Anda di halaman 1dari 5

5

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan,

Departemen Proteksi Tanaman dan Kebun Percobaan Leuwikopo, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari bulan April sampai Agustus 2010.

Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah buah pepaya sakit yang bergejala busuk basah varietas IPB 6, tanaman tembakau, dan umbi kentang. Media biakan yang digunakan Nutrient Agar (NA), Potato Dectrose Agar (PDA), dan Luria Broth (LB). Media yang digunakan untuk pengujian adalah media Kings B, Oksidatif/Fermentatif (O/F), Trypenil Tetrazolium Chloride (TZC), Yeast Extract Dectrose CaCO3 Agar (YDCA), Phospate Buffer Saline (PBS), KOH 3%, alkohol 70%, Malachite green 5% , Safranin 0,5%, parafin oil, akuades, kapas, silk dan tissu. Alat-alat yang digunakan: jarum suntik, autoklaf, bunsen, cawan petri, gelas bite, gelas obyek, gelas ukur, lup inokulasi, kantong plastik tahan panas, labu erlenmeyer, mikroskop cahaya, lampu UV, pipet mikrometer, pisau, dan inkubator bergoyang. Metode Penelitian Survei Buah Pepaya Sakit Survei buah pepaya dilakukan pada buah pepaya yang menimbulkan gejala busuk basah. Buah pepaya tersebut diamati kemudian dibawa ke Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan untuk diidentifikasi bakteri dan cendawan yang berasosiasi pada buah yang bergejala. Survei dilakukan beberapa kali, namun pengambilan sampel dilakukan sebanyak dua kali.

Isolasi Buah Bergejala Busuk Basah Sampel buah pepaya yang menimbulkan gejala busuk basah diisolasi dengan menggunakan pengenceran berseri. Bagian yang diambil untuk diisolasi adalah bagian antara sakit dan sehat. Bagian tersebut dibersihkan dengan air steril dan dimasukkan ke erlemeyer yang berisi 100 ml air steril dan PBS ( Phospate Buffer Saline) dengan perbandingan 1:1 dan dishaker 150 rpm selama semalam (over night). Larutan PBS (Phospate Buffer Saline) merupakan larutan penyangga yang dapat mempertahankan pH agar tetap netral atau berada pada pH 7. Sebagian besar bakteri tumbuh dengan baik pada media dengan pH 7 (Hadioetomo 1990). Pengenceran berseri dilakukan terhadap suspensi buah hingga pengenceran 10-6. Setiap 0,1 ml suspensi ditumbuhkan dengan metode sebar menggunakan gelas bite pada media Nutrient Agar (NA) dan Potato Dextrose Agar (PDA) kemudian diidentifikasi bakteri dan cendawan yang muncul.

Identifikasi Bakteri Bakteri yang muncul dari hasil isolasi kemudian dilakukan identifikasi berdasarkan kunci identifikasi Schaad et al. (2001) dan Brown et al. (1980) dengan beberapa pengujian yaitu uji Gram, hipersensitivitas pada daun tembakau, fluoresensi pada media Kings B, pembusukan kentang, uji Oksidatif/fermentatif, uji pertumbuhan pada media Yeast Extract Dextrose CaCO3 Agar (YDCA), pertumbuhan pada media Trypenil Tetrazolium Chloride (TZC), dan uji pembentukan endospora. Uji Gram Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui reaksi Gram isolat bakteri yang diuji. Isolat bakteri diambil dengan menggunakan lup inokulasi dan diletakkan pada gelas obyek yang telah ditetesi KOH 3% lalu dicampurkan dan diamati. Apabila terbentuk lendir dan terasa lengket ketika jarum inokulasi diangkat maka hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri golongan Gram negatif dan sebaliknya jika tidak terbentuk lendir dan tidak lengket maka bakteri tersebut adalah bakteri golongan Gram positif.

Uji Hipersensitivitas Uji hipersensitivitas pada daun tembakau bertujuan mengetahui sifat patogenik dari bakteri uji. Isolat bakteri yang diuji dibiakan pada 5 ml media LB (Luria Broth) sehingga menjadi suspensi bakteri, dishaker 100 rpm selama 20 jam dan diinokulasikan pada daun tembakau dengan cara disuntikan pada permukaan bawah daun sampai terlihat agak kebasahan. Apabila setelah 24-48 jam menunjukkan gejala nekrosis pada bagian daun tembakau tersebut, maka reaksi tersebut adalah positif, dan sebaliknya jika tidak menunjukan gejala maka reaksi tersebut adalah negatif. Kontrol dengan menggunakan media LB tanpa diberi bakteri.

Uji Fluoresensi Pengujian Isolat bakteri yang diremajakan pada media NA diambil dengan menggunakan jarum inokulasi lalu digoreskan pada media Kings B dan diinkubasi selama 24-48 jam. Pengamatan dilakukan di bawah sinar Ultra Violet (UV). Bakteri yang mengeluarkan warna hijau-kebiruan dan berpendar merupakan bakteri Pseudomonas dari golongan fluorescent. Pengujian ini bertujuan untuk membedakan bakteri Pseudomonas dengan bakteri yang lain.

Uji Pembusukan Kentang Bahan yang digunakan dalam pengujian ini adalah umbi kentang yang mentah. Alat-alat yang digunakan disterilisasi dengan alkohol 70% untuk mengurangi kontaminasi. Umbi kentang dikupas, dicuci dengan air bersih, dan diiris, selanjutnya irisan kentang tersebut diletakkan di dalam cawan steril yang telah dialasi dengan kertas saring yang steril dan telah dilembabkan. Biakan bakteri digoreskan di atas permukaan kentang, sebagai kontrol irisan kentang tidak diberi biakan bakteri. Reaksi positif ditunjukan dengan adanya pembusukan pada kentang dan terdapat lendir setelah diinkubasi selama 24-48 jam.

Uji Oksidatif/Fermentatif Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui sifat aerob dan anaerob dari bakteri. Pengujian ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media oksidatif/fermentatif (pH 7.2). Masing-masing bakteri diinokulasi pada 2 tabung yang berisi media O/F dengan cara ditusukkan dan diberi glukosa 5% sebanyak 1 ml. Salah satu tabung reaksi diberi perlakuan dengan menambahkan parafin oil steril sebanyak 1 ml sedangkan tabung lainnya tidak ditambahkan parafin oil. Kontrol pada pengujian ini berupa media O/F yang tidak diberi perlakuan bakteri. Apabila terjadi perubahan warna menjadi kuning pada kedua media baik yang ditambahkan dan tidak ditambahkan parafin oil, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat fermentatif. Sebaliknya jika terjadi perubahan warna menjadi kuning hanya pada tabung yang tidak diberi parafin oil, hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat oksidatif.

Uji Tumbuh pada Media TZC Isolat bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada media TZC yang telah ditambahkan 2,3,5 Tryphenil Tetrazolium Chloride 1% (b/v) dengan cara menggoreskan bakteri pada media. Media ini bertujuan untuk mengetahui bakteri uji bersifat avirulen atau virulen.

Uji Tumbuh pada Media YDCA Pengujian ini bertujuan membedakan bakteri Erwinia sp. dan Pantoea sp. Isolat bakteri yang berumur 24 jam ditumbuhkan pada media YDCA dengan cara menggoreskan bakteri pada media. Pengamatan dilakukan setelah inkubasi 24-48 jam, dengan melihat warna koloni yang terbentuk yaitu warna putih atau kuning pada media YDCA. Apabila bakteri menunjukkan warna kuning maka reaksi tersebut adalah positif.

Uji Pembentukan Endospora Pengujian pembentukan endospora dilakukan pada isolat bakteri yang bersifat Gram positif baik anerob maupun aerob. Pengujian ini dilakukan untuk

mengetahui keberadaan endospora pada sel bakteri. Satu lup suspensi bakteri dicampurkan dengan akuades steril, ditetesikan pada gelas obyek dan dikeringanginkan, lalu ditetesi dengan malachite green 5% dan didiamkan selama 10 menit hingga mengering. Gelas obyek tersebut dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan kembali, selanjutnya diteteskan larutan safranin 0,5% diamkan selama 15 detik, lalu dibilas dengan air dan dikeringanginkan di atas bunsen. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop cahaya, sel bakteri terlihat berwarna merah. Identifikasi Cendawan Identifikasi cendawan dilakukan dengan mengambil cendawan yang tumbuh pada media PDA hasil isolasi atau cendawan yang diperoleh langsung pada buah pepaya yang bergejala. Cendawan yang telah diperoleh dibuat preparat slide pada gelas obyek. Identifikasi cendawan dilakukan dengan pengamatan di bawah mikroskop cahaya dan berdasarkan kunci identifikasi yang dikemukakan oleh Watanabe (1993) dan Domsch et al. (1993).