdeposisi di luar pembuluh darah secara diapedesis untuk mengeliminasi antigen mikroba. Pada hari ke dua jumlah leukosit meningkat. Respons puncak reaksi inflamasi karena bakteri Gram positif terjadi sekitar 50-75 jam atau antara 2-3 hari.2 Sitokin yang disekresikan oleh sel T akan menstimulasi proliferasi sel T yang spesifik untuk antigen, terjadi clonal expansion sehingga leukosit dalam sistem sirkulasi akan meningkat. Pada hari ke tiga jumlah leukosit kelompok K1 turun sementara di kelompok K2 meningkat. Apabila antigen penyebab infeksi berhasil diatasi, maka stimulus yang memicu diferensiasi dan proliferasi juga akan berhenti. Klon sel T yang sudah terbentuk akan mati dan kembali ke keadaan basal, sehingga leukosit akan kembali normal bila infeksi telah tereliminasi.15 Kelompok K1 menunjukkan respons inflamasi puncak telah terlewati dan jumlah leukosit hampir kembali ke keadaan basal. Namun pada kelompok K2 terjadi peningkatan tidak bermakna jumlah leukosit; mungkin karena adanya kesalahan di luar faktor perlakuan seperti hitung leukosit kurang teliti atau karena munculnya faktor stres pada mencit. SIMPULAN Ekstrak bawang putih dengan dosis 4 mg mampu menurunkan jumlah leukosit dan menjaganya dalam kisaran stabil pada mencit yang telah diinduksi sepsis menggunakan Staphylococcus aureus intraperitoneal. Perlu diteliti efektivitas dosis ekstrak bawang putih untuk mengetahui kadar terapi optimum sebagai adjuvant therapy pada sepsis, serta dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis toksik ekstrak bawang putih.

DAFTAR PUSTAKA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. Gordon JR, Lowy DF. Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis. 2008; 46(Suppl 5): S350-S9. Fournier B, Philpott DJ. Recognition of Staphylococcus aureus by the innate immune system. Am. Soc. Microbiol. 2005.doi:10.1128/CMR.18.3.521-40. Aird WAC. The hematologic system as a marker of organ dysfunction in sepsis. Mayo Clin Proc. 2003;78:869-81. Amagase H, Petesch BL, Matsuura H et al. Intake of garlic and its bioactive components. J. Nutr. 2001.131 : 955S-62S. Shivam GP. Protection against Helicobacter pylori and other bacterial infections by garlic. J Nutr. 2001;131:1106S-8S. Sawitri E.. Pengaruh ekstrak bawang putih (Allium sativum) terhadap daya tahan mencit balb/c yang diinfeksi Listeria monocytogenesis. M.Med Indonesia 2005 : 40:45-51. Gjertsson I et al. Are B lymphocytes of importance in severe Staphylococcus aureus infections?. Infect and Immun. 2000: 2431-4. Smith BJ, Mangkoewidjojo S. Pemeliharaan, Pembiakan, dan Penggunaan Hewan Percobaan di Daerah Tropis. Jakarta : UI-Press. 1988. Tsao SM, Yin M.C. In-vitro antimicrobial activity of four diallyl sulphides occuring naturally in garlic and Chinese leek oils. J. Med. Microbiol. 2001;V0l 50, p: 646-9. Tsao SM, Hsu CC, Yin MC. Garlic extract and two diallyl sulphides inhibit methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection in BALB/c A mice. JAC. 2003;52:974-80. Tsao SM, Liu WH, Yin M.C. Two diallyl sulphides derived from garlic inhibit metichillin-resistant Staphylococcus aureus infection in diabetic mice. J. Med Microbiol. 2007;56:803-8. Shokrzadeh M, Ebadi AG.. Antibacterial effect of garlic (Allium sativum L.) on Staphylococcus aureus. Pak.J.Biol.Sci 2006;9(8):1577-9. Barak M, Ettehad GH, Arab R, Derakhshani F, Habibzadeh SH, Mohammadnia H, Dailami P, Daryani A, Zarei M. Evaluation of garlic extract's (Allium sativum) effect on common pathogenic gram-positive and gram-negative bacteria isolated from children with septicemia hospitalized at Imam Khomeini hospital. Res.J.Biol.Sci., 2007;2(3):236-8. Naganawa R, Iwata N, Fukuda H et al. Inhibition of microbial growth by ajoene, a sulfur-containing compound derived from garlic. Appl. Environ. Microbiol. 1996.:4238-42. Klinikpediatri. 2009. Imunitas Selular. http://childrenallergyclinic.wordpress.com/2009/05/16/imunitas-selular/. (12 November 2009).

14. 15.

100

CDK 183/Vol.38 no.2/Maret - April 2011